柱前衍生-高效液相色譜法測定甜蜜素的實驗研究

◎ 習(xí) 娟

（內(nèi)蒙古自治區(qū)食品藥品審評查驗中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020）

關(guān)于甜蜜素的檢測方法，國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法有氣相色譜法、比色法和薄層層析法[1-2]。但這些方法最低檢測限均高于歐盟和日本的標(biāo)準(zhǔn)，導(dǎo)致這樣一種現(xiàn)象出現(xiàn)，即某些產(chǎn)品在國內(nèi)未檢測出甜蜜素，而在國外會被檢測出來，這就要求我國的檢測技術(shù)必須與國際接軌。筆者查閱大量國內(nèi)外資料發(fā)現(xiàn)，柱前衍生-高效液相色譜法是測定甜蜜素較好的方法[3]，本文通過實驗研究證實其應(yīng)用價值。

1 材料及方法

1.1 實驗材料

含有甜蜜素的碳酸飲料、果汁飲料、蔬菜汁、乳飲料、植物蛋白飲料，來源于市場。

1.2 試驗方法

本試驗方法是將甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)過衍生化反應(yīng)后，用液相色譜檢測甜蜜素。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制

稱取甜蜜素0.100 0 g，用超純水溶解并轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中定容，制成濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液待用。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

將已配制好的1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，吸取0、1、2、4、5 mL分別移入500 mL容量瓶中以超純水定容，制成標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0、2.0、4.0、8.0、10.0 mg/L。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將已經(jīng)配制好的標(biāo)準(zhǔn)溶液在已優(yōu)化好的條件下衍生，以優(yōu)化好的液相條件進行HPLC的測定，用標(biāo)準(zhǔn)曲線確定峰面積S與溶液濃度c的關(guān)系，計算線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.4 方法精密度的測定

將0.40 mg/mL濃度標(biāo)樣通過衍生化條件處理，先后進樣6針進行精密度的分析。

1.5 最低檢出限的測定

將0.40 mg/mL濃度的標(biāo)樣分別稀釋10、100、1 000、10 000倍（濃度分別為0.040、0.004 0、0.000 4、0.000 040 mg/mL）后，測定信號值，采用3倍信噪比計算檢出限。

1.6 回收率和精密度測定

將碳酸飲料和含乳飲料中分別添加4.0 mg/mL濃度的標(biāo)樣在已優(yōu)化好的衍生條件和液相條件下進行測定樣品的回收率測定。在已優(yōu)化好的衍生條件和液相條件下，將碳酸飲料和含乳飲料分別重復(fù)測定11次，確定測定樣品的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，以此來確定精密度。

1.7 干擾試驗

為排除其他添加劑對方法的影響，在含有甜蜜素的標(biāo)準(zhǔn)溶液中加入安賽蜜、糖精鈉、山梨酸、苯甲酸、亞硫酸鈉后，用同樣的衍生方法以及液相條件檢測，確定此方法的抗干擾性[4]。

1.8 穩(wěn)定性試驗

將衍生物在室溫、4 ℃條件下，放置4、8、12、24、48 h，在已優(yōu)化好的液相條件下進行測定，確定衍生物的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及方法精密度的結(jié)果

在已優(yōu)化好的條件下進行不同濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，得到的濃度-峰面積曲線如圖1所示。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

由圖2可以看出，不同濃度的吸收峰重疊性很好，幾乎完全重合。同時，吸收峰的保留時間均是在合理范圍內(nèi)，保留時間依次是6.523、6.536、6.516、6.535、6.522 min。此衍生物的線性方程為y=10 195x+9 548.6，相關(guān)性為0.999 8，由此可見線性相關(guān)很好，甜蜜素的最低檢出限為40 ng/mL。

圖2 不同濃度甜蜜素的譜圖

加入0.4 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生化后進行方法精密度的測定，進樣6針，精密度好，標(biāo)準(zhǔn)偏差小于0.001，見表1。

