段汝清 ， 蘇宇杰 ， 王俊偉 ， 周 蓓 ， 楊嚴(yán)俊 *

（1.食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇無(wú)錫 214122；3.江蘇康德蛋業(yè)有限公司，江蘇 南通 226600）

蛋清蛋白作為一種功能性食品原料，被廣泛應(yīng)用于食品加工領(lǐng)域[1]。凝膠性是蛋清蛋白一項(xiàng)重要的功能性質(zhì)，多用于魚糜制品和肉制品中[2]。國(guó)內(nèi)外采用了多種方法對(duì)蛋清蛋白進(jìn)行改性以提高蛋清蛋白的凝膠性，降低生產(chǎn)成本，其中糖基化被證實(shí)是一種安全可靠的方法[3]。Naotoshi[4]等人利用半乳甘露聚糖與蛋清蛋白粉進(jìn)行接枝反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)接枝產(chǎn)物的凝膠性、持水性、熱穩(wěn)定性都得到了改善；于濱[5]等人利用麥芽糊精對(duì)蛋清蛋白粉進(jìn)行改性，結(jié)果表明糖基化蛋白較未改性的蛋清蛋白在熱穩(wěn)定性、凝膠性、乳化性、起泡性方面都得到了顯著提高。

雖然利用糖類與蛋清蛋白進(jìn)行接枝，制備高凝膠性蛋白粉的研究已有很多。但過(guò)去研究中用于對(duì)蛋清蛋白進(jìn)行糖基化改性的多糖通常價(jià)格較為昂貴，這勢(shì)必限制了研究的應(yīng)用范圍。而瓜爾豆膠是一種來(lái)源穩(wěn)定、價(jià)格低廉的中性多糖，用其來(lái)改善蛋清蛋白，對(duì)改性蛋清粉的工業(yè)化生產(chǎn)和產(chǎn)品的實(shí)際應(yīng)用具有重要意義。作者利用瓜爾豆膠酶解液與蛋清蛋白接枝，對(duì)接枝產(chǎn)物的凝膠性能進(jìn)行研究，以期為改性蛋清蛋白粉的廣泛應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蛋白粉：自制；瓜爾豆膠：阿拉丁試劑（上海）有限公司產(chǎn)品；β-甘露聚糖酶：江蘇銳陽(yáng)生物科技有限公司產(chǎn)品；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters 1525高效液相色譜儀：美國(guó)Waters公司產(chǎn)品；TA-xTZi物性測(cè)試儀：英國(guó) Stable Micro System公司產(chǎn)品；DYY-III2穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀：北京市六一儀器廠產(chǎn)品；日立臺(tái)式掃描電子顯微鏡TM3030：日本日立公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 蛋白粉的制備 從新鮮雞蛋中取出蛋清→攪拌均勻→棄去泡沫→利用檸檬酸調(diào)pH至6.8左右→酵母發(fā)酵脫糖處理→利用檸檬酸調(diào)pH 6.0左右→噴霧干燥 （進(jìn)風(fēng)溫度 （170±10）℃，出風(fēng)溫度（70±2） ℃）。

1.3.2 瓜爾豆膠酶解液的制備 底物質(zhì)量濃度為0.5 g/dL的瓜爾豆膠溶液在最佳酶解條件 （加酶量60 U/g，pH 5.0，45℃水浴酶解8 h）下進(jìn)行酶解反應(yīng)，反應(yīng)完畢后，將所得酶解液煮沸10 min滅酶，4 000 r/min離心20 min，取上清液備用。1.3.3 瓜爾豆膠酶解液的組分分析

1）高效凝膠過(guò)濾色譜（HPGFC）分析 將備用瓜爾豆膠酶解液用0.45 μm微孔膜過(guò)濾，取濾液進(jìn)樣，采用HPGFC法測(cè)定瓜爾豆膠酶解液的相對(duì)分子質(zhì)量分布。色譜條件：色譜柱：UltrahydrogelTMLinear 300 mm×7.8 mm； 流動(dòng)相：0.1 mol/L 硝酸鈉；流量：0.8 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2）高效液相色譜（HPLC）分析 將備用瓜爾豆膠酶解液用0.45 μm微孔膜過(guò)濾，取濾液進(jìn)樣，采用HPLC法測(cè)定瓜爾豆膠酶解液中單糖（甘露糖）及其他組分的含量。色譜條件：色譜柱Sugarpak1，6.5 mm×300 mm；流動(dòng)相：純水；檢測(cè)器；Waters2410 示差折光檢測(cè)器；柱溫：85 ℃；流量：0.4 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。

