醬香酒生產(chǎn)過(guò)程中的微生物研究

羅小葉 ，王曉丹 ，邱樹(shù)毅

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025； 2.貴州大學(xué)貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng)550025）

我國(guó)傳統(tǒng)白酒是世界上最古老的蒸餾酒之一，其主要以富含淀粉質(zhì)的糧食為原料，經(jīng)過(guò)固態(tài)、半固態(tài)及液態(tài)等方式發(fā)酵、蒸餾而成。醬香型白酒是中國(guó)蒸餾酒的重要香型之一，它采用獨(dú)特的釀造工藝，高溫制曲、高溫堆積、高溫發(fā)酵、高溫餾酒和長(zhǎng)期貯存，此外，其釀造工藝還包括2次投料、9次蒸煮、8次發(fā)酵、7次取酒，長(zhǎng)時(shí)間分輪次、分香型貯存后，精心勾調(diào)而成[1]。茅臺(tái)酒是醬香型白酒的典型代表，是世界三大（蒸餾）名酒之一，以其香氣幽雅、酒體醇厚豐滿、回味悠長(zhǎng)、空杯留香持久的特點(diǎn)深受廣大消費(fèi)者的青睞，是中國(guó)優(yōu)質(zhì)白酒的典范。

微生物的種類及數(shù)量對(duì)醬香型白酒的風(fēng)味有著特殊的關(guān)系，直接參與了醬香型白酒風(fēng)味物質(zhì)的形成。本文介紹了本課題組對(duì)醬香型白酒從制曲、堆積到窖內(nèi)發(fā)酵過(guò)程中各類微生物的研究情況，通過(guò)免培養(yǎng)和可培養(yǎng)的方法對(duì)整個(gè)釀造過(guò)程各類微生物的菌群結(jié)構(gòu)及主要功能菌進(jìn)行分析，從多角度認(rèn)識(shí)醬香型白酒生產(chǎn)過(guò)程中的各類微生物，對(duì)揭示醬香型白酒發(fā)酵機(jī)理及提高白酒質(zhì)量有一定的借鑒，亦對(duì)控制醬香型白酒生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性和規(guī)范性具有指導(dǎo)意義。

1 醬香酒中的細(xì)菌研究

細(xì)菌作為醬香白酒主要微生物類群之一，在整個(gè)釀造過(guò)程中呈現(xiàn)出種類與功能多樣性的特點(diǎn)，是發(fā)酵生香的動(dòng)力來(lái)源，細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)特征直接影響著代謝產(chǎn)物的形成，多年來(lái)針對(duì)細(xì)菌類群結(jié)構(gòu)的分析一直是研究熱點(diǎn)。

1.1 免培養(yǎng)方法分析醬香大曲細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)

王曉丹等[2]研究了茅臺(tái)鎮(zhèn)醬香白酒7個(gè)企業(yè)大曲細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)，采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)樣品細(xì)菌種群進(jìn)行分析，得到的在各分類水平上的物種組成比例以及群落結(jié)構(gòu)的情況見(jiàn)表1。

表1 醬香大曲細(xì)菌類群分析

研究表明，細(xì)菌類群分析平均92%以上的序列可以注釋在科水平，有70%的序列可以注釋到屬的水平，確定醬香大曲細(xì)菌的組成以厚壁菌門(mén)（87.3%～91.8%）為主要類群，并發(fā)現(xiàn)了未曾報(bào)道過(guò)的藍(lán)細(xì)菌門(mén)（0.1%～1.5%），其中芽孢桿菌屬占細(xì)菌總量的60%以上，在醬香大曲細(xì)菌類群分析中屬優(yōu)勢(shì)種類。

1.2 可培養(yǎng)方法分析醬香大曲細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)及功能特性

肖蓓[3]、王婧[4]采用可培養(yǎng)稀釋平板法分析茅臺(tái)鎮(zhèn)醬香白酒7個(gè)企業(yè)大曲細(xì)菌群落組成，從大曲樣品中共分離出47株細(xì)菌，鑒定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 醬香大曲細(xì)菌種類

其中，地衣芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌在大曲中的含量都比其他細(xì)菌多，是典型的嗜熱芽孢桿菌，也是大曲中產(chǎn)醬香功能細(xì)菌，初步推測(cè)為地域性微生物類群。

肖蓓[3]對(duì)大曲樣品中分離純化篩選出的上述可培養(yǎng)細(xì)菌，進(jìn)行產(chǎn)酶實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，篩選出的可培養(yǎng)細(xì)菌可產(chǎn)生酸性蛋白酶、糖化酶、纖維素酶、果膠酶及脂肪酶，不同種類的細(xì)菌產(chǎn)酶種類及酶活大小差異較大。結(jié)果見(jiàn)表3。

