王 哲，賁亞琍

（江漢大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430056）

0 引言

氯離子通道蛋白是一種鑲嵌在細(xì)胞膜上，幫助氯離子跨越非極性細(xì)胞膜的通道蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，氯離子通道蛋白主要分為兩類(lèi)：一類(lèi)是僅傳輸氯離子的通道蛋白（channel），利用細(xì)胞膜內(nèi)外的氯離子濃度調(diào)控氯離子在通道內(nèi)的傳輸，如ClC-1和ClC-2等；另一種是氯離子/質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)體（transporter），可以傳輸氯離子和質(zhì)子，它們以2∶1的比例同時(shí)反向輸運(yùn)，如ClC-3、ClC-4和EcClC等。2002年，MACKINNON小組用X射線(xiàn)衍射的方法解析了大腸桿菌（Escherichia coli）體內(nèi)的一種氯離子通道蛋白（Ec-ClC）的三維晶體結(jié)構(gòu)（PDB ID：1OTS）［1］，這使得理論研究者通過(guò)理論計(jì)算的方法來(lái)研究氯離子通道的結(jié)構(gòu)和傳輸機(jī)制成為可能。三維晶體結(jié)構(gòu)顯示EcClC通道蛋白是一個(gè)二聚體，由兩個(gè)結(jié)構(gòu)相似的單體構(gòu)成，分別稱(chēng)為A鏈和B鏈。A鏈和B鏈分別具有獨(dú)立傳輸氯離子的功能。如圖1所示，A鏈用白色螺旋表示，B鏈用黃色螺旋表示，兩條黑色曲線(xiàn)分別表示氯離子和質(zhì)子的傳輸通道，每個(gè)單體中結(jié)合有兩個(gè)氯離子，用綠色球體表示，其中E148、Y445、E203殘基被認(rèn)為是對(duì)氯離子和質(zhì)子傳輸起重要作用的殘基［2-3］。

圖1 EcClC通道蛋白結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Structure representation of EcCIC channel

一般認(rèn)為，組成氯離子通道的兩個(gè)單體A鏈和B鏈分別具有獨(dú)立傳輸氯離子和質(zhì)子的能力［4］，這一推論在2010年通過(guò)MILLER團(tuán)隊(duì)所做的一系列實(shí)驗(yàn)所證實(shí)。他們將EcClC蛋白兩個(gè)單體A鏈和B鏈接觸面上的兩個(gè)體積較小的非極性殘基異亮氨酸（I201和I422）變異為體積較大的芳香環(huán)殘基色氨酸（W201和W422），以下簡(jiǎn)稱(chēng)WW變異，得到了完整蛋白質(zhì)EcClC二聚體的分離過(guò)程，并成功解析到EcClC單體的晶體結(jié)構(gòu)（PDB ID：3NMO）［5］。雖然實(shí)驗(yàn)成功分離二聚體，但變異殘基對(duì)二聚體的具體影響及二聚體分離的微觀(guān)過(guò)程不清楚，筆者將EcClC蛋白質(zhì)進(jìn)行WW變異，在江漢大學(xué)HPC集群上進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬，通過(guò)觀(guān)察整個(gè)二聚體分離的微觀(guān)過(guò)程，分析變異殘基對(duì)二聚體的影響。

1 模擬方法

1.1 構(gòu)建完整的EcClC跨膜系統(tǒng)

從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（PDB）中找到EcClC通道的晶體結(jié)構(gòu)（PDB ID：1OTS）作為初始結(jié)構(gòu)，然后通過(guò)VMD軟件將通道蛋白嵌套到選用的POPC（1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3 phosphocholine）細(xì)胞膜，以此來(lái)模擬生物細(xì)胞膜，再在細(xì)胞膜內(nèi)外加上10 ?的NaCl溶液分子層用以模擬細(xì)胞內(nèi)外溶液。最終構(gòu)建EcClC通道-細(xì)胞膜-溶液系統(tǒng)。蛋白質(zhì)、細(xì)胞膜、水和離子所選用的力場(chǎng)都是CHARMM27力場(chǎng)［6］。

