倪 琳 ，朱 宇 ，魏學(xué)冰 ，張曉萍 ，馬 肖

（1.甘肅省藥品檢驗(yàn)研究院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省食品檢驗(yàn)研究院，甘肅 蘭州 730030；3.蘭州市食品藥品檢驗(yàn)研究所，甘肅 蘭州 730050；4.甘肅省第二人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730070）

前列泰膠囊由益母草、萹蓄、紅花、油菜蜂花粉、知母（鹽炒）、黃柏（鹽炒）6味中藥材組成，具有清熱利濕、活血散結(jié)的功效，用于慢性前列腺炎（濕熱挾瘀證）的治療，現(xiàn)執(zhí)行國(guó)家藥品注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)YBZ15942005，包括顯微鑒別、黃柏和知母的薄層色譜鑒別以及采用薄層色譜掃描法測(cè)定鹽酸水蘇堿含量3項(xiàng)。為了更好地控制藥品質(zhì)量，有必要對(duì)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行修訂。本研究采用薄層色譜法（TLC）對(duì)制劑中黃柏的薄層色譜方法進(jìn)行修訂，增加了萹蓄、紅花的薄層色譜鑒別，將鹽酸水蘇堿的薄層掃描法修訂為高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定益母草中鹽酸水蘇堿含量，為提高前列泰膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

島津LC-20A高效液相色譜儀系列：在線脫氣機(jī)，四元泵，Lcsolution工作站，柱溫箱，ELSD-Ⅱ蒸發(fā)光散射器；KQ3200DB型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，200 W，40 kHz）；Mettler AE240電子天平（北京賽多利斯儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

前列泰膠囊（河西制藥有限責(zé)任公司，批號(hào)：20110907、20110908、20110910），鹽酸水蘇堿對(duì)照品（批號(hào)：110712-200508），鹽酸小檗堿對(duì)照品（批號(hào)：110713-200609），萹蓄對(duì)照品（批號(hào)：110861-200808），紅花對(duì)照品（批號(hào) 121051-200503）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。硅膠G薄層板（青島海洋化工廠分廠），乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

2.1.1 黃柏 取本品內(nèi)容物1 g，加乙醇30 ml，超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液水浴蒸干，加甲醇5 ml溶解，作為供試品溶液。取鹽酸小檗堿對(duì)照品，加甲醇制成每1 ml含0.1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。按前列泰膠囊處方和工藝制備黃柏陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液。按TLC法[1]試驗(yàn)方法，取上述3種溶液各5 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯- 乙酸乙酯 - 甲醇 - 異丙醇 - 濃氨水（6∶6∶3∶3∶1，V/V/V/V/V）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外燈（365 nm）下檢視。結(jié)果顯示，供試品在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾，見(jiàn)圖1。

圖1 黃柏薄層色譜圖

2.1.2 萹蓄 取本品內(nèi)容物2 g，加甲醇30 ml，超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液水浴蒸干，殘?jiān)铀?0 ml溶解，水液以氯仿提取兩次，每次15 ml，氯仿液棄去，水液加濃鹽酸1 ml、氯仿25 ml，水浴回流提取1 h，分取氯仿層，水浴蒸干，殘?jiān)蛹状? ml，作為供試品溶液。取萹蓄對(duì)照品，加甲醇制成每1 ml含0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。按前列泰膠囊處方和工藝制備萹蓄的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液。按TLC法[1]試驗(yàn)方法，取上述3種溶液各10 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠 G薄層板上，以甲苯 - 醋酸乙酯 - 甲酸（8∶3∶1，V/V/V）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以1%三氯化鋁乙醇溶液，置紫外燈（365 nm）下檢視。結(jié)果顯示，供試品在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾，見(jiàn)圖2。

2.1.3 紅花 取本品內(nèi)容物3 g，加甲醇30 ml，超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液水浴蒸干，殘?jiān)铀?5 ml溶解，以乙醚提取兩次，每次20 ml，棄去乙醚液，水液加水飽和的正丁醇提取兩次，每次20 ml，合并正丁醇液，水浴蒸干，殘?jiān)蛹状? ml作為供試品溶液。取紅花對(duì)照藥材2 g，加水100 ml煎煮1 h，用脫脂棉趁熱過(guò)濾，濾液濃縮至約15 ml，加乙醇使含醇量達(dá)50%，混合均勻，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?5 ml使溶解，以水飽和的正丁醇提取兩次，每次20 ml，合并正丁醇液，水浴蒸干，殘?jiān)蛹状? ml使溶解，制成對(duì)照藥材溶液。按前列泰膠囊處方和工藝制備紅花陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液。按TLC法[2]試驗(yàn)方法，取上述3種溶液各10 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-乙醚（3∶2，V/V）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外燈（365 nm）下檢視。結(jié)果顯示，供試品在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾，見(jiàn)圖3。