其次王婧[4]對(duì)可培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行模擬固態(tài)發(fā)酵并采用GC-MS聯(lián)用儀對(duì)揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，結(jié)果如表4所示，表明各株細(xì)菌的發(fā)酵產(chǎn)物豐富，其中四甲基吡嗪和香味物質(zhì)乙偶姻含量較高。并從中篩選出產(chǎn)吡嗪類物質(zhì)相對(duì)較高的地衣芽孢桿菌，應(yīng)用到麩曲醬香型白酒生產(chǎn)中，并通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵條件，提高麩曲醬香型白酒酒質(zhì)，增加了醬香風(fēng)味。

1.3 可培養(yǎng)方法分析醬香酒釀造過(guò)程細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)及功能特性

張小龍[5]以貴州遵義某釀酒有限公司提供酒醅為實(shí)驗(yàn)材料，通過(guò)平板劃線的方法從酒醅中細(xì)菌進(jìn)行分離篩選，經(jīng)鑒定主要為地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、彎曲芽孢桿菌等種類。

篩選到的細(xì)菌通過(guò)模擬固態(tài)發(fā)酵并利用GCMS聯(lián)用儀分析產(chǎn)醬香濃郁的細(xì)菌的固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物，結(jié)果見(jiàn)表5，表明產(chǎn)物中芳香族及雜環(huán)類化合物含量較高，其中四甲基吡嗪含量最高，這賦予醬香型白酒以濃郁突出的醬香風(fēng)味。

表3 細(xì)菌5種酶酶活測(cè)定結(jié)果 (U/mL)

表4 地衣芽孢桿菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物比例 (%)

表5 地衣芽孢桿菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物比例 (%)

1.4 醬香酒中嚴(yán)格厭氧的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)及功能特性

酒醅微生物區(qū)系是白酒釀造體系中微生物多樣性研究的重點(diǎn)，其產(chǎn)生的酶類、酯類、酸類是構(gòu)成酒體風(fēng)味物質(zhì)的前提。而厭氧培養(yǎng)由于技術(shù)繁瑣，耗費(fèi)財(cái)力而成為厭氧微生物研究的瓶頸，所以目前關(guān)于醬香白酒釀造過(guò)程中厭氧細(xì)菌的報(bào)道很少。曾超[6]采用較簡(jiǎn)單便捷的厭氧手套箱法來(lái)對(duì)釀造酒醅中厭氧細(xì)菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，結(jié)果在厭氧工作站中，利用平板劃線法對(duì)各輪次酒醅進(jìn)行分離篩選，從酒醅中分離出7株嚴(yán)格厭氧菌，經(jīng)鑒定為解木聚糖梭菌(Clotridium xylanolyticum)、煎盤(pán)梭菌(Clostridium sartagoformum)、丁酸梭菌（Clostridium butyricum）、近端梭菌（Clostridium clostridiiforme）。此外通過(guò)對(duì)嚴(yán)格厭氧菌進(jìn)行模擬固態(tài)發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)木聚糖梭菌、煎盤(pán)梭菌2株嚴(yán)格厭氧菌具有很強(qiáng)的醬香氣味，通過(guò)GC-MS聯(lián)用儀對(duì)揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，其中含量較高的吡嗪類化合物是產(chǎn)生醬香味的主要物質(zhì)。課題組通過(guò)對(duì)醬香型白酒釀造過(guò)程中厭氧菌的研究為今后深入探討其功能提供一定基礎(chǔ)。

2 醬香酒中的高溫放線菌與放線菌

2.1 免培養(yǎng)方法分析醬香大曲高溫放線菌菌群結(jié)構(gòu)

高溫放線菌分類地位屬于細(xì)菌域（Domain Bacteria）、厚壁菌門(mén)（Phylum Firmicutes）、芽孢桿菌綱（Class Bacilli）、芽孢桿菌目（Order Bacillales）、高溫放線菌科（Thermoactinomycetaceae）[7]。王曉丹[8]采用第二代高通量測(cè)序的方法對(duì)醬香大曲細(xì)菌的多樣性進(jìn)行了分析，同時(shí)發(fā)現(xiàn)高溫放線菌的平均相對(duì)含量占34.40%，且不同企業(yè)大曲樣品的高溫放線菌含量有差異（表6）。采用免培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn)，高溫放線菌屬和芽孢桿菌屬同為醬香型大曲主要優(yōu)勢(shì)菌群，推測(cè)高溫放線菌在醬香型大曲中同樣扮演了重要的角色。

表6 不同企業(yè)醬香大曲高溫方放線菌與芽孢桿菌科含量對(duì)比 (%)