1.3.4 蛋清蛋白-瓜爾豆膠酶解液接枝產(chǎn)物的制備在Naotoshi[4]等人的方法上稍加修改來(lái)制備接枝產(chǎn)物。將瓜爾豆膠酶解液與原蛋白粉（EWP）按一定的配比 （以酶解前的瓜爾豆膠與蛋白粉的質(zhì)量比計(jì)算，配比范圍為0.1%至2.5%）混合后溶解，配制成蛋白質(zhì)濃度為10 g/dL的混合溶液，攪拌均勻后，調(diào)節(jié)溶液至一定的pH值（pH值范圍為5.0～10.0），分裝，冷凍干燥。凍干后，將冷凍干燥物平鋪在玻璃培養(yǎng)皿中，并用刺孔的鋁箔覆蓋，放置于干燥器（底部含有飽和KBr溶液，相對(duì)濕度79%）中，于60℃烘箱中反應(yīng)1～7 d，即制得不同反應(yīng)時(shí)間的接枝產(chǎn)物（改性蛋白粉，M-EWP）。接枝產(chǎn)物置于密封的塑封袋中，于-18℃下保存。

1.3.5 凝膠性測(cè)定 根據(jù)參考文獻(xiàn)[5]的方法測(cè)定。1.3.6 改性蛋白粉的凝膠強(qiáng)度隨pH值的變化將樣品溶于去離子水中，配制成質(zhì)量濃度為10 g/dL的蛋白溶液，分別調(diào)節(jié)pH值至3.0～10.0，測(cè)定不同pH值條件下制得凝膠的凝膠強(qiáng)度。

1.3.7 游離氨基含量的測(cè)定 參考文獻(xiàn) [6]方法測(cè)定。

1.3.8 褐變程度的測(cè)定 參考文獻(xiàn)[7]方法測(cè)定。

1.3.9 SDS-PAGE分析 參考文獻(xiàn)[8]方法測(cè)定。

1.3.10 氨基酸分析 食品中氨基酸的測(cè)定方法（GB/T 5009.124—2003）進(jìn)行分析。

1.3.11 凝膠掃描電鏡分析 參考文獻(xiàn) [9]方法測(cè)定。

1.3.12 數(shù)據(jù)處理 采用 Origin8.6軟件作圖，SPSS 17.0軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 瓜爾豆膠酶解液的組分分析

2.1.1 高效凝膠過(guò)濾色譜（HPGFC）分析 固定瓜爾豆膠質(zhì)量濃度為0.5 g/dL，以酶解率為考察指標(biāo)，依次對(duì)加酶量 （10～80 U/g）、酶解pH值 （pH 4.0～8.0）、酶解溫度（40～60 ℃）、酶解時(shí)間（2～10 h）進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，以確定瓜爾豆膠酶解的最佳條件。結(jié)果得出，瓜爾豆膠酶解的最佳條件為：加酶量60 U/g，pH 5.0，45℃水浴酶解8 h，在此條件下瓜爾豆膠的酶解率可達(dá)21.76%。為了研究瓜爾豆膠被β-甘露聚糖酶酶解后各種相對(duì)分子質(zhì)量組分的相對(duì)含量，對(duì)瓜爾豆膠的酶解液進(jìn)行高效凝膠過(guò)濾色譜分析，其相對(duì)分子質(zhì)量分布結(jié)果如圖1和表1所示。

圖1 瓜爾豆膠酶解液的凝膠過(guò)濾色譜圖Fig.1 HPGFC of guar gum hydrolysate

表1 瓜爾豆膠酶解液的相對(duì)分子質(zhì)量分布Table 1 Molecular weight distribution of guar gum hydrolysate

