李閃閃，張艷芳，謝豐華，李冬秀，黃 湘(.南方醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣州 50000；.南方醫(yī)科大學(xué)附屬中山博愛醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心，廣東中山 58400)

染色體病是染色體異常引起的遺傳性疾病，可致先天性多發(fā)畸形，智力及身體發(fā)育障礙等嚴重臨床癥狀，我國每年約有3.6萬新生兒染色體異常[1，2]。故核型分析、染色體微陣列分析(chromosome microarray，CMA)、細菌人工染色體標(biāo)記-磁珠鑒別/分離技術(shù)(BAC-on-Beads ，BOBS)、熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)、多重連接介導(dǎo)的探針擴增技術(shù)(multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)、全基因組測序和無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(non-invasive prenatal testing，NIPT)等染色體檢測技術(shù)飛速發(fā)展并應(yīng)用于臨床，但BOBS，F(xiàn)ISH，MLPA，NIPT和全基因組測序因為方法學(xué)和費用的限制而應(yīng)用受限，作為染色體異常檢測金標(biāo)準的核型分析和近年新興的高通量檢測策略CMA，成為廣泛使用的產(chǎn)前診斷項目[3]?，F(xiàn)為明確CMA和核型分析診斷染色體異常的臨床價值，基于前人研究結(jié)果，本研究擬對兩者檢出的胎兒染色體情況進行系統(tǒng)分析，望能指導(dǎo)臨床醫(yī)生合理使用產(chǎn)前診斷項目。

1.材料與方法

1.1 研究對象 選取2017年5～11月共347例在中山市博愛醫(yī)院進行產(chǎn)前咨詢并進行CMA和核型分析的孕婦為研究對象。研究對象應(yīng)至少滿足以下任意一個產(chǎn)前診斷指征：①超聲異常：包括羊水過多或過少，胎兒發(fā)育異?；蚩梢苫蔚?；②高齡(≥35歲)；③不良妊娠史或夫妻任一方有遺傳病家族史；④孕早期有不良接觸史；⑤產(chǎn)前母血清篩查高風(fēng)險或無創(chuàng)性產(chǎn)前檢測(NIPT)高或臨界風(fēng)險。其中，孕婦年齡17～46歲，平均年齡32.29±6.089歲；孕周12～35周，平均孕周21.74±5.188周；胎兒性別：男：52.45%(182/347)，女：47.55%(165/347)。本研究獲倫理委員會批準并簽署患者知情同意書。

1.2 試劑和儀器

1.2.1 核型分析：培養(yǎng)基、秋水仙素、植物血細胞凝集素、KCl溶液、胰蛋白酶液、冰乙酸和甲醇、Giemsa染色液、NaOH溶液、生理鹽水、細胞培養(yǎng)箱，GenetixGSL-120全自動染色體分析儀。

1.2.2 CMA：微陣列芯片(Affymetrix，CytoScan 750K)，DNA提取試劑盒(QIAGEN，QIAamp DNA Blood Mini Kit)，Agilent Genomic WorkbenchLite Edition7.0.4.0軟件分析結(jié)果，在OMIM，UCSC，DECIPHER，ISCA，DGV數(shù)據(jù)庫中查詢數(shù)據(jù)。

1.3 方法

1.3.1 有創(chuàng)操作獲取胎兒樣本：分別于孕8～11周，孕16～22周，孕18～24周時采集絨毛、羊水、臍靜脈血。對獲取的胎兒細胞進行CMA和培養(yǎng)后染色體核型分析。

1.3.2 核型分析：胎兒樣本在體外適宜條件下培養(yǎng)，經(jīng)細胞收獲，制片，消化，G顯帶染色，掃描后進行分析并報告[4]。

1.3.3 CMA檢測：本團隊進行有創(chuàng)操作獲取胎兒樣本，CMA檢測及報告由合作單位廣東省婦幼保健院進行[5]。

2結(jié)果

2.1 整體資料 本研究參與者349例，染色體檢測成功率：CMA：100%(349/349)，核型分析：99.43%(347/349)，2例CMA檢測結(jié)果正常但核型培養(yǎng)失敗，故后續(xù)分析中未納入統(tǒng)計。孕婦高齡(≥35歲)：37.20%(129/347)；標(biāo)本類型：羊水、臍血、絨毛分別為64.80%，34.30%，0.90%；CMA和核型分析結(jié)果相符率89.63%(311/347)，兩者之一或均異常14.41%(50/347)，CMA和核型分析的染色體異常檢出率分別為10.95%(38/347)和9.22%(32/347)；對CMA和核型分析檢出染色體異常進行配對四格表資料的差異性比較顯示P=0.362，兩者的染色體異常檢出率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 CMA和核型分析檢出染色體異常情況