表1 方法精密度實驗結(jié)果表

2.2 干擾實驗結(jié)果

在上述已優(yōu)化好的條件下，通過將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中添加安賽蜜、糖精鈉、山梨酸、苯甲酸、亞硫酸鈉后進行衍生，測定添加物質(zhì)對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的干擾試驗。結(jié)果表明苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、安賽蜜在所選色譜條件下不出峰，而亞硫酸鈉出峰時間在甜蜜素的后面，不干擾測定。

2.3 回收率及精密度結(jié)果

在上述已優(yōu)化好的條件下，向樣品中添加0.4 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液進行衍生化反應(yīng)，過濾，進行液相回收率的測定，結(jié)果見表2，回收率均大于95%，回收率相對較高，所以此曲線適用于飲料的甜蜜素含量測定實驗。

表2 回收率實驗結(jié)果表

將碳酸飲料和含乳飲料的樣品進樣11次測定精密度，結(jié)果見表3，用高效液相色譜測定飲料中的甜蜜素精密度很高，達到99%以上。

表3 精密度實驗結(jié)果表

2.4 樣品中甜蜜素的測定結(jié)果

由表4可以看出，碳酸飲料中的甜蜜素含量最高，果汁飲料其次，含乳飲料的含量最少并且未檢出樣品居多；圖3為測定的果汁飲料5#的甜蜜素譜圖。所以，就現(xiàn)代人們對于飲食健康安全的需求而言，可以選擇含乳飲料替代其他飲品。

表4 飲料中甜蜜素的測定結(jié)果表

圖3 測定甜蜜素樣品的譜圖

3 結(jié)論

（1）本試驗色譜最優(yōu)化條件為：乙腈與水的比例為75∶25，添加0.02 mol/L乙酸銨緩沖系作為流動相，在波長314 nm處、柱溫33 ℃、流量1.0 mL/ min、進樣量10 μL的條件下，對甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)品的衍生物進行測定效果最佳，精密度和回收率較高，且沒有其他同類樣品的干擾。

（2）本試驗對樣品前處理最優(yōu)化條件為：將樣品溶液用亞鐵氰化鉀-乙酸鉛等比例混合作為沉淀劑，離心取上清液10 mL，加入2mL 1∶1濃硫酸酸化后加5.0 mL濃度為50%的次氯酸鈉溶液衍生5 min，之后用5 mL正己烷、2 g氯化鈉進行萃取，取正己烷層加入10mL 10%碳酸氫鈉溶液，用0.22 μm的過濾膜過濾上樣，進行甜蜜素衍生物的測定。這種前處理方法消除了食品相關(guān)成分即食品基質(zhì)對衍生過程和檢測過程的干擾。

（3）本試驗對市售飲料甜蜜素含量進行測定，測定結(jié)果為在飲料類別中含乳飲料的甜蜜素含量最低，未檢出樣品個數(shù)最多，但所有樣品均符合國家標(biāo)準(zhǔn)的限值，均屬于安全食品。

（4）本試驗所采用方法比起國家標(biāo)準(zhǔn)所采用方法成本相對較低、操作簡單、檢測效率高且適用于基層實驗室的日常檢測分析，其準(zhǔn)確度和精密度也優(yōu)于國標(biāo)方法，并且比國家標(biāo)準(zhǔn)方法更適用于蛋白含量高的產(chǎn)品中甜蜜素的測定。

[1]張秀堯.反相高效液相色譜法測定食品中甜蜜素[J].理化檢驗-化學(xué)分冊，2000，36（10）：451-452.

[2]劉艷和，馬公強.高效液相色譜法測定食品中甜蜜素[J].中國公共衛(wèi)生，1998，14（3）：169.

[3]劉鵬春，祁廣建.環(huán)境與健康雜志[J].食品衛(wèi)生理化檢驗，1996（8）：31.

[4]李智紅，尹艷春.反相離子對高效液相色譜法快速分離和定量測定食品中的甜蜜素[J].色譜，1999（3）：278-279.