單糖（甘露糖）的相對(duì)分子質(zhì)量約為180，通過(guò)計(jì)算可知，二糖的理論相對(duì)分子質(zhì)量約為342，十糖的理論相對(duì)分子質(zhì)量約為1 638。由文獻(xiàn)資料[10]可知，半乳甘露聚糖的主要相對(duì)分子質(zhì)量約為15 000。在此基礎(chǔ)上，可初步得出結(jié)論：相對(duì)分子質(zhì)量小于300的的成分非常少，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.39%，即瓜爾豆膠酶解液中幾乎不含有單糖；相對(duì)分子質(zhì)量在300至1 650之間的成分，為酶解液的主要成分，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為62.70%，此部分主要成分為二糖到十糖（即甘露低聚糖）；相對(duì)分子質(zhì)量在1 650至15 000之間的成分，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為31.87%，此部分為瓜爾豆膠酶解產(chǎn)生的各種十糖以上的多糖；相對(duì)分子質(zhì)量大于15 000的成分，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.04%，此部分主要為未被酶解的瓜爾豆膠?？偟膩?lái)說(shuō)，瓜爾豆膠的酶解液中幾乎不含有單糖，甘露低聚糖的成分居多，未被酶解的部分較少。

2.1.2 高效液相色譜（HPLC）分析 為了進(jìn)一步確認(rèn)瓜爾豆膠酶解液中的單糖（甘露糖）含量，取甘露糖標(biāo)準(zhǔn)溶液及瓜爾豆膠酶解液進(jìn)行了高效液相色譜檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間，可知甘露糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的保留時(shí)間為14.00。通過(guò)色譜面積歸一化法定量，得出瓜爾豆膠酶解液中的甘露糖的含量為0.12%，說(shuō)明酶解液中幾乎不含有甘露糖，這與高效凝膠過(guò)濾色譜分析得到的結(jié)果相一致。

圖2 瓜爾豆膠酶解液的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC of guar gum hydrolysate

2.2 接枝反應(yīng)條件對(duì)接枝產(chǎn)物凝膠性質(zhì)的影響

蛋白質(zhì)與多糖的接枝反應(yīng)受到多種因素的影響。作者確定瓜爾豆膠酶解液作為接枝物與蛋清蛋白共價(jià)結(jié)合，主要研究3個(gè)接枝反應(yīng)條件：底物配比、反應(yīng)pH值和反應(yīng)時(shí)間對(duì)接枝產(chǎn)物凝膠性能（包括凝膠強(qiáng)度和持水性）的影響。

2.2.1 底物配比對(duì)接枝產(chǎn)物凝膠性質(zhì)的影響 底物配比會(huì)直接影響到美拉德反應(yīng)的反應(yīng)速率和反應(yīng)進(jìn)程。質(zhì)量濃度為0.5 g/dL的瓜爾豆膠溶液酶解后，酶解液中水分含量較多，糖組分含量較少，為了更直觀地說(shuō)明添加糖的比例，以及方便計(jì)算，取酶解前瓜爾豆膠的質(zhì)量進(jìn)行計(jì)算。作者選取了5個(gè)底物配比：質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0.10%，0.25%，0.50%，1.00%，2.50%，（以酶解前的瓜爾豆膠與蛋白粉的質(zhì)量比計(jì)算），固定反應(yīng)pH值為7.0的條件下，反應(yīng)3 d，研究接枝產(chǎn)物的凝膠強(qiáng)度和持水性，結(jié)果如圖3所示。

圖3 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)接枝產(chǎn)物凝膠性質(zhì)的影響Fig.3 Effect of different weight ratio on gel?properties of the grafted product