圖2 萹蓄薄層色譜圖

圖3 紅花薄層色譜圖

2.2 益母草中鹽酸水蘇堿含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 色譜柱選用Venusil HILIC柱（4.6 mm×250.0 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈 -0.2%冰醋酸（80∶20）；ELSD檢測(cè)器：空氣壓縮機(jī) 350 KPa，霧化室溫度：50℃，增益值為 2；柱溫 35℃，流速：1.0 ml/min，進(jìn)樣量：10 μl。在上述色譜條件下，理論板數(shù)以鹽酸水蘇堿峰計(jì)算，均不低于2 500。供試品中的鹽酸水蘇堿與其他雜質(zhì)峰均能很好分離（分離度＞1.5），見(jiàn)圖 4～6。

圖4 鹽酸水蘇堿對(duì)照品高效液相色譜圖

圖5 供試品高效液相色譜圖

圖6 陰性對(duì)照高效液相色譜圖

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 取鹽酸水蘇堿對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml含鹽酸水蘇堿對(duì)照品0.5 mg的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品內(nèi)容物約1.5 g，精密稱定，精密加 95%乙醇 50 ml，稱定重量，超聲處理（120 W，40 kHz）40 min，放冷，再稱定重量，用95%乙醇補(bǔ)足減失的重量，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液25 ml。加于中性氧化鋁-改性活性炭柱上（內(nèi)徑2.5 cm，中性氧化鋁，色譜純 100～200 目，3∶1），用 95%乙醇洗脫，收集洗脫液，水浴蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至10 ml容量瓶，定容至刻度，搖勻，即得。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取對(duì)照品溶液（鹽酸水蘇堿對(duì)照品 0.506 1 mg/ml）5、10、15、20、25、30 μl，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)定峰面積積分值，以對(duì)照品質(zhì)量濃度（x，μg/ml）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)（y），得到回歸方程：y=49 323x-76 699（r=0.999 5），鹽酸水蘇堿在 2.53～15.18 μg 有良好的線性關(guān)系。

2.2.5 專屬性試驗(yàn) 按處方比例及制備工藝，配制不含益母草的陰性樣品，并按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果本品在鹽酸水蘇堿對(duì)照品相應(yīng)位置無(wú)色譜峰出現(xiàn)，即本品陰性無(wú)干擾，見(jiàn)圖4～6。

2.2.6 儀器精密度試驗(yàn) 取前列泰膠囊（批號(hào)：20110907），按“2.2.3”項(xiàng)下方法提取，重復(fù)進(jìn)樣6次，結(jié)果鹽酸水蘇堿峰面積的RSD為0.62%，表明儀器精密度良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取前列泰膠囊（批號(hào)：20110907），按“2.2.3”項(xiàng)下方法提取供試品6份，分別測(cè)定每份的含量，鹽酸水蘇堿RSD為0.76%。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 采用加樣回收法，精密稱取已知鹽酸水蘇堿含量的供試品（批號(hào)：20110907）6份，每份約1.5 g，精密稱定，分別精密加入一定量的對(duì)照品溶液（鹽酸水蘇堿6.219 0 mg/g），用氮吹儀將溶媒吹干，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定供試品中鹽酸水蘇堿含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.7”項(xiàng)下樣品，分別在 0、2、4、6、8、10 h測(cè)定峰面積，鹽酸水蘇堿峰面積穩(wěn)定，RSD為0.37%，表明供試品溶液在室溫下放置10 h內(nèi)性質(zhì)基本穩(wěn)定。

2.2.10 樣品測(cè)定 取前列泰膠囊3批，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定鹽酸水蘇堿含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n=3）

3 討論

3.1 不同溶媒提取方法的比較

分別以95%乙醇、70%乙醇、甲醇超聲處理40 min提取前列泰膠囊（批號(hào)：20110907）中鹽酸水蘇堿。結(jié)果顯示，95%乙醇提取鹽酸水蘇堿6.219 0 mg/g，70%乙醇提取鹽酸水蘇堿5.978 4 mg/g，甲醇提取鹽酸水蘇堿5.764 3 mg/g，故選95%乙醇作為溶媒提取鹽酸水蘇堿。

3.2 不同提取時(shí)間的比較

分別以95%乙醇作為溶媒超聲處理30 min、40 min、1 h提取前列泰膠囊（批號(hào)：20110907）中鹽酸水蘇堿結(jié)果為：5.962 3 mg/g、6.219 0 mg/g、6.189 6 mg/g。故選擇 95%乙醇超聲處理40 min提取鹽酸水蘇堿。

3.3 流動(dòng)相的選擇

流動(dòng)相起初使用乙腈 - 水（80∶20）[2]，甲醇 - 水（78∶22）[3]，乙腈 -0.05 mmol/L 磷酸二氫鉀溶液 - 磷酸（10∶90∶0.02）[4]，采用乙腈-0.2%冰醋酸（80∶20）洗脫，鹽酸水蘇堿峰分離度較好、基線噪音小。經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，該方法線性、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、準(zhǔn)確度、耐用性均符合要求，可作為前列泰膠囊質(zhì)量控制的方法。