陳 穎，王存琴，汪 雷，鄭 婷，鄭述梁，黃 超

(皖南醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，安徽 蕪湖 241002)

大葉冬青(IIexlatifolia)又名苦丁茶，系冬青科冬青屬常綠喬木，多分布于浙江、福建、廣西等長(zhǎng)江流域以南的地區(qū)[1]?，F(xiàn)代化學(xué)成分及藥理活性研究發(fā)現(xiàn)，大葉冬青含有三萜及其皂苷、黃酮、多酚等多種化學(xué)物質(zhì)[2-3]，具有降血脂、降血糖、抗氧化等多種生物學(xué)活性[4-7]。由于中藥的化學(xué)成分和作用機(jī)制復(fù)雜，雖有文獻(xiàn)報(bào)道大葉冬青黃酮類成分的提取工藝[8]，但此方法主要針對(duì)黃酮類成分，應(yīng)用范圍有限。而對(duì)大葉冬青多酚類成分的提取工藝研究還未見報(bào)道，且大葉冬青多酚類化學(xué)成分具有顯著的抗氧化活性[9]，具有深入研究的價(jià)值。因此本實(shí)驗(yàn)擬探討大葉冬青葉多酚類化學(xué)成分的最佳提取工藝，選用大葉冬青葉指紋圖譜中的8個(gè)主要活性成分的總峰面積和浸出物含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用正交設(shè)計(jì)方法優(yōu)選出最佳提取工藝，為大葉冬青葉有效物質(zhì)提取和質(zhì)量控制提供理論參考。

1 材料

1.1 儀器與試劑 高效液相色譜儀Agilent Technologies 1260 Infinity Ⅱ(配二極管陣列檢測(cè)器、四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器)，KQ5200E型超聲波清洗機(jī)(工作頻率40 kHz，昆山市超聲儀器有限公司)，AUW220D型1/10萬(wàn)電子天平(日本島津)，色譜乙腈(德國(guó)，默克股份有限公司)，色譜甲醇(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，水為娃哈哈飲用純凈水。

1.2 試藥 新綠原酸(PS13122601-1)、綠原酸(PS14050901)、隱綠原酸(PS14011403)、蘆丁(PS160113-02)、異槲皮苷(PS13061301)、異綠原酸B(PS13111502)、異綠原酸A(PS13111501)和異綠原酸C(PS13110401)對(duì)照品均購(gòu)自成都普思生物科技有限公司，實(shí)驗(yàn)用大葉冬青葉采自安徽省祁門縣，經(jīng)安徽中醫(yī)藥高等專科學(xué)校汪榮斌副教授鑒為為冬青科冬青屬植物大葉冬青I.latifolia的葉。標(biāo)本均存放于皖南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用正交試驗(yàn)法對(duì)大葉冬青藥材提取工藝進(jìn)行優(yōu)選。以甲醇濃度(A)、溶劑倍數(shù)(B)、提取溫度(C)、提取次數(shù)(D)為考察因素，每個(gè)因素選取3個(gè)水平(見表1)，以大葉冬青葉中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、異綠原酸B、異綠原酸A和異綠原酸C 8個(gè)指標(biāo)性成分的總峰面積和浸出物含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)。

表1 大葉冬青葉提取工藝正交試驗(yàn)因素水平

2.2 HPLC含量測(cè)定

2.2.1 配制對(duì)照品溶液 精密稱取對(duì)照品新綠原酸8.40 mg，綠原酸11.40 mg，隱綠原酸8.40 mg，蘆丁22.9 mg，異槲皮苷3.90 mg，異綠原酸B 8.70 mg，異綠原酸A 4.45 mg，異綠原酸C 3.15 mg，分別置5 mL容量瓶中，用50%甲醇超聲溶解并定容至刻度，作為單標(biāo)對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別吸取1 mL至10 mL容量瓶中，50%甲醇定容至刻度作混合對(duì)照品溶液，濃度分別為0.168 g/L、0.228 g/L、0.168 g/L、0.458 g/L、0.078 g/L、0.174 g/L、0.089 g/L、0.063 g/L。4 ℃冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱定大葉冬青葉粉末(100目)2.0 g，精密稱定相同的9份，根據(jù)L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表采用超聲提取法進(jìn)行提取，每次提取時(shí)間50 min，濾過，所得提取液水浴蒸干分別以相應(yīng)的提取溶劑定容至25 mL容量瓶作為樣品溶液。

2.2.3 色譜條件 采用Agilent HC-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱；流動(dòng)相為0.2%磷酸乙腈(A)-0.2%磷酸水(B)進(jìn)行梯度洗脫，梯度洗脫程序：0～15 min，10%A；15～30 min，16%A；30～50 min，18%A；流速1.0 mL/min，柱溫40 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)320 nm。在上述色譜條件下，樣品中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、異綠原酸B、異綠原酸A和異綠原酸C色譜峰的分離度>1.5，保留時(shí)間與對(duì)照品保持一致，混合對(duì)照品及大葉冬青供試品色譜圖見圖1。

1.新綠原酸；2.綠原酸；3.隱綠原酸；4.蘆??；5.異槲皮苷；6.異綠原酸B；7.異綠原酸A；8.異綠原酸C。

2.2.4 精密度試驗(yàn) 精密稱定大葉冬青葉粉末2.0 g，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄HPLC圖。結(jié)果表明8個(gè)指標(biāo)成分色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均<1.44%，相對(duì)峰面積的RSD均<1.90%。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)行色譜分析。記錄HPLC圖，結(jié)果表明8個(gè)指標(biāo)成分色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于1.34%，相對(duì)峰面積的RSD均<1.64%。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同批大葉冬青粉末6份，每份約2.0 g，精密稱定，同法制備供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄HPLC圖。結(jié)果表明8個(gè)指標(biāo)成分色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均<1.86%，相對(duì)峰面積的RSD均<2.28%。

