張海波， 黃 瓊， 盧 帥， 李志強， 陳 蓓， 趙 軍

(新疆醫(yī)科大學1第一附屬醫(yī)院藥學部， 烏魯木齊 830054； 2藥學院， 烏魯木齊 830011；3新疆埃樂欣藥業(yè)有限公司， 烏魯木齊 830013; 4新疆醫(yī)科大學動物實驗中心， 烏魯木齊 830011)

阿苯達唑(albendazole，ABZ)因其治療包蟲感染療效良好、毒性作用小及其藥物經濟學方面的優(yōu)勢，已成為包蟲病藥物治療的首選，成為 WHO 推薦的抗包蟲病的一線藥物，也是目前公認的抗細粒棘球蚴有效藥物[1]。ABZ 給藥吸收后在肝臟/腸內迅速代謝為阿苯達唑亞砜(albendazole sulphoxide，ABZSO)，ABZSO 進而轉化成阿苯達唑砜(albendazole sulphone，ABZSO2)，最終代謝為阿苯達唑-氨基砜(albendazole amino sulphone，ABZSO2-NH2)，其中，ABZSO是主要的代謝產物和抗包蟲的活性成分[2]。阿苯達唑脂質體混懸液是由新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院溫浩等研制的阿苯達唑新劑型，現(xiàn)已成功轉化為醫(yī)院制劑，用于臨床包蟲病的治療。課題組前期研究表明，大鼠或小鼠給藥阿苯達唑脂質體混懸液后血中 ABZSO和ABZSO2濃度及其生物利用度均有所提高，藥物在體內的存留時間延長，體內分布速度加快，并具有一定的肝靶向性[3-5]。生物樣品中 ABZ 及其代謝物的檢測多以ABZSO和ABZSO2為指標成分，檢測方法以 HPLC-UV[6]最為常用。因液相色譜-質譜聯(lián)用法具有準確度高、可靠性強、靈敏度高、選擇性強、分析快速且成本低等優(yōu)點，在生物樣本分析中得到了廣泛的應用[7]。本研究建立了同時測定綿羊血漿中ABZ、ABZSO、ABZSO2及ABZSO2-NH2濃度的超高效液相色譜-飛行時間質譜聯(lián)用(UPLC-Q-TOF-MS)分析方法，并應用該方法測定綿羊灌胃給予阿苯達唑脂質體混懸液后經時血藥濃度，計算其主要藥代動力學參數，為進一步研究阿苯達唑脂質體混懸液在體內的吸收和代謝提供參考，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1儀器BP211D型分析天平(德國Sartorius公司)，Acquity UPLC I-Class型超高效液相色譜儀(美國Waters公司)，Xevo G2-S QTof型質譜檢測器(美國Waters公司)，MassLynx V4.1版本工作站(美國Waters公司)，F(xiàn)JY1002-4VF基因研究型超純水機(青島富勒姆科技有限公司)，LG10-2.4A型高速冷凍離心機(中科中佳科學儀器有限公司)，MS 3 basic型渦旋振蕩器(德國IKA公司)，DZKW型4孔電子恒溫水浴鍋(北京永興明醫(yī)療儀器廠)，KQ-200VDB型超聲波清洗機(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2試藥阿苯達唑(ABZ，美國Sigma公司，批號：081M1540V，純度>98%)，阿苯達唑亞砜(ABZSO，加拿大TRC公司，批號：5-ABY-166-1，純度>98%)，阿苯達唑砜(ABZSO2，加拿大TRC公司，批號：SZBB229XV，純度>98%),阿苯達唑氨基砜(ABZSO2-NH2，美國SCBT公司，批號：sc-207278，純度≥98%)，內標物甲苯咪唑(mebendazole，MBZ，加拿大TRC公司，批號：4-XYZ-40-1，純度>98%)，甲醇(美國Fisher公司，批號：143714)，乙腈(美國Fisher公司，批號：155753)，甲酸(天津市光復精細化工研究所，批號：20140629)，去離子水(FJY1002-4VF基因研究型超純水機制水)，阿苯達唑脂質體混懸液(ABZ 含量10.0 mg/mL，批號：20130822，新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院)。