2.2 可培養(yǎng)方法分析醬香大曲高溫放線菌菌群結(jié)構(gòu)及功能特性

李豆南[9]、羅小葉[10]從茅臺(tái)鎮(zhèn)某醬香酒企業(yè)成品曲中采用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法對(duì)樣品中高溫放線菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，結(jié)果從中分離鑒定出5株高溫放線菌，分別為：嗜溫高溫放線菌（Thermoactinomyces thalpohillus）、甘蔗高溫放線菌（Thermoactinomyces sacchari)、甘蔗萊斯氏菌（Laceyella sacchari）。模擬固態(tài)發(fā)酵和分析揮發(fā)性成分，結(jié)果顯示，揮發(fā)性成分組成主要以醇類、醛類、酮類、烷烴類、酯類、萜烯類物質(zhì)為主，其在感官品評(píng)方面表現(xiàn)出醬味和土霉異味，揮發(fā)性產(chǎn)物檢測(cè)到的表現(xiàn)醬味的吡嗪類物質(zhì)及表現(xiàn)出土霉異味的二甲萘烷醇。上述研究對(duì)了解這一種屬在醬香大曲中的作用是非常必要的，也填補(bǔ)了高溫放線菌分離篩選及其功能研究的空白。

2.3 免培養(yǎng)方法分析醬香大曲放線菌菌群結(jié)構(gòu)

王曉丹[2]采用高通量測(cè)序的方法對(duì)茅臺(tái)鎮(zhèn)醬香白酒7個(gè)企業(yè)大曲微生物菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行探究，分析結(jié)果表明，檢測(cè)到放線菌門(mén)的微生物占一定比例，主要為纖維素單胞菌科、分支桿菌科、諾卡菌科、鏈霉菌科、微球菌科、高溫單孢菌科、丙酸桿菌科、短桿菌科、多孢放線菌科等科的放線菌，其中糖多孢菌屬的平均相對(duì)含量最高，為9.2%。

2.4 可培養(yǎng)方法分析醬香大曲放線菌菌群結(jié)構(gòu)及功能特性

對(duì)于傳統(tǒng)白酒生產(chǎn)領(lǐng)域有關(guān)放線菌研究，主要集中在白酒發(fā)酵過(guò)程中酒醅、窖泥、發(fā)酵池、曲房和窖房空氣中放線菌的分離及鑒定，羅小葉等探究醬香酒大曲中放線菌資源及功能，從中分離鑒定出了3株放線菌分別為可可鏈霉菌（Streptomyces cacaoi）、沙阿霉素鏈霉菌（Streptomyces zaomyceticus），同時(shí)對(duì)其產(chǎn)酶產(chǎn)香特性進(jìn)行相關(guān)研究，見(jiàn)表7。結(jié)果表明，3株菌產(chǎn)果膠酶較為突出，固態(tài)發(fā)酵揮發(fā)性成分分析見(jiàn)圖1。主要以酯類物質(zhì)為主，且均能產(chǎn)生吡嗪類物質(zhì)。

表7 放線菌5種酶酶活力測(cè)定結(jié)果 (U/g)

圖1 醬香大曲中鏈霉菌揮發(fā)性成分分析

3 醬香酒中的酵母菌

酵母是白酒釀造微生物家族中不可或缺的一類微生物，從醬香型白酒制曲到釀造過(guò)程一直可以檢測(cè)出，直接關(guān)系到產(chǎn)酒率，且能夠代謝產(chǎn)生大量不同的風(fēng)味物質(zhì)，對(duì)醬香型白酒風(fēng)格的形成具有重要作用。對(duì)醬香型白酒大曲和釀造過(guò)程中的酵母進(jìn)行研究，揭示釀造工藝中酵母消長(zhǎng)規(guī)律及群落結(jié)構(gòu)，認(rèn)識(shí)微生態(tài)環(huán)境中酵母作用及其與微生態(tài)環(huán)境中各種微生物之間的代謝關(guān)系，能進(jìn)一步發(fā)揮酵母資源在白酒生產(chǎn)中的作用，提高酵母生物經(jīng)濟(jì)學(xué)價(jià)值，也為深入研究醬香型白酒發(fā)酵機(jī)理及呈香機(jī)制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)，并對(duì)實(shí)際生產(chǎn)具有指導(dǎo)意義[11]。

3.1 免培養(yǎng)方法分析醬香大曲酵母菌菌群結(jié)構(gòu)

王曉丹[2]采用高通量測(cè)序的方法對(duì)茅臺(tái)鎮(zhèn)醬香白酒7個(gè)企業(yè)大曲酵母菌菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行探究，分析檢測(cè)到子囊菌門(mén)、酵母綱、酵母目下的酵母菌，如表8所示，其中畢赤酵母屬和復(fù)膜孢酵母屬的酵母種類平均相對(duì)含量最高，此外各個(gè)企業(yè)的酵母菌群結(jié)構(gòu)及含量均有一定差異。

