左志貴 王蓉蓉 葉星照 史壹雄 姜有恒 宋華羽 倪士昌 蔣 磊

行新輔助放療后再接受手術(shù)是目前局部進(jìn)展期直腸癌的標(biāo)準(zhǔn)治療策略，但是臨床實(shí)踐中直腸癌單純放射治療(以下簡(jiǎn)稱放療)效果并不理想，對(duì)放療有明顯效果、部分效果和效果不明顯的患者各占約1/ 3左右[1]。對(duì)于沒有明顯效果的患者采用術(shù)前放療則可能導(dǎo)致疾病在治療過(guò)程中進(jìn)展，從而延誤患者手術(shù)治療，將化療與放療聯(lián)合提高了直腸癌術(shù)前單純放療的效果，目前局部進(jìn)展期直腸癌新輔助治療推薦放療與希羅達(dá)聯(lián)合進(jìn)行，但效果仍然不很理想，如何進(jìn)一步提高局部進(jìn)展期直腸新輔助治療的效果一直是結(jié)直腸癌領(lǐng)域基礎(chǔ)及臨床研究的熱點(diǎn)[2，3]。筆者前期研究及國(guó)內(nèi)外其他研究顯示EGFR通路在放療抵抗中發(fā)揮重要作用[4]。那么通過(guò)阻斷EGFR通路可以預(yù)期在既往基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高術(shù)前放化療效果，目前臨床廣泛使用的EGFR通路阻斷劑是西妥昔單抗，本研究旨在通過(guò)細(xì)胞及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)明確EGFR通路阻斷劑西妥昔單抗是否可以在同步化療基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高放療對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的治療效果。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)材料：結(jié)直腸癌細(xì)胞系RKO為溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室傳代獲取，前期已經(jīng)篩選用于實(shí)驗(yàn)的RKO細(xì)胞滿足3個(gè)條件:①EGFR中高表達(dá);②K-ras基因?yàn)橐吧?③PIK3CA基因?yàn)橥蛔冃?。本?shí)驗(yàn)所需4～6周齡BALB/CA裸鼠(SPF級(jí)，雌性)均購(gòu)自上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源中心,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SYXK(瀘)2013-0056；DMEM完全培養(yǎng)液、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Thermo生物公司；CKK-8試劑盒，購(gòu)自碧云天公司；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司，細(xì)胞DNA含量檢測(cè)試劑盒PI/RNase Staining Buffer(細(xì)胞周期檢測(cè))購(gòu)自BD Pharmingen公司。

2.細(xì)胞培養(yǎng)及處理：采用DMEM完全培養(yǎng)液(含15%胎牛血清)，加入100U/ml鏈霉素和100U/ml青霉素培養(yǎng)RKO細(xì)胞，每48h傳代1次，培養(yǎng)條件：5%CO2、37℃。無(wú)菌操作，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

3.CKK-8法檢測(cè)氟尿嘧啶給藥劑量(IC50)：在DMEM培養(yǎng)基中分別加入氟尿嘧啶干預(yù)的濃度梯度為0、5、10、25、50、100μg/ml，藥物干預(yù)48h后對(duì)各個(gè)濃度梯度行CCK8檢測(cè)計(jì)算各個(gè)濃度梯度細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。將各個(gè)濃度與濃度相應(yīng)的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率一起通過(guò)SPSS軟件繪制氟尿嘧啶濃度生長(zhǎng)抑制曲線，取氟尿嘧啶對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率為30%～40%作為該實(shí)驗(yàn)氟尿嘧啶干預(yù)的實(shí)驗(yàn)濃度。最終本研究選取的氟尿嘧啶工作濃度為2.5μg/ml，西妥昔單抗采用文獻(xiàn)普遍采用的濃度100μg/ml。

4.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)成瘤裸鼠氟尿嘧啶及西妥昔單抗給藥劑量的計(jì)算：據(jù)氟尿嘧啶及西妥昔單抗在人體結(jié)直腸癌治療中的給藥劑量，同時(shí)根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)給定的不同種屬動(dòng)物和人有效劑量變異計(jì)算每只裸鼠的給藥劑量。4～6周齡裸鼠體重平均20mg，體表面積平均0.008m2。最終氟尿嘧啶給藥劑量換算為每周氟尿嘧啶給藥總量0.36ml，分兩次給予，每次給予0.18ml，西妥昔單抗每周給藥總量0.4ml，分兩次給予，每次0.2ml。