1.3實驗動物6只健康綿羊，雌性，體質量(23.0±2.2)kg，飼養(yǎng)于新疆醫(yī)科大學動物實驗中心，生產許可證號SCXK (新) 2011-0004。

2 方法與結果

2.1色譜與質譜條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC○RBEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流動相：甲醇(A)-水(0.1% 甲酸，B)，梯度洗脫條件[ 0～3.5 min (10%～55% B)，3.5～3.8 min (55%～90% B)，3.8～4.4 min (90% B)，4.4～6 min (90%～10% B)]，流速：0.4 mL/min，柱溫：40℃，進樣器溫度：10℃，進樣量：2 μL。

2.1.2 質譜條件 正離子模式，離子源參數：毛細管電壓 0.5 kV，離子源溫度100℃，脫溶劑溫度 450℃，錐孔電壓 40 V，提取錐孔電壓80 V，錐孔氣流量50 L/h，脫溶劑氣流量(N2)800 L/h。選擇監(jiān)測離子檢測( SIM)：ABZ m/z 266.096，ABZSO m/z 282.091，ABZSO2m/z 298.086，ABZSO2-NH2m/z 240.081，內標MBZ m/z 296.104 (均為質子化的母離子[M+H]+)，見圖1-5。

圖1 ABZ 化學結構及母離子[M+H]+質譜圖

2.2溶液的配制方法

2.2.1 對照品溶液的配制 稱取ABZ、ABZSO、ABZSO2、ABZSO2-NH2和MBZ標準品適量，甲醇溶解，配制成濃度為100 μg/mL的儲備液，用甲醇稀釋得8個濃度混合對照品溶液和固定濃度內標溶液，用于制備各濃度的校正標樣和質控樣品，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

圖2 ABZSO 化學結構及母離子[M+H]+質譜圖

圖3 ABZSO2 化學結構及母離子[M+H]+質譜圖

圖4 ABZSO2-NH2 化學結構及母離子[M+H]+質譜圖

圖5 MBZ 化學結構及母離子[M+H]+質譜圖

2.2.2 標準血漿樣品和質控血漿樣品的的配制 分別取“2.2.1”項下8個濃度混合對照品溶液20 μL，氮氣吹干，加入空白綿羊血漿200 μL復溶，渦旋混勻，制得8個濃度標準血漿樣品，ABZ、ABZSO、ABZSO2、ABZSO2-NH2在血漿中的有效質量濃度范圍分別為6.2～798.0、5.2～5 370.0、3.3～3 168.0、8.6～1 100.0 ng/mL。同法制備3個濃度水平質控(quality control, QC)樣品，低濃度質控(low QC, LQC)樣品ABZ、ABZSO、ABZSO2、ABZSO2-NH2濃度分別為18.6、15.6、9.9、25.8 ng/mL，中濃度質控(middle QC, MQC)樣品分別為319.2、2 148.0、1 267.2、440.0 ng/mL， 高濃度質控(high QC, HQC)樣品濃度分別為638.4、4 296.0、2 534.4、880.0 ng/mL。

2.3動物的給藥和血樣采集方法6只健康綿羊，單劑量灌胃給予阿苯達唑脂質體混懸液，給藥劑量為10 mg/kg。給藥前禁食不禁水 12 h，于給藥前和給藥后 0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、12.0、24.0、36.0、48.0、60.0 和 72.0 h 頸靜脈采血，每次取血 5 mL于肝素管中，3 000 r/min 離心 10 min，分離上層血漿，-80℃儲存待測。

2.4血漿樣品的處理取20 μL內標溶液(357.7 ng/mL)，氮氣吹干，加入血漿樣品200 μL，渦旋混勻2 min，超聲處理10 min，加入乙腈800 μL，渦旋混勻2 min，4℃ 12 000 r/min 離心20 min，取上清液2 μL按“2.1”項下色譜與質譜條件分析。

2.5專屬性按“2.1”項下色譜與質譜條件分析，ABZ、ABZSO、ABZSO2、ABZSO2-NH2和內標MBZ保留時間分別為3.81、2.42、2.64、1.27和3.71 min左右，無內源性物質干擾待測組分和內標的測定，具有良好的專屬性。綿羊空白血漿添加ABZ、ABZSO、ABZSO2、ABZSO2-NH2和內標MBZ的標準血漿樣品，口服阿苯達唑脂質體混懸液后血漿樣品的典型色譜圖，見圖6-7。