通過(guò)能量最小化5 000步、動(dòng)力學(xué)平衡模擬27.5 ns，得到了EcClC通道-細(xì)胞膜-溶液系統(tǒng)的平衡結(jié)構(gòu)。圖2為分子動(dòng)力學(xué)模擬過(guò)程中EcClC通道蛋白主鏈的均方根偏差（root-mean-square error，RMSD）隨時(shí)間的變化情況［7-8］。由圖2可知，在15 ns以后，整個(gè)EcClC通道-細(xì)胞膜-溶液系統(tǒng)就已經(jīng)達(dá)到了熱力學(xué)平衡態(tài)，在此結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上得到的結(jié)果是可信的。

圖2 EcClC通道蛋白主鏈的均方根偏差（RMSD）隨時(shí)間的變化Fig.2 RMSD deviations from main chain of EcClC channel as function of simulation time

1.2 構(gòu)建鏈間界面殘基變異的EcClC跨膜系統(tǒng)

以平衡模擬了27.5 ns的EcClC通道跨膜結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，通過(guò)VMD的PSFGEN模塊，將A、B兩鏈界面上的異亮氨酸（I201和I422）變異為色氨酸（W201和W422），制備出WW變異型EcClC通道結(jié)構(gòu)［7］，然后將WW變異的EcClC通道鑲嵌在POPC細(xì)胞膜中，在細(xì)胞膜上下分別加入10 ?的NaCl溶液分子層用以模擬細(xì)胞內(nèi)外溶液，最終得到WW變異EcClC通道-細(xì)胞膜-溶液系統(tǒng)。

1.3 模擬鏈間界面殘基變異的EcClC二聚體分離方法

為更快得到WW變異蛋白的平衡結(jié)構(gòu)，將變異后的結(jié)構(gòu)通過(guò)兩個(gè)階段進(jìn)行模擬。第一階段，待分離階段，固定WW變異后的整個(gè)EcClC蛋白，僅對(duì)細(xì)胞膜和膜內(nèi)外溶液進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬2 ns，使變異的蛋白質(zhì)和細(xì)胞膜、溶液能夠較好接觸；然后固定變異殘基15 ?范圍以外的蛋白質(zhì)，僅對(duì)WW變異殘基周?chē)?5 ?以?xún)?nèi)的蛋白質(zhì)作能量最小化5 000步和4 ns的分子動(dòng)力學(xué)模擬。經(jīng)過(guò)第一階段后，WW變異的EcClC跨膜系統(tǒng)的各個(gè)部分達(dá)到相對(duì)穩(wěn)定，然后進(jìn)入第二階段分離階段，讓所有原子都不固定，作整個(gè)WW變異EcClC通道-細(xì)胞膜-溶液系統(tǒng)的分子動(dòng)力學(xué)模擬，在模擬過(guò)程中，二聚體逐漸分離成單體。在分離階段，進(jìn)行～24 ns的分子動(dòng)力學(xué)模擬，并在此分離過(guò)程中計(jì)算兩個(gè)單體接觸面積、氫鍵結(jié)合個(gè)數(shù)、范德瓦爾斯勢(shì)和靜電勢(shì)隨時(shí)間的變化，以此從原子層面觀(guān)察二聚體的分離過(guò)程中，EcClC通道蛋白內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化。

2 結(jié)果分析

2.1 計(jì)算二聚體和單體的溶液可接觸面積

根據(jù)模擬結(jié)果，A鏈和B鏈主要通過(guò)A、B鏈內(nèi)的4組蛋白質(zhì)螺旋相互接觸，其中A鏈內(nèi)的4組螺旋為L(zhǎng)194～I(xiàn)201、I215～I(xiàn)227、L406～L413、I422～L434（見(jiàn)圖3）。這4組螺旋中，共有42個(gè)蛋白質(zhì)殘基，其中35個(gè)殘基是非極性殘基，占比83.3%；1個(gè)殘基為帶電殘基，占比2.4%；6個(gè)極性殘基，占比14.3%。83.3%的非極性殘基起到了很強(qiáng)烈的疏水作用，而這一疏水作用是A鏈和B鏈共同組成二聚體的主要作用。兩單體接觸面上4個(gè)螺旋的I、L殘基如果變異為較大的W殘基就可加速二聚體分離。

