趙秋陽，馬賢德

腦梗死屬缺血性腦病之一，又叫做缺血性卒中，中醫(yī)稱為中風。近年來的研究表明，炎癥、凋亡、氧化應激等均在腦梗死的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用[1-2]。這一研究成果為腦梗死的多靶點治療提供了理論依據(jù)。百會穴具有醒腦開竅，回陽固脫之功效。四神聰位于百會前、后、左、右各開1寸處，名為四神聰?！秷D翼》中記載：前神聰主治中風、風癇……后神聰同。研究顯示，百會、四神聰配合針刺，對腦梗死患者認知功能障礙具有一定的改善作用[3]。另有文獻報道，針刺百會穴對線栓法大鼠大腦中動脈缺血 (middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型大鼠血清細胞因子具有一定調(diào)控作用，此外該穴位在癲癇等疾病的治療中也具有調(diào)控細胞因子的作用[4-6]。本研究擬通過線栓法制備局灶性腦缺血再灌注大鼠模型，然后給予針刺百會、四神聰穴干預，觀察缺血半暗帶腦組織中白細胞介素1(interleukin-1, IL-1)、白細胞介素6(interleukin-6, IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)的含量，探討針刺百會、四神聰穴對MCAO模型大鼠的抗炎作用。

1 材料和方法

1.1 材料 ①實驗動物：SPF級SD大鼠60只，購自遼寧長生生物科技有限公司(實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(遼)2010-0001)，體質(zhì)量270～330g。實驗動物購入后，于遼寧中醫(yī)藥大學實驗動物中心飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境為SPF級，實驗動物飼養(yǎng)許可證號：SYXK(遼)2013-0009。以常規(guī)顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲水，12h晝夜節(jié)律，適應性飼養(yǎng)1周。②實驗試劑及儀器設備： IL-1、IL-6、TNF-α檢測試劑盒均由武漢優(yōu)爾生商貿(mào)有限公司生產(chǎn)，貨號分別為：SEA563Ra、SEA079Ra、SEA133Ra。酶標儀，Thermo生產(chǎn)；移液器，Thermo生產(chǎn)；恒溫水浴振蕩器，常州國華儀器設備廠生產(chǎn)。

1.2 方法 ①實驗分組：首先將大鼠按照體質(zhì)量進行標記1～60號，然后采用隨機數(shù)字法，將大鼠分為假手術組(15只)和造模組(45只)。然后采用改良線栓法對造模組45只大鼠進行CIRI模型復制，評價模型成功后，再將成功的動物模型隨機分為2組：非穴區(qū)對照組和針刺組。最終實驗分為3組：即假手術組、非穴區(qū)對照組和針刺組。②模型復制：造模組大鼠采用線栓法復制腦缺血再灌注模型，方法參考馬賢德等[7]的文獻，假手術組大鼠實施相同術式，但釣魚線插入深度為1cm，不造成實質(zhì)性栓塞。③模型評價：再灌注后2h，大鼠完全蘇醒后，參考Bederson等[8]的5分制神經(jīng)功能缺損評價標準進行評分，評分標準如下：0分為無癥狀；1分為不能完全伸展對側(cè)前爪；2分為向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3分為向?qū)?cè)傾倒；4分為不能自發(fā)行走，意識喪失。評分為1～3分者納入實驗組，未達標準者排除。再灌注2h后，從假手術組和造模組中各隨機抽取1只，進行TTC染色，觀察梗死灶形成情況，以評價模型復制是否成功。④針刺干預：模型復制成功后，假手術組不做干預。大鼠取穴參考“大鼠穴位圖譜”及“中國獸醫(yī)針灸學”確定[9-10]。針刺組大鼠給予百會、四神聰穴針刺干預，間隔8小時一次，至再灌注72h結(jié)束；非穴區(qū)對照組大鼠分別于百會、四神聰穴區(qū)周邊5mm處進行針刺皮膚干預，間隔8小時一次，至再灌注72h結(jié)束。

1.3 檢測指標 ①神經(jīng)功能缺損評分：末次針刺后1h，對各組大鼠進行神經(jīng)功能缺損評分，評分采用雙盲法，邀請不知情實驗技術人員單獨進行評分，按照各大鼠編號記錄評分。②病理(蘇木素-伊紅染色)：末次針刺后1h，各組隨機抽取2只大鼠，采用過量麻醉法處死，迅速于冰面上取出完整大腦組織，并迅速浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定24h以上，常規(guī)制備石蠟切片，并行蘇木素-伊紅染色，數(shù)碼顯微鏡下觀察病理改變，拍攝照片。③缺血半暗帶腦組織中IL-1、IL-6、TNF-α含量測定：末次針刺后1h，各組剩余大鼠，采用過量麻醉法處死，迅速于冰面上取出完整大腦組織，并用眼科鑷去除缺血區(qū)域液化壞死的腦組織，沿缺血灶走行，剝離缺血灶周邊2mm區(qū)域內(nèi)半暗帶組織，置于2ml凍存管中，-80℃保存，用于檢測IL-1、IL-6、TNF-α含量測定。假手術組取相應部位腦組織進行檢測。采用ELISA法檢測各組大鼠缺血半暗帶腦組織中IL-1、IL-6、TNF-α含量，并進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 模型評價

2.1.1 神經(jīng)功能缺損評分 模型復制后，手術意外及栓塞過重死亡共計4例，假手術組剩余15只，造模組剩余41只，完全清醒后進行神經(jīng)功能缺損評分，結(jié)果顯示：假手術組大鼠神經(jīng)功能缺損評分均為0分，造模組大鼠2例評分為0分，不符合實驗要求，予以剔除，剩余39只。與假手術組比較，造模組大鼠神經(jīng)功能缺損評分顯著增高(P<0.01)。見表1。