圖6 空白綿羊血漿添加對照品典型色譜圖

2.6回歸方程的建立取“2.2.2”項下 8 個濃度標準血漿樣品，按“2.4”項下方法操作，以ABZ、ABZSO、ABZSO2、ABZSO2-NH2的標準濃度(C)為橫坐標，ABZ、ABZSO、ABZSO2、ABZSO2-NH2與內標的峰面積比值(Y)為縱坐標，采用最小二乘法進行線性擬合，得線性回歸方程及定量范圍，見表1。

圖7 綿羊口服阿苯達唑脂質體混懸液后血漿樣品典型色譜圖

名稱回歸方程r定量范圍/(ng/mL)ABZY=0.031 8 C+0.588 60.999 56.2～798.0ABZSOY=0.010 9 C+0.834 00.998 15.2～5 370.0ABZSO2Y=0.017 4 C+0.042 00.999 43.3～3 168.0ABZSO2-NH2Y=0.002 8 C+0.220 70.998 88.6～1 100.0

2.7精密度和準確度實驗取 3 個濃度水平的QC樣品，每個濃度平行測定5份，按“2.4”項下方法操作，連續(xù)測定3 d。采用隨行標準曲線計算QC樣品測定濃度，根據測定值與實際值進行計算，考察方法的精密度與準確度。結果顯示，本法ABZ及其3種代謝產物3個質控濃度血漿樣品分析的日內、日間精密度RSD均<15%，準確度偏差均<15%，表明該方法精密度和準確性較好。

2.8回收率和基質效應實驗取3個濃度水平的QC樣品，每個濃度平行測定5份，按“2.4”項下方法操作，測定阿苯達唑及其3種代謝產物峰面積為A；另取空白血漿樣品，加入乙腈(體積比1∶4)，渦旋混勻2 min，4℃ 12 000 r/min，離心20 min，取上清液得空白血漿提取液，按“2.2.1”項下方法處理，制成3 個濃度水平的對照品溶液，每個濃度平行測定5份，測定其峰面積為B；用水-乙腈(體積比1∶4)制成 3 個濃度水平的對照品溶液，每個濃度平行測定5份，測定其峰面積為C，按A/B×100% 計算提取回收率，按B/C×100% 計算基質效應，結果顯示ABZ及其3種代謝產物3個質控濃度提取回收率范圍為95.3%～107.4%，RSD<14.4%；基質效應范圍為95.7%～108.7%，RSD<12.0%；MBZ 提取回收率為103.2%，RSD=7.3%；基質效應為98.5%，RSD=12.3%，表明該方法提取回收率較高,精密度良好,且無基質效應。

2.9稀釋可靠性考察取80 μL制備定量上限(ULOQ)標準血漿樣品的對照品溶液，氮氣吹干，加入空白血漿200 μL復溶，渦旋混勻，制得濃度4倍于ULOQ的標準血漿樣品，平行制備5份樣品，取100 μL，每份添加400 μL空白綿羊血漿稀釋5倍，按“2.4”項下方法操作，采用隨行標準曲線計算稀釋樣品測定濃度，根據測定值與實際值進行計算，考察精密度與準確度。結果顯示準確度和精密度在±8%之內，表明樣品稀釋不影響準確度和精密度，因此濃度高于ULOQ的血漿樣品可以用空白血漿充分稀釋后重新分析。

2.10殘留效應考察進樣分析ULOQ標準血漿樣品后，進樣分析空白血漿樣品，根據峰面積比值進行計算，考察殘留效應。ABZ及其3種代謝產物殘留均小于10%，內標的殘留小于1%，表明該實驗的殘留效應是可以忽略不計的。

2.11穩(wěn)定性實驗

2.11.1 儲備液穩(wěn)定性 將“2.2.1”項下儲備液在室溫(25℃)放置3 h及冷藏條件下(2～8℃)放置15 d的穩(wěn)定性，通過稀釋儲備液，進樣，計算ABZ、ABZSO、ABZSO2、ABZSO2-NH2與內標的峰面積比值，并同新鮮配制的儲備液同法得到的比值相比較，范圍為87.7 %～105.4%，RSD<9.6%，表明儲備液在上述條件下穩(wěn)定。