Imperiali[11]等人的研究表明，蛋清蛋白的凝膠強(qiáng)度越高，其凝膠的持水性越高，凝膠強(qiáng)度和持水性之間有密切的聯(lián)系，作者的研究結(jié)果與其結(jié)論相一致。由圖3可知，接枝產(chǎn)物的凝膠強(qiáng)度和持水性有相同的變化趨勢(shì)。當(dāng)瓜爾豆膠酶解液和蛋清蛋白的質(zhì)量比不斷減少時(shí)，其對(duì)應(yīng)的接枝產(chǎn)物的凝膠強(qiáng)度和持水性是先升高再降低的趨勢(shì)。在底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%時(shí)，接枝產(chǎn)物的凝膠強(qiáng)度和持水性達(dá)到最大。當(dāng)?shù)孜锱浔冗^(guò)大時(shí)，美拉德反應(yīng)劇烈，改性蛋白粉的顏色較深，易結(jié)塊且溶解性不好，接枝產(chǎn)物的凝膠強(qiáng)度和持水性較差。當(dāng)?shù)孜锱浔冗^(guò)小時(shí)，糖對(duì)蛋白的作用較小，接枝產(chǎn)物的凝膠強(qiáng)度和持水性改善效果不明顯。故選取適當(dāng)?shù)牡孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)于改善接枝產(chǎn)物的功能性質(zhì)有著重要的意義。作者選取底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

2.2.2 反應(yīng)pH值對(duì)接枝產(chǎn)物凝膠性質(zhì)的影響pH值影響蛋白質(zhì)和多糖的結(jié)構(gòu)和電荷，從而影響接枝產(chǎn)物的形成[12]?？刂频孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%，反應(yīng)時(shí)間為3 d的條件下，改變pH值，研究其對(duì)接枝產(chǎn)物凝膠強(qiáng)度和持水性的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 反應(yīng)pH值對(duì)接枝產(chǎn)物凝膠性質(zhì)的影響Fig.4 Effect of different pH value on gel?properties of the grafted product

由圖4可知，在pH值小于9.0時(shí)，隨著pH值的增大，接枝產(chǎn)物的凝膠強(qiáng)度和持水性逐漸增大；當(dāng)pH值等于9.0時(shí)，接枝產(chǎn)物的凝膠強(qiáng)度和持水性達(dá)到最大；當(dāng)pH值大于9.0時(shí)，接枝產(chǎn)物的凝膠強(qiáng)度和持水性減小。一般認(rèn)為，羰氨縮合是一個(gè)可逆的過(guò)程，在酸性溶液中，羰氨縮合產(chǎn)物很容易水解，不利于反應(yīng)的進(jìn)行，因此在這樣的條件下，美拉德反應(yīng)不顯著[13]。隨著反應(yīng)體系pH值的逐漸增大，體系的堿性增強(qiáng)，有利于美拉德反應(yīng)前體物質(zhì)的生成，從而加快了美拉德反應(yīng)的速度，有利于反應(yīng)的進(jìn)行。但當(dāng)堿性過(guò)強(qiáng)時(shí)，可能會(huì)出現(xiàn)肽鍵斷裂、脫羧和脫氨等情況，使蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)遭到破壞，從而不利于接枝反應(yīng)的進(jìn)行。故本實(shí)驗(yàn)選取pH值為9.0進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)接枝產(chǎn)物凝膠性質(zhì)的影響 反應(yīng)時(shí)間也是美拉德反應(yīng)的一個(gè)重要影響因素。反應(yīng)時(shí)間不夠，可能導(dǎo)致美拉德反應(yīng)不完全，而反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，接枝產(chǎn)物的功能性質(zhì)可能會(huì)受到不良影響?？刂频孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%，反應(yīng)pH值9.0的條件下，改變反應(yīng)時(shí)間，研究其對(duì)接枝產(chǎn)物凝膠強(qiáng)度和持水性的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)接枝產(chǎn)物凝膠性質(zhì)的影響Fig.5 Effect of different reaction time on gel?property of the grafted product

由圖5可知，在接枝反應(yīng)的1～4 d內(nèi)，改性蛋白粉的凝膠強(qiáng)度和持水性顯著提高，加熱4 d后達(dá)到最大值，分別由332.348 g和61.29%提高到1 527.257 g和86.06%，比改性之前分別提高了359.54%和40.41%，但加熱5 d后，改性蛋白粉的凝膠強(qiáng)度和持水性開始下降。這可能是因?yàn)榉磻?yīng)初期瓜爾豆膠酶解液中的糖組分與蛋清蛋白逐步結(jié)合使得蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)部分展開，從而提高了接枝產(chǎn)物的凝膠強(qiáng)度和持水性；隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，過(guò)度結(jié)合使得接枝產(chǎn)物的溶解性有所降低，從而使得接枝產(chǎn)物的凝膠強(qiáng)度和持水性下降。實(shí)驗(yàn)選取改性4 d的蛋白進(jìn)行后續(xù)氨基酸分析和凝膠微觀結(jié)構(gòu)分析。綜上由單因素實(shí)驗(yàn)可得，接枝反應(yīng)條件為底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%，反應(yīng)pH值為9.0，反應(yīng)時(shí)間為4 d時(shí)，制備的接枝產(chǎn)物具有最佳的凝膠強(qiáng)度和持水性。