圖3 兩單體接觸面上4個(gè)螺旋的I、L殘基Fig.3 I,L residues on four helixes from contact surface

通過(guò)VMD視圖軟件，畫(huà)出EcClC蛋白A鏈和B鏈初始時(shí)刻t=0 ns和t=22 ns的接觸面，如圖4所示，綠色表示蛋白質(zhì)A鏈，粉色表示蛋白質(zhì)B鏈，灰色表示蛋白質(zhì)臨近的細(xì)胞膜分子，黃色表示兩個(gè)變異殘基W201、W422，A鏈和B鏈的接觸面用黑線(xiàn)勾勒出來(lái)。其中，圖4（a）為t=0時(shí)刻的蛋白質(zhì)A鏈表面的A鏈、B鏈接觸面積，圖4（b）為t=0時(shí)刻的蛋白質(zhì)B鏈表面的A鏈、B鏈接觸面積，圖4（c）和圖4（d）為t=22 ns時(shí)刻的A鏈、B鏈相互接觸面積。由圖4可知，相比于t=0 ns時(shí)刻的A鏈、B鏈接觸面積，EcClC在t=22 ns時(shí)刻A鏈、B鏈接觸面積明顯減少。

根據(jù)接觸面的宏觀(guān)變化計(jì)算了A鏈和B鏈的具體接觸面積隨時(shí)間的變化，通過(guò)VMD軟件計(jì)算溶液可接觸面積（solvent-accessible surface area，SASA）。溶液可接觸面積是用一個(gè)半徑為1.4 ?的小球表示水分子，在蛋白質(zhì)表面滾動(dòng)，此小球中心滾過(guò)的面積，就是溶液可以接觸到的蛋白質(zhì)的表面積。

圖4 EcClC蛋白A鏈和B鏈t=0 ns和t=22 ns時(shí)的接觸面積Fig.4 Contact area of chain A and chain B of EcClC att=0 ns andt=22 ns

分別計(jì)算A鏈單體和B鏈單體的溶液可接觸面積SASAchainA和SASAchainB，以及A鏈、B鏈復(fù)合體的溶液可接觸面積SASAchainAB，由此可以得到A、B鏈的接觸面積。

根據(jù)（1）式得到的結(jié)果如圖5所示，其中黑線(xiàn)為原始數(shù)據(jù)，紅線(xiàn)為溶液可接觸面積的平均變化趨勢(shì)?？梢钥闯鯳W變異的A鏈、B鏈接觸面積隨著模擬時(shí)間的增加而明顯減少，說(shuō)明二聚體已經(jīng)開(kāi)始逐漸分離，且WW變異能夠起到分離的作用。

圖5 WW變異的A鏈、B鏈接觸面積隨模擬時(shí)間的變化Fig.5 Contact area deviations of chain A and chain B as function of simulation time in WW system

2.2 A鏈、B鏈之間的氫鍵個(gè)數(shù)

隨著模擬時(shí)間的增加，WW變異使A鏈、B鏈逐漸分離，統(tǒng)計(jì)它們之間的氫鍵鏈接，觀(guān)察氫鍵個(gè)數(shù)的變化情況。氫鍵的長(zhǎng)度定義在3.5 ?范圍以?xún)?nèi)，角度在60 rad范圍以?xún)?nèi)，如圖6所示，其中黑線(xiàn)為原始數(shù)據(jù)，紅線(xiàn)為平均氫鍵個(gè)數(shù)。由圖6可知,在模擬的前5 ns，氫鍵個(gè)數(shù)隨著模擬時(shí)間的增加有明顯的減少趨勢(shì)；而在5 ns之后，氫鍵個(gè)數(shù)的變化有些平穩(wěn)，不過(guò)總體還是有下降趨勢(shì)。氫鍵個(gè)數(shù)的降低說(shuō)明A鏈和B鏈之間的連接正在緩慢減弱。

圖6 A鏈、B鏈之間氫鍵個(gè)數(shù)隨著模擬時(shí)間的變化Fig.6 The number of Hbond deviations as function of simulation time