2.11.2 質控樣品凍融穩(wěn)定性 配制3個濃度水平的QC樣品，-80℃冷凍冰箱儲存?zhèn)溆?，?個濃度水平QC樣品，每個濃度平行測定5份，室溫融化，當完全解凍時，樣品在-80℃條件下再冷凍24 h，重復兩次凍融循環(huán)，在第3個循環(huán)按“2.4”項下方法操作，采用隨行標準曲線計算QC樣品測定濃度，根據測定值與實際值進行計算，考察兩者間的偏差，結果顯示偏差在10%以內，RSD<12.31%，表明樣品的凍融穩(wěn)定性良好。

2.11.3 質控樣品短期穩(wěn)定性 取3個濃度水平的QC樣品，每個濃度平行測定5份，于室溫放置4 h，按“2.4”項下方法操作，采用隨行標準曲線計算QC樣品測定濃度，根據測定值與實際值進行計算，考察兩者間的偏差，結果顯示偏差在15%以內，RSD<14.26%，表明血漿樣品在處理過程中，室溫放置4 h穩(wěn)定性良好。

2.11.4 質控樣品長期穩(wěn)定性 取3個濃度水平的QC樣品，每個濃度平行測定5份，于-80℃冷凍冰箱儲存2個月，按“2.4”項下方法操作，采用隨行標準曲線計算QC樣品測定濃度，根據測定值與實際值進行計算，考察兩者間的偏差，結果顯示偏差在15%以內，RSD<12.14%，表明血漿樣品在-80℃冷凍冰箱儲存1個月穩(wěn)定性良好。

2.11.5 處理后樣品穩(wěn)定性 取3個濃度水平的QC樣品，每個濃度平行測定5份，按“2.4”項下方法操作，置自動進樣器(10℃，24 h)進樣測定，采用隨行標準曲線計算QC樣品測定濃度，根據測定值與實際值進行計算，考察兩者間的偏差，結果顯示偏差在15%以內，RSD<12.37%，表明血漿樣品處理后在自動進樣器(10℃)24 h內穩(wěn)定性良好。

2.12藥代動力學參數的測定取“2.3”項下所采集的血漿樣品，按“2.4”項下處理方法進行前處理，經UPLC-Q-TOF-MS法測定各時間點的血漿藥物濃度，并繪制藥時曲線，見圖8，將血藥濃度-時間數據采用Kinetica 5.1程序進行非房室模型分析，計算藥代動力學參數，見表2。

表2 ABZSO和ABZSO2在綿羊體內的主要藥動學參數

注：Cmax：達峰濃度；Tmax：達峰時間；AUC：血藥濃度-時間曲線下面積；T1/2：消除半衰期；MRT：平均滯留時間；CL：清除率；Vz：表觀分布容積。

圖8 綿羊灌胃給予阿苯達唑脂質體混懸液后ABZSO和ABZSO2的藥時曲線

3 討論

本研究建立了 UPLC-Q-TOF-MS法測定阿苯達唑及其 3 種代謝產物(阿苯達唑亞砜、阿苯達唑砜、阿苯達唑氨基砜)血藥濃度的方法，參考相關生物分析方法驗證指導原則[7-8]對建立的方法進行系統(tǒng)的驗證，結果表明方法靈敏度較高，滿足血藥濃度測定要求。采用乙腈直接沉淀蛋白處理血漿樣品，具有前處理簡單，成本較低等優(yōu)點。綿羊口服阿苯達唑脂質體混懸液后在血漿中均不能檢測到ABZ，這可能與肝臟的首過效應有關；給藥后36、48 h后能檢測到較低濃度ABZSO2-NH2，結果與相關文獻報道一致[9-11]，故本研究未對ABZ及ABZSO2-NH2進行完整的藥代動力學分析。血漿中ABZSO濃度高于ABZSO2，ABZSO是ABZ在綿羊體內的主要代謝產物和抗包蟲的活性成分。本研究為阿苯達唑脂質體混懸液的臨床應用提供有價值的參考，也將為該制劑的進一步開發(fā)利用提供理論依據。