5.CKK-8法檢測(cè)不同干預(yù)方式對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率：RKO細(xì)胞系藥物分4個(gè)時(shí)段分別給予2Gy放療，2Gy放療聯(lián)合氟尿嘧啶給藥，2Gy放療聯(lián)合西妥昔單抗給藥，2Gy放療聯(lián)合氟尿嘧啶及西妥昔單抗給藥，同時(shí)設(shè)不干預(yù)對(duì)照組。分別在培養(yǎng)24、48、72、96h進(jìn)行 CCK-8檢測(cè)，生長(zhǎng)抑制率(%)=(對(duì)照組A平均值-實(shí)驗(yàn)組A平均值)/對(duì)照組A平均值×100%。

6.細(xì)胞凋亡檢測(cè)不同干預(yù)對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響：取6孔板2Gy照射后12h分別給予2.5μg/ml濃度氟尿嘧啶處理、西妥昔單抗100μg/ml濃度處理、氟尿嘧啶聯(lián)合西妥昔單抗處理，各處理后細(xì)胞系移入37℃孵箱中繼續(xù)孵育48h，隨后離心收集各組細(xì)胞以標(biāo)準(zhǔn)程序用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡情況。

7.細(xì)胞周期檢測(cè)不同干預(yù)對(duì)腫瘤細(xì)胞周期的影響：采用以上相同處理方法處理后細(xì)胞系移入37℃孵箱中繼續(xù)孵育48h，離心收集各組細(xì)胞以標(biāo)準(zhǔn)程序用流式細(xì)胞儀檢測(cè)(MACSQuantTMAnalyzer, Miltenyi Biotec)，一般計(jì)數(shù)2萬(wàn)～3萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，結(jié)果用細(xì)胞周期擬和軟件MACSQuantifyTMversion 2.1分析。

8.裸鼠成瘤模型建立及不同干預(yù)的腫瘤抑制情況：取6周雌性裸鼠36只，體重、體積實(shí)驗(yàn)前大致相同，每只裸鼠右前肢腋部皮下分別緩慢注射1×107/ml RKO細(xì)胞，當(dāng)裸鼠皮下開始緩慢出現(xiàn)腫瘤結(jié)節(jié)，以皮下結(jié)節(jié)直徑達(dá)到0.5cm為成瘤標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)皮下腫瘤體積增大到60～80cm3時(shí)將成瘤成功的30只裸鼠隨機(jī)分成5組，每組6只。裸鼠給藥方式為瘤體內(nèi)多點(diǎn)注射藥物，給藥后每周觀察各實(shí)驗(yàn)組腫瘤生長(zhǎng)情況，用直尺測(cè)量和計(jì)算腫瘤體積，具體測(cè)量數(shù)據(jù)為腫瘤最大直徑(a)和最小直徑(b)，按下列公式計(jì)算體積：V(mm3)=(a×b2)/2，按照計(jì)算數(shù)據(jù)描繪各組裸鼠的腫瘤生長(zhǎng)曲線。注射干預(yù)6周后用脫頸椎發(fā)處死裸鼠，剝下腫瘤，稱重。腫瘤的抑瘤率(%)=(對(duì)照組平均體積-給藥組平均體積)/對(duì)照組平均體積×100%。

結(jié) 果

1.不同干預(yù)處理對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的比較：CCK8檢測(cè)繪制不同干預(yù)方式處理后腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(圖1)。氟尿嘧啶和西妥昔單抗均能提高放療線對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用，但氟尿嘧啶的作用更明顯，氟尿嘧啶與西妥昔單抗同時(shí)與放療聯(lián)合對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用與氟尿嘧啶單獨(dú)與放療聯(lián)合對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用相當(dāng)。

圖1 不同干預(yù)方式腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)曲線比較

對(duì)不同干預(yù)方式處理48h后腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析顯示氟尿嘧啶組及西妥昔單抗各自單獨(dú)聯(lián)合放療均明顯提高了放療對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但氟尿嘧啶聯(lián)合西妥昔單抗與各自單用相比對(duì)提高放療的效果不明顯，抑制率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表1)。