2.3 浸出物含量的測(cè)定 按照2.2.2項(xiàng)下步驟制備樣品溶液，精密移取20 mL置已干燥至恒重并稱重的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干，于105 ℃干燥3 h，移置干燥器中，冷卻30 min，迅速精密稱定質(zhì)量。

2.4 正交試驗(yàn)方案及結(jié)果 選擇L9(34)正交試驗(yàn)表，以選擇的8個(gè)指標(biāo)成分總峰面積為最終評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)其結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。大葉冬青葉8個(gè)指標(biāo)成分的峰面積見表2。同時(shí)參考9組實(shí)驗(yàn)浸出物含量，對(duì)結(jié)果進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。分析結(jié)果見表3～5。

結(jié)合表4、5，對(duì)大葉冬青葉8個(gè)指標(biāo)成分總峰面積和浸出物含量?jī)蓚€(gè)指標(biāo)進(jìn)行分析。在所選因素水平范圍內(nèi)，根據(jù)總峰面積指標(biāo)的因素分析，影響大葉冬青葉提取工藝的因素依次為A>C>D>B，而在方差分析中，溶劑濃度和提取溫度的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中溶劑濃度為主要影響因素，溶劑倍數(shù)與提取次數(shù)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果沒有顯著性影響。而在以浸出物為指標(biāo)的因素分析中影響大葉冬青提取工藝的因素依次為A>B>C>D，且在其方差分析中A、B、C、D 4個(gè)因素差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在以總峰面積為指標(biāo)的直觀分析中，A3>A2>A1，B3>B2>B1，C2>C1>C3，D1>D3>D2，選擇A3B3C2D1為最佳提取條件，即提取溶劑為70%甲醇，溶劑倍數(shù)為50倍，提取溫度為60 ℃，提取次數(shù)為1次，提取時(shí)間50 min。

2.5 工藝驗(yàn)證 根據(jù)正交試驗(yàn)篩選出的最佳工藝條件，進(jìn)行3批工藝驗(yàn)證，結(jié)果見表6。根據(jù)優(yōu)選出的大葉冬青葉最佳制備方法制備出的大葉冬青葉提取液中8個(gè)主要成分的峰面積均較高。正交試驗(yàn)所得結(jié)論與實(shí)際提取結(jié)果相符合，且結(jié)果穩(wěn)定可信。

表2 HPLC色譜圖主要峰峰面積

編號(hào)色譜峰峰面積新綠原酸綠原酸隱綠原酸蘆丁異槲皮苷異綠原酸B異綠原酸A異綠原酸C13644.410323.53466.6875.8219.7505.81631.51922.023725.810008.93873.5814.8347.6831.11364.82172.133373.99179.04067.6740.0245.3961.21175.01814.944167.811981.24032.0985.0347.1805.12012.32948.153230.212095.13856.8987.2411.7665.22378.33073.564140.811187.43994.2882.3298.4818.31689.52592.774068.712344.33799.5936.4296.3499.91684.52481.083703.912069.63674.9986.7371.9637.92437.43065.993582.613824.23941.41111.4434.8700.22921.43361.9

表3 大葉冬青葉正交實(shí)驗(yàn)方案與總峰面積和浸出物含量表

表4 總峰面積與浸出物含量直觀分析表

表5 總峰面積與浸出物含量方差分析表

表6 大葉冬青葉提取工藝驗(yàn)證

3 討論

3.1 提取方法與溶劑的選擇 比較了超聲提取法和加熱回流提取法的提取效率，結(jié)果顯示超聲提取法簡(jiǎn)單方便、易于控制，提取效率也相對(duì)較高。

分別以50%甲醇、70%甲醇、50%乙醇、70%乙醇、水為提取溶劑，其他提取條件相同的情況下，50%甲醇和70%甲醇提取液中各峰面積和分別高于50%乙醇和70%乙醇以及水，因此采用甲醇作為提取溶劑。

3.2 評(píng)價(jià)指標(biāo)的選擇 抗氧化作用是大葉冬青的主要功效之一，本文選用的新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、異綠原酸B、異綠原酸A和異綠原酸C 8個(gè)指標(biāo)性成分具有抗氧化、抗炎、抗菌等作用。浸出物含量是評(píng)價(jià)中藥藥效的另一重要指標(biāo)，其含量的變化會(huì)影響有效成分的含量，并最終影響藥物的藥理作用。選用大葉冬青葉中8個(gè)指標(biāo)成分的總峰面積和浸出物含量聯(lián)合評(píng)價(jià)大葉冬青葉提取工藝更為全面。

本試驗(yàn)以大葉冬青葉中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、異綠原酸B、異綠原酸A和異綠原酸C 8個(gè)主要活性成分的總峰面積和浸出物含量為指標(biāo)，選擇最佳提取工藝，考慮了各指標(biāo)的協(xié)同效應(yīng)，較單一指標(biāo)確定最佳工藝更具有可靠性，同時(shí)也更加科學(xué)、有效、合理。本實(shí)驗(yàn)正交工藝方案簡(jiǎn)單方便，易于結(jié)果統(tǒng)計(jì)，通過工藝驗(yàn)證，優(yōu)化后的提取工藝結(jié)果穩(wěn)定可靠，可為大葉冬青的進(jìn)一步研究開發(fā)提供理論參考。