2.3 改性蛋白粉的凝膠強(qiáng)度隨pH值的變化

蛋白質(zhì)發(fā)生美拉德反應(yīng)之后其結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生一定的變化，凝膠強(qiáng)度隨pH的變化也會(huì)有所不同。本實(shí)驗(yàn)研究了改性蛋白粉和原蛋白粉在不同pH值下凝膠強(qiáng)度的變化，結(jié)果如圖6所示。

圖6 改性蛋白粉和原蛋白粉凝膠強(qiáng)度隨pH值的變化Fig.6 Effect of pH value on gel?strength of EWP and M-EWP

由圖6可知，原蛋白粉在pH值為4.0時(shí)，凝膠強(qiáng)度達(dá)到最大值，pH值為6.0時(shí)，凝膠強(qiáng)度最小。而改性后的蛋白粉在pH值為3.0時(shí)，與原蛋白粉的凝膠強(qiáng)度幾乎一樣，但在pH值為4.0～10.0的范圍內(nèi)時(shí)，改性后的蛋白粉的凝膠強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于原蛋白，且都能保持在大于1 500 g，這一點(diǎn)對(duì)于改性蛋白粉作為食品添加劑在工業(yè)上的應(yīng)用是十分有利的。

2.4 改性蛋白粉的凝膠強(qiáng)度隨儲(chǔ)藏時(shí)間的變化

Hammershoj[14]等人和 Hidalgo[15]等人的研究表明，卵白蛋白的凝膠性隨貯藏期的延長(zhǎng)明顯降低。目前，關(guān)于糖基化改性后，蛋清蛋白粉的凝膠性隨儲(chǔ)藏時(shí)間的變化規(guī)律還不明確。因此，選擇在底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%，反應(yīng)pH值9.0的條件下分別反應(yīng)2，4，6 d的接枝產(chǎn)物進(jìn)行研究，將這3種接枝產(chǎn)物置于4℃條件下儲(chǔ)存，每隔7 d時(shí)間取樣測(cè)定凝膠強(qiáng)度，結(jié)果如圖7所示。

由圖7可知，改性2 d的蛋白粉的凝膠強(qiáng)度隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)先增大后趨于平緩，雖然其凝膠強(qiáng)度是有增大的趨勢(shì)，但即便是凝膠強(qiáng)度有所提高后，也比不上改性4 d的蛋白粉；改性4 d的蛋白粉的凝膠強(qiáng)度在35 d內(nèi)變化的相對(duì)較小，4℃條件下儲(chǔ)藏35 d時(shí)，改性蛋白粉的凝膠強(qiáng)度較儲(chǔ)藏初期僅下降了1.44%，且該改性蛋白粉的凝膠強(qiáng)度可以達(dá)到一個(gè)較高的水平；改性6 d的蛋白粉的凝膠強(qiáng)度隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷下降，非常不利于儲(chǔ)藏。

圖7 改性蛋白粉的凝膠強(qiáng)度隨儲(chǔ)藏時(shí)間的變化Fig.7 Change of gel strength of M-EWP with storage time

不同的改性時(shí)間，改性產(chǎn)物在儲(chǔ)藏期間的凝膠穩(wěn)定性各不相同，這可能是由于改性時(shí)間不同，糖基化程度不同，接枝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)變化有所區(qū)別，也導(dǎo)致產(chǎn)物的溶解性不同。以上結(jié)果表明，改性4 d的蛋白粉不僅在凝膠性能上有較好的改善效果，而且具有較好的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性，這一改性條件對(duì)于改性蛋白粉的實(shí)際生產(chǎn)具有非常重要的意義。