表1 不同干預(yù)方式處理48h后腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率比較

3組之間行方差分析，F(xiàn)=25.12，P=0.001；兩組之間SNK檢驗(yàn)，P=0.15、0.19、0.23；P值均為與放射總量2Gy放療組比較

2.不同干預(yù)處理對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡發(fā)生率的比較：對(duì)給予不同干預(yù)方式處理48h后的RKO細(xì)胞系進(jìn)行凋亡檢測(cè)。流式細(xì)胞儀凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示西妥昔單抗及氟尿嘧啶各自與2Gy放療聯(lián)合均明顯提高了2Gy單獨(dú)放療的凋亡率，氟尿嘧啶與2Gy聯(lián)合提高2Gy單獨(dú)放療凋亡率更加明顯，西妥昔單抗與氟尿嘧啶聯(lián)合對(duì)提高2Gy單獨(dú)放療的凋亡率并不比氟尿嘧啶聯(lián)合對(duì)提高2Gy單獨(dú)放療的凋亡率更明顯(圖2，表2)。

圖2 不同干預(yù)方式處理48h后腫瘤細(xì)胞凋亡發(fā)生率的比較

表2 不同干預(yù)方式處理48h后腫瘤細(xì)胞總凋亡率比較

3.不同干預(yù)處理對(duì)腫瘤周期影響的比較：給予不同干預(yù)方式處理48h后RKO細(xì)胞系進(jìn)行細(xì)胞周期分布檢測(cè)，研究不同干預(yù)方式對(duì)放療引起G1/G0停頓的影響(圖3)。

圖3 不同干預(yù)方式處理48h后腫瘤細(xì)胞周期分布的比較

西妥昔單抗與2Gy放療聯(lián)合明顯降低了G1/G0期腫瘤細(xì)胞比例(P<0.05)，而氟尿嘧啶與2Gy放療聯(lián)合則導(dǎo)致細(xì)胞周期檢測(cè)出現(xiàn)一個(gè)明顯凋亡峰，顯示西妥昔單抗提高放療敏感度主要通過(guò)改變細(xì)胞周期，減少引起對(duì)放療損傷逃逸的G1/G0期細(xì)胞的比例，氟尿嘧啶提高放療敏感度主要通過(guò)增加細(xì)胞凋亡發(fā)生作用(表3)。

表3 西妥昔單抗聯(lián)合放療對(duì)細(xì)胞周期分布的影響

4.不同干預(yù)處理對(duì)裸鼠移植瘤重量影響的比較:各組裸鼠成瘤給予不同干預(yù)6周后采用脫頸法處死裸鼠，解剖游離瘤體后電子秤給予稱重，解剖過(guò)程中注意不要將瘤體中摻雜正常組織。各組移植瘤解剖稱重后計(jì)算各組移植瘤重量平均值，同時(shí)通過(guò)與對(duì)照組平均值比較計(jì)算不同干預(yù)措施對(duì)裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響及各組抑瘤率(表4)。

表4 不同干預(yù)組瘤體重量比較

結(jié)果顯示2Gy+氟尿嘧啶組，2Gy+西妥昔單抗組，2Gy+氟尿嘧啶組+西妥昔單抗組各組瘤體重量均明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而2Gy照射組雖瘤體重量低于對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表5 氟尿嘧啶聯(lián)合放療組與單純放療組瘤體重量比較

研究顯示氟尿嘧啶明顯增加了2Gy放療對(duì)裸鼠移植瘤生長(zhǎng)抑制作用(P<0.05，表5)。西妥昔單抗則沒有明顯增加了2Gy放療對(duì)裸鼠移植瘤生長(zhǎng)抑制作用(P>0.05，表6)。

表6 西妥昔單抗聯(lián)合放療組與單純放療組瘤體重量比較

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),兩藥聯(lián)合放療組與氟尿嘧啶單藥聯(lián)合放療組瘤體重量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表7)，說(shuō)明西妥昔單抗與氟尿嘧啶聯(lián)合并沒有明顯提高氟尿嘧啶單藥與放療聯(lián)合的作用。總體說(shuō)明西妥昔單抗無(wú)論是單藥還是聯(lián)合對(duì)放療敏感度的增加均不明顯。