2.2.1 CMA及核型分析結(jié)果：見表1。均異常20例，其中，相符14例，不符6例。分析CMA和核型分析的染色體均異常結(jié)果相符14例表明，CMA和核型分析均能檢出染色體數(shù)目異常及大片段的重復(fù)和缺失，如案例5中≥6.9Mb的缺失；6例兩者結(jié)果不符表明，CMA檢出染色體拷貝數(shù)變異(copy number variations，CNVs)的敏感度更高，核型分析能更敏感地檢出染色體倒位和嵌合，如案例9～11，CMA檢出染色體非整倍體異常和核型未檢出的8q21.2q21.3約1.5Mb的缺失，但未檢出核型分析檢出的染色體倒位；案例12，CMA檢出約19.3Mb的12q23.3q24.31的雜合性丟失，核型分析檢出19h+；案例13，CMA檢出10q23.33q26.3約30.6Mb的嵌合重復(fù)，核型分析檢出9號染色體倒位和性染色體嵌合，兩者檢出的嵌合染色體和位點不同。

表1 核型和CMA檢測結(jié)果均異常結(jié)果(n=20)

2.2.2 CMA異常但核型分析正常：見表2。分析18例CMA異常但核型分析正常表明CMA能敏感地檢出CNVs，且部分微小CNVs具有明確的致病性。如表2中，案例3的244Kb重復(fù)經(jīng)查詢數(shù)據(jù)庫可知會導(dǎo)致Xq28微重復(fù)綜合征；對染色體雜合性丟失，無論片段大小，核型分析均未檢出。如案例11～15，其中案例11的7p12.3q11.22雜合性丟失明確可致Russell-Silver綜合征；另外，7例CMA結(jié)果異常可致患隱性遺傳病風(fēng)險增加或致病性尚不明確，如案例12和15中高至18Mb的2q14.3q22.3雜合性丟失和低至1.15Mb的7q36.1q36.2重復(fù)。

表2 CMA異常而核型分析正常結(jié)果(n=18)

2.2.3 核型分析異常但CMA結(jié)果正常：見表3。

表3 核型分析異常而CMA正常(n=12)

本研究中共12例核型分析異常而CMA檢測結(jié)果均正常，包括染色體易位、倒位、嵌合、多態(tài)、衍生染色體、異染色質(zhì)，表明核型分析在檢出這些染色體異常方面較CMA更具優(yōu)越性。

3討論為明確CMA和核型分析對診斷染色體異常的臨床價值，本研究系統(tǒng)分析了中山市同時進行核型分析和CMA產(chǎn)前診斷的347例胎兒檢測結(jié)果，結(jié)果顯示，CMA和核型分析對可致病染色體異常的檢出率分別為10.95%，9.22%，表明有產(chǎn)前診斷指征的孕婦進行有創(chuàng)CMA和核型分析，能幫助臨床醫(yī)生及時發(fā)現(xiàn)胎兒染色體異常并采取針對措施，減少新生兒出生缺陷。