2.5 接枝產(chǎn)物游離氨基質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化

糖基化反應(yīng)的進(jìn)程可以由游離氨基質(zhì)量分?jǐn)?shù)來(lái)表示，反應(yīng)進(jìn)行越徹底，消耗的游離氨基越多[16]。在控制底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%，反應(yīng)pH值9.0的條件下，研究改性蛋白粉中游離氨基質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨反應(yīng)時(shí)間的變化。以原蛋白粉中游離氨基的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%計(jì)，計(jì)算改性蛋白粉中游離氨基質(zhì)量分?jǐn)?shù)，變化趨勢(shì)如圖8所示。

圖8 改性蛋白粉游離氨基質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨反應(yīng)時(shí)間的變化Fig.8 Change of free amino contents of M-EWP with reaction time

從圖8可以看出，改性蛋白粉中游離氨基質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而明顯減少，且前4 d內(nèi)減少迅速，在5～7 d內(nèi)減少緩慢。雖然原蛋白在干熱過(guò)程中體系中的游離氨基含量也會(huì)有所降低，但損失率較少，這說(shuō)明瓜爾豆膠酶解液中的糖組分與蛋白粉之間確實(shí)發(fā)生了美拉德反應(yīng)，從而造成游離氨基質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降。

2.6 接枝產(chǎn)物的褐變程度分析

除了游離氨基外，美拉德反應(yīng)的進(jìn)行程度也可以用褐變指數(shù)來(lái)反映。作者在控制底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%，反應(yīng)pH值9.0的條件下，研究改性蛋白粉的褐變指數(shù)隨反應(yīng)時(shí)間的變化，結(jié)果如圖9所示。結(jié)果表明，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，改性蛋白粉的褐變程度逐漸增加，但總體來(lái)說(shuō)，增加較為緩慢，反應(yīng)7 d后褐變指數(shù)仍然較小，僅為0.228，這說(shuō)明瓜爾豆膠酶解液與蛋清蛋白之間的美拉德反應(yīng)僅為起始階段或中間階段。

圖9 改性蛋白粉的褐變指數(shù)隨反應(yīng)時(shí)間的變化Fig.9 Change of degree of browning of M-EWP with reaction time

2.7 接枝反應(yīng)前后蛋白質(zhì)氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分析

在蛋白質(zhì)與糖類接枝的過(guò)程中，氨基酸的含量會(huì)發(fā)生變化，通過(guò)測(cè)定接枝產(chǎn)物中氨基酸的組成可以初步判定美拉德反應(yīng)的程度。此外，這對(duì)研究接枝反應(yīng)前后蛋白粉的凝膠強(qiáng)度和持水性的變化也十分重要。實(shí)驗(yàn)對(duì)接枝反應(yīng)前后的蛋白粉進(jìn)行氨基酸含量的測(cè)定，結(jié)果以各種氨基酸占總氨基酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示，如表2所示。

通過(guò)氨基酸與糖的接枝反應(yīng)，能夠使蛋清蛋白質(zhì)獲得大量的羥基，從而增強(qiáng)蛋白質(zhì)之間的氫鍵作用，吸附更多水分子，以強(qiáng)化蛋白的凝膠強(qiáng)度和持水性。接枝反應(yīng)前后，蛋白粉中各種氨基酸均有不同程度的損失。由表2可知，絲氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、賴氨酸和精氨酸發(fā)生明顯減少。Guan[17]等人的研究表明，賴氨酸和精氨酸的側(cè)鏈上存在自由氨基，可直接參與蛋白質(zhì)與糖的接枝反應(yīng)，故其相對(duì)含量減少。絲氨酸、色氨酸和甲硫氨酸的減少，原因尚不明確。但從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，接枝反應(yīng)后，賴氨酸并未出現(xiàn)大量損失，從而推測(cè)瓜爾豆膠酶解液中的糖組分與蛋白粉之間的美拉德反應(yīng)處于一個(gè)有利的階段，既能夠有效改善蛋白粉的凝膠強(qiáng)度和持水性，又在很大程度上降低了接枝反應(yīng)帶來(lái)的營(yíng)養(yǎng)損失，具有可觀的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