2.3 A鏈、B鏈之間的范德瓦爾斯勢(shì)能和靜電勢(shì)

在NAMD分子動(dòng)力學(xué)模擬中，共有5個(gè)勢(shì)能函數(shù)表示每個(gè)原子所受到的其他所有原子的勢(shì)能大小，這5個(gè)勢(shì)能分別為范德瓦爾斯勢(shì)、靜電勢(shì)、鍵長(zhǎng)伸縮勢(shì)、鍵角彎曲勢(shì)、二面角扭轉(zhuǎn)勢(shì)［9］，其中鍵長(zhǎng)伸縮勢(shì)、鍵角彎曲勢(shì)、二面角扭轉(zhuǎn)勢(shì)表示的是成化學(xué)鍵的原子之間的相互左右，只有范德瓦爾斯勢(shì)和靜電勢(shì)表示非成鍵勢(shì)能，而氯離子通道蛋白中A鏈、B鏈之間沒(méi)有原子形成共價(jià)鍵，因此鍵長(zhǎng)伸縮勢(shì)、鍵角彎曲勢(shì)、二面角扭轉(zhuǎn)勢(shì)均為0，筆者只計(jì)算了A鏈、B鏈之間的范德瓦爾斯勢(shì)和靜電勢(shì)隨著模擬時(shí)間的變化情況，如圖7所示，其中黑線(xiàn)為原始數(shù)據(jù)，紅線(xiàn)為平均勢(shì)能。圖7（a）表示范德瓦爾斯勢(shì)隨模擬時(shí)間的變化情況，可以看出，范德瓦爾斯勢(shì)有明顯的上升趨勢(shì)，說(shuō)明二聚體分離會(huì)使A鏈、B鏈之間的范德瓦爾斯勢(shì)升高，勢(shì)能上升說(shuō)明二聚體相互接觸的勢(shì)阱升高，可進(jìn)一步促進(jìn)二聚體分離。圖7（b）表示靜電勢(shì)隨模擬時(shí)間的變化情況，靜電勢(shì)在t=13 ns之前有上升與下降的波動(dòng)，可能是整個(gè)系統(tǒng)還沒(méi)有達(dá)到平衡的結(jié)果，而在t=13 ns之后，靜電勢(shì)能的上升趨勢(shì)不太明顯，說(shuō)明用靜電勢(shì)表示二聚體分離程度并不適合。

圖7 A鏈、B鏈間范德瓦爾斯勢(shì)和靜電勢(shì)隨模擬時(shí)間的變化Fig.7 Potential deviations of vdw and electricity between chain A and chain B as function of simulation time

3 結(jié)語(yǔ)

蛋白質(zhì)EcClC為一個(gè)二聚體，由兩個(gè)結(jié)構(gòu)相似的單體A鏈和B鏈組成，實(shí)驗(yàn)成功分離二聚體，但變異殘基對(duì)二聚體的具體影響及二聚體分離的微觀(guān)過(guò)程均不清楚。為了模擬二聚體蛋白質(zhì)分離的微觀(guān)機(jī)制，首先構(gòu)建了EcClC通道-細(xì)胞膜-溶液系統(tǒng)的原始系統(tǒng)，并模擬了27.5 ns，使整個(gè)系統(tǒng)達(dá)到平衡，在此平衡結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，將A鏈、B鏈接觸面上的I201和I422殘基變異為W201和W422，構(gòu)建了WW變異的EcClC通道-細(xì)胞膜-溶液系統(tǒng)，模擬變異后的EcClC通道二聚體分離的情況。在分離階段，分別計(jì)算了A鏈、B鏈的相互接觸面積，A鏈、B鏈相連的氫鍵個(gè)數(shù)，范德瓦爾斯勢(shì)和靜電勢(shì)隨時(shí)間的變化，這些參數(shù)隨著二聚體的分離均有不同程度的變化。其中A鏈、B鏈接觸面面積隨著模擬時(shí)間的增加而減少，且效果最為明顯，若以后計(jì)算EcClC其他殘基變異使二聚體分離的情況，可以首選A鏈、B鏈接觸面面積作為二聚體分離的指標(biāo)。且該研究為下一步從理論上研究二聚體分離后，每個(gè)單體內(nèi)氯離子和質(zhì)子的傳輸特點(diǎn)及研究?jī)蓚€(gè)單體傳輸氯離子和質(zhì)子過(guò)程中有無(wú)相互影響作準(zhǔn)備。

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