表7 兩藥同時(shí)聯(lián)合放組與氟尿嘧啶聯(lián)合放療組瘤體重量比較

討 論

放射生物學(xué)研究顯示EGFR通路在放射治療過(guò)程中腫瘤內(nèi)分子生物學(xué)動(dòng)態(tài)變化中發(fā)揮重要作用，參與了放療抵抗，因此當(dāng)EGFR拮抗劑西妥昔單抗應(yīng)用于臨床時(shí)西妥昔單抗開始與放療聯(lián)合治療頭頸部鱗癌，顯示出一定的治療效果[5]。Nasu等[6]研究顯示，C225與放療聯(lián)合可以增加肺癌移植瘤A431的放療效果，Liu等[7]研究也顯示C225與放療聯(lián)合可以增加前列腺癌細(xì)胞的放療敏感度，而Shin等[8]進(jìn)行的體外研究則顯示西妥昔單抗與放療聯(lián)合可以增加結(jié)直腸癌細(xì)胞系的放療敏感度，因此西妥昔單抗與放療聯(lián)合顯示了較好的應(yīng)用前景。

由于氟尿嘧啶與放療聯(lián)合在直腸癌術(shù)前放療中的價(jià)值已經(jīng)得到肯定并在臨床中廣泛應(yīng)用，那么將西妥昔單抗與氟尿嘧啶聯(lián)合，如果能進(jìn)一步提高直腸癌術(shù)前放射治療的效果將具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值，而目前尚無(wú)西妥昔單抗聯(lián)合氟尿嘧啶增加放療效果的基礎(chǔ)研究報(bào)道，筆者希望通過(guò)基礎(chǔ)研究明確西妥昔單抗與氟尿嘧啶聯(lián)合在直腸癌新輔助治療中的價(jià)值。

本研究從細(xì)胞和動(dòng)物水平研究氟尿嘧啶組與西妥昔單抗聯(lián)合對(duì)結(jié)直腸癌放療敏感度的影響，結(jié)果顯示氟尿嘧啶、西妥昔單抗各自單藥以及兩藥聯(lián)合均可以明顯增加2Gy照射對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞系增殖以及裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)抑制作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，氟尿嘧啶聯(lián)合2Gy照射的抑制作用較西妥昔單抗聯(lián)合的抑制作用更強(qiáng)，而且氟尿嘧啶聯(lián)合西妥昔單抗后與單用氟尿嘧啶相比并未明顯增加2Gy照射對(duì)裸鼠移植瘤的抑制作用(P>0.05)。

本研究顯示氟尿嘧啶組與西妥昔單抗聯(lián)合使用并沒有發(fā)揮疊加或協(xié)同作用，西妥昔單抗與氟尿嘧啶聯(lián)合并沒有提高放療的效果。但本研究是細(xì)胞及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，存在明顯的局限性，目前也有一些臨床研究探討了西妥昔單抗用于放療增敏的問(wèn)題，Weiss等[9]研究顯示，將西妥昔單抗與卡培他濱及奧沙利鉑聯(lián)合并沒有進(jìn)一步提高卡培他濱與奧沙利鉑聯(lián)合放療的效果，考慮到西妥昔單抗臨床治療效果與K-ras突變有關(guān)，因此Grimminge等[10]研究局部進(jìn)展期患者中基因表達(dá)與西妥昔單抗聯(lián)合化療提高局部進(jìn)展期術(shù)前放療效果的關(guān)系，結(jié)果顯示治療前EGFR、VEGFR在mRNA水平的表達(dá)以及K-ras突變是西妥昔單抗用于術(shù)前放療增敏效果的有效分子標(biāo)志物。

綜上所述，總體上西妥昔單抗與化療藥聯(lián)合并沒有提高放療的效果，西妥昔單抗的臨床應(yīng)用無(wú)法改變目前氟尿嘧啶與術(shù)前放療聯(lián)合在中低位直腸癌新輔助治療中的主導(dǎo)地位，但考慮到腫瘤的異質(zhì)性，未來(lái)尋找對(duì)西妥昔單抗用于術(shù)前放療增敏效果的有效分子標(biāo)志物將是重要的研究方向。