表2 接枝反應(yīng)前后氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分析Table 2 Content of different amino acid of EWP and MEWP %

2.8 SDS-PAGE分析

電泳圖譜常被用來(lái)分析蛋白質(zhì)的組成成分，通常用考馬斯亮藍(lán)染色來(lái)分析接枝產(chǎn)物中大分子糖鏈的接入[18]。實(shí)驗(yàn)利用SDS-PAGE對(duì)原蛋白粉和改性0、2、4、6 d的蛋白粉進(jìn)行分析，結(jié)果如圖10所示。

由圖10可知，隨著改性時(shí)間的延長(zhǎng)，卵白蛋白和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的特征譜帶的顏色在變淺，4、5、6條泳道在高相對(duì)分子質(zhì)量區(qū)出現(xiàn)了連續(xù)譜帶，且隨著改性時(shí)間的延長(zhǎng)而增多富集。這說(shuō)明瓜爾豆膠酶解液中的糖組分在與蛋清蛋白接枝的過(guò)程中，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，逐漸生成了以共價(jià)鍵結(jié)合的相對(duì)分子質(zhì)量較大的復(fù)合物，這也證實(shí)了美拉德反應(yīng)的發(fā)生。

圖10 原蛋白粉和改性蛋白粉的SDS-PAGE圖譜Fig.10SDS-PAGE of EWP and M-EWP

2.9 凝膠掃描電鏡分析

為了從微觀結(jié)構(gòu)上分析改性后蛋白粉凝膠強(qiáng)度增強(qiáng)的機(jī)理，實(shí)驗(yàn)對(duì)原蛋白粉和改性蛋白粉制備的凝膠進(jìn)行了SEM分析，結(jié)果如圖11所示。

圖11 原蛋白粉和改性蛋白粉凝膠的微觀結(jié)構(gòu)圖Fig.11 Scanning electron micrographs of EWP and MEWP

由圖11可知，原蛋白粉所形成的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)松散，間隙較大，而改性蛋白粉所形成的凝膠結(jié)構(gòu)較為均勻致密，且間隙較小。由此可以確定，糖基化反應(yīng)有利于形成結(jié)構(gòu)均勻致密的凝膠。研究表明，蛋白分子與糖共價(jià)結(jié)合后，疏水基團(tuán)能增加分子間斥力，從而改變凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。凝膠的持水性，彈性與其網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的致密程度及均一性呈正相關(guān)，凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)越均勻致密，其凝膠性越好。基于此，可以有力證明瓜爾豆膠酶解液和蛋清蛋白之間的接枝反應(yīng)能明顯地改善蛋清蛋白的凝膠性能。

3 結(jié)語(yǔ)

利用瓜爾豆膠酶解液改性蛋清蛋白，在底物配比0.5%，pH值9.0，反應(yīng)時(shí)間為4 d時(shí)，制備出的接枝產(chǎn)物的凝膠強(qiáng)度和持水性最大，比改性之前分別提高了359.54%和40.41%。改性4 d的蛋白粉在pH 4～10的范圍內(nèi)，都能保持較好的凝膠強(qiáng)度，且具有較好的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性。在接枝反應(yīng)過(guò)程中，體系中的游離氨基質(zhì)量分?jǐn)?shù)減少，各種不同氨基酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)減少，證實(shí)了美拉德反應(yīng)的發(fā)生。SDS-PAGE分析得出，在接枝反應(yīng)中生成了以共價(jià)鍵結(jié)合的相對(duì)分子質(zhì)量較大的復(fù)合物。SEM也說(shuō)明，蛋清蛋白結(jié)構(gòu)的變化，能使之形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更均勻致密的凝膠。總之，利用瓜爾豆膠酶解液能有效地改善蛋清蛋白的凝膠性質(zhì)，這一結(jié)論對(duì)于改性蛋白粉的加工和生產(chǎn)應(yīng)用具有一定的指導(dǎo)意義。

致謝：本研究獲得江蘇省“食品安全與質(zhì)量控制協(xié)同創(chuàng)新中心”產(chǎn)業(yè)發(fā)展項(xiàng)目資助，特此致謝！