3.2 可培養(yǎng)方法分析醬香白酒釀造過(guò)程酵母菌菌群結(jié)構(gòu)及功能特性

醬香型白酒高溫制曲工藝雖然會(huì)限制酵母菌的生長(zhǎng)和繁殖，但是仍然有部分酵母可能處于存活或者休眠狀態(tài)，并且成品曲出房后及貯存過(guò)程中，在常溫條件下繼續(xù)網(wǎng)羅周?chē)h(huán)境中的酵母，因而醬香型白酒高溫大曲中仍含有一定數(shù)量的酵母[11]。課題組孔維兵[12]、陳美竹[13]、龐博[14]采用可培養(yǎng)方法對(duì)醬香型白酒釀造過(guò)程中的酵母菌進(jìn)行分離篩選和功能特性研究，結(jié)果見(jiàn)表9。

表8 免培養(yǎng)方法分析不同企業(yè)醬香大曲酵母菌菌群結(jié)構(gòu)

表9 可培養(yǎng)方法分析酵母菌菌群結(jié)構(gòu)及特性

4 醬香酒中的絲狀真菌

醬香型白酒獨(dú)特的釀造工藝形成了獨(dú)特的微生物群落，其中霉菌是醬香大曲中一類比較重要的微生物，種類豐富，能夠分泌多種酶類和代謝產(chǎn)物，對(duì)醬香型白酒獨(dú)特的同步糖化發(fā)酵釀造方式和風(fēng)味物質(zhì)的形成有重要影響。

4.1 免培養(yǎng)方法分析醬香大曲絲狀真菌菌群結(jié)構(gòu)

王曉丹[2]通過(guò)高通量測(cè)序分析茅臺(tái)鎮(zhèn)醬香白酒7個(gè)企業(yè)大曲樣品霉菌種群結(jié)構(gòu)，分析結(jié)果如表10所示，大曲樣品中曲霉屬、根霉屬及橫梗霉屬3個(gè)屬的霉菌相對(duì)含量明顯高于其他屬類，此外不同企業(yè)的霉菌在種類及數(shù)量上有一定差異。

4.2 可培養(yǎng)方法分析醬香大曲絲狀真菌菌群結(jié)構(gòu)及功能特性

表10 免培養(yǎng)方法分析不同企業(yè)醬香大曲霉菌菌群結(jié)構(gòu)

表11 可培養(yǎng)方法分析霉菌菌群結(jié)構(gòu)及特性

班世棟[15]、徐佳[16]對(duì)貴州某醬香型白酒生產(chǎn)企業(yè)醬香型大曲中霉菌進(jìn)行研究，分別研究白曲、黃曲和黑曲不同儲(chǔ)藏時(shí)間的大曲霉菌的數(shù)量變化、可培養(yǎng)霉菌的種類及產(chǎn)酶情況。結(jié)果表明，大曲在儲(chǔ)藏過(guò)程中，白曲的霉菌數(shù)量最多，黃曲和黑曲的數(shù)量相差較小，總共分離到28株霉菌，見(jiàn)表11。通過(guò)研究醬香大曲的霉菌種類及數(shù)量，結(jié)合可培養(yǎng)霉菌的酶活體系，為衡量大曲品質(zhì)，完善制曲工藝的操作控制生產(chǎn)高品質(zhì)大曲提供參考依據(jù)，也為強(qiáng)化大曲提供研究基礎(chǔ)。

5 展望

醬香白酒作為中國(guó)白酒重要香型，擁有獨(dú)特的生產(chǎn)工藝和別具一格的風(fēng)味，以及獨(dú)特的魅力，對(duì)醬香白酒的研究也具有很高的理論價(jià)值和市場(chǎng)價(jià)值。

采用可培養(yǎng)方法和免培養(yǎng)技術(shù)來(lái)分析醬香白酒整個(gè)釀造過(guò)程的微生物菌群結(jié)構(gòu)，從物種分類水平上詳細(xì)描述了醬香白酒釀造過(guò)程各類微生物群落的特征性結(jié)構(gòu)，每個(gè)企業(yè)的微生物類群組成都具有各自的特點(diǎn)，根據(jù)微生物類群組成分離篩選特征微生物和功能微生物，為今后醬香白酒微生物多樣性及功能性的深入研究提供了新的思路。隨著對(duì)醬香白酒相關(guān)研究的增多，積累了豐富的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，醬香白酒的研究在不斷向前發(fā)展。