分析表明，CMA和核型分析均能檢出染色體數(shù)目異常及大片段的不平衡重排，兩者對染色體異常的檢出具有互補性，CMA能檢出核型分析未檢出的微小CNVs，核型分析能檢出CMA未檢出的染色體平衡易位。兩者均檢出的染色體異常情況，見表1，均提示CMA和核型分析在檢出染色體非整倍體和大片段CNVs上具有同等效力。核型分析能更敏感地檢出如表3中的染色體易位、倒位等，但不能檢出小于5～10Mb的染色體異常，檢測敏感度低，如表2中案例10，CMA檢出約6.95Mb的13q21.2q21.33缺失，可能導(dǎo)致較輕的臨床效應(yīng)，但核型未檢出此異常；CMA的分辨率和敏感度高，表2中案例3，CMA可檢出低至244Kb的微重復(fù)，會導(dǎo)致Xq28微重復(fù)綜合征(DECIPHER)，引起男性患者X連鎖智力低下(PMID：20004760)；其次，CMA能區(qū)別染色體異常是否具有臨床意義，如表1案例8中，核型分析檢出7p12q14和8q1的缺失，CMA認為8q1的缺失為無義缺失，故僅報告7p14.3p12.3的缺失，表明CMA具有鑒別核型分析檢出的染色體無義突變的能力，能減少因檢出無義突變對臨床和準父母造成的困擾和壓力；在分析表3中核型異常但CMA結(jié)果正常案例時發(fā)現(xiàn)，CMA不能檢出染色體易位、倒位、多態(tài)、衍生染色體、異染色質(zhì)，檢出染色體嵌合的能力低于核型分析，表1中案例13兩者檢出染色體的不同異常也驗證了這一點，核型分析檢出9號染色體倒位和性染色體嵌合，而CMA檢出10q23.33-qter約39.6Mb的嵌合重復(fù)，可能是嵌合比例低導(dǎo)致CMA未檢出核型分析檢出的嵌合，染色體倒位和10q23.33q26.3的嵌合因CMA和核型分析方法學(xué)限制而未檢出；表3中案例1，孕婦雙胎妊娠，有不良妊娠史，核型分析顯示兩胎兒均為inv(9)(p11q13)，家系研究表明該遺傳來自父親，而CMA未檢出此染色體倒位。這與以往關(guān)于兩者的研究相符[6～8]。

產(chǎn)前診斷技術(shù)存在自身的缺陷。核型分析依賴于工作人員的經(jīng)驗，且存在細胞培養(yǎng)失敗，培養(yǎng)時間和檢測周期長等缺點，即使檢出染色體異常，也會使部分胎兒錯過最佳處理時間，導(dǎo)致患者失去選擇妊娠的權(quán)利，延遲繼續(xù)妊娠的染色體異常胎兒的孕期監(jiān)護和出生后處理等；CMA也存在一些缺陷，如CMA檢測敏感度的提高會增加臨床意義不明的CNVs的檢出率，這些CNVs對胎兒的影響尚不確定，學(xué)界對CNVs的認知存在局限性等，增加準父母的焦慮，甚至造成健康胎兒妊娠的終止。因此診斷實驗室應(yīng)嚴格遵循CMA報告原則發(fā)放報告，臨床醫(yī)生應(yīng)明確CMA和核型分析的優(yōu)缺點，綜合分析染色體異常的各種影響因素，將CMA和核型分析有機結(jié)合應(yīng)用于產(chǎn)前診斷，并做好產(chǎn)前咨詢工作，盡量使高危孕婦接受有創(chuàng)產(chǎn)前診斷，提高胎兒染色體異常檢出率，避免染色體異常漏診和診斷延遲造成的新生兒缺陷，減緩準父母的心理壓力[9]；另外，科研工作者應(yīng)加強對染色體異常機制，臨床致病性及治療的研究，完善相關(guān)遺傳數(shù)據(jù)庫，使科研成果更好的轉(zhuǎn)化應(yīng)用于臨床。

綜上所述，CMA和核型分析在檢出染色體異常中各有優(yōu)勢，CMA能更敏感地檢出染色體微重復(fù)和微缺失，核型分析對檢出易位、倒位等更具優(yōu)越性。這要求產(chǎn)前診斷醫(yī)生明確掌握CMA和核型分析對染色體異常的檢出和適用情況，合理地為孕婦開展相應(yīng)的產(chǎn)前檢測項目并根據(jù)檢測結(jié)果采取相應(yīng)的針對措施，從而提高胎兒染色體病檢出率，減少新生兒出生缺陷，提高新生兒愈后和生存質(zhì)量，減輕患兒本人、家庭和社會的負擔(dān)。

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