表1 造模后2組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較 分，

與假手術組比較，aP<0.01

2.1.2 TTC染色 再灌注后2h，從假手術組和造模組中各隨機抽取1只大鼠，過量麻醉處死取腦，進行TTC染色，結(jié)果顯示：假手術組大鼠腦組織呈鮮紅色，未見明顯蒼白區(qū)；造模組大鼠右側(cè)顳葉區(qū)呈蒼白色，為梗死灶所在(見圖1)。

圖1 再灌注后2組大鼠腦組織梗死灶TTC染色

2.2 大鼠一般狀態(tài)觀察

2.2.1 生存情況 模型評價后，將模型復制成功的39只大鼠隨機分為2組，非穴區(qū)對照組20只、針刺組19只。針刺干預期間，非穴區(qū)對照組死亡5只，針刺組死亡3只。假手術組大鼠傷口基本愈合，活動度良好，毛色純白，富有光澤。非穴區(qū)對照組大鼠精神狀態(tài)較差，毛色枯槁無光澤，活動較少。針刺組大鼠精神狀態(tài)尚可，活動范圍較小，但活動度明顯好于非穴區(qū)對照組。

2.2.2 神經(jīng)功能缺損評分 針刺干預后，各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分統(tǒng)計結(jié)果顯示：與假手術組比較，非穴區(qū)對照組和針刺組大鼠神經(jīng)功能缺損評分顯著升高(P<0.01)；與非穴區(qū)對照組比較，針刺組大鼠神經(jīng)功能缺損評分顯著降低(P<0.01)。見表2。

表2 干預后3組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較 分，

與假手術組比較，aP<0.01；與非穴區(qū)對照組比較，bP<0.01

2.3 3組大鼠腦組織病理變化 各組大鼠腦組織HE染色結(jié)果顯示：假手術組大鼠腦組織未見異常；非穴區(qū)對照組大鼠腦組織因液化壞死而出現(xiàn)局部脫片現(xiàn)象(照片中箭頭所示)，高倍鏡下可見大量炎性細胞浸潤(照片中黑色三角所示)，梗死區(qū)內(nèi)可見細胞萎縮壞死，半暗帶組織中可見細胞水腫等改變；針刺組大鼠腦組織梗死灶區(qū)域也出現(xiàn)脫片現(xiàn)象，但與非穴區(qū)對照組比較，范圍明顯變小，高倍鏡下炎性細胞浸潤程度減輕(見圖2)。

假手術組 非穴區(qū)對照組 針刺組

2.4 3組大鼠缺血半暗帶腦組織中IL-1、IL-6、TNF-α含量比較 檢測結(jié)果顯示：與假手術組比較，非穴區(qū)對照組和針刺組大鼠缺血半暗帶腦組織中IL-1、IL-6、TNF-α含量顯著升高(P<0.01)；與非穴區(qū)對照組比較，針刺組大鼠缺血半暗帶腦組織中IL-1、IL-6、TNF-α含量顯著降低(P<0.01)。見表3。

表3 干預后3組大鼠缺血半暗帶腦組織中IL-1、IL-6、TNF-α含量比較

與假手術組比較，aP<0.01，與非穴區(qū)對照組比較，bP<0.01

3 討論

腦梗死因高發(fā)病率、高致死率和高致殘率而受到腦血管病研究者們的高度重視。早在1986年，Bederson等[8]就采用線栓法成功復制出與臨床腦梗死疾病高度相似的動物模型。本研究采用的動物模型復制方法為改良線栓法。結(jié)果證明，造模組大鼠神經(jīng)功能缺損評分顯著高于假手術組，并且隨機抽取的大鼠腦組織TTC染色也在造模組大鼠腦切片上檢測到明顯的蒼白區(qū)，證實模型復制成功。

本實驗結(jié)果驗證了針刺百會、四神聰穴對缺血性腦病的良好療效：與假手術組比較，非穴區(qū)對照組和針刺組大鼠神經(jīng)功能缺損評分及腦組織梗死百分比顯著升高；與非穴區(qū)對照組比較，針刺組顯著降低了MCAO模型大鼠神經(jīng)功能缺損評分及腦組織梗死百分比。病理結(jié)果顯示：假手術組大鼠腦組織未見異常；非穴區(qū)對照組大鼠腦組織因液化壞死而出現(xiàn)局部脫片現(xiàn)象，高倍鏡下可見大量炎性細胞浸潤，梗死區(qū)內(nèi)可見細胞萎縮壞死，半暗帶組織中可見細胞水腫等改變；針刺組大鼠腦組織梗死灶區(qū)域也出現(xiàn)脫片現(xiàn)象，但與非穴區(qū)對照組比較，范圍明顯變小，高倍鏡下炎性細胞浸潤程度減輕。結(jié)果提示，針刺百會、四神聰穴對MCAO模型大鼠的腦保護作用主要在于能夠減輕梗死區(qū)及缺血半暗帶腦組織中的炎癥反應。

免疫細胞的增殖、分化以及生物學作用的發(fā)揮受到一系列細胞因子的調(diào)節(jié)。根據(jù)細胞因子結(jié)構的同源性可將其分為幾個蛋白質(zhì)家族：如IL-1家族、IL-6家族、腫瘤壞死因子家族、IL-10家族和造血因子家族等[11]。IL-1是一種致炎細胞因子，廣泛參與了人體組織破壞、水腫形成等多種病理損傷過程。研究表明，IL-1具有明顯的促炎作用，又被稱為前沿性細胞因子。IL-1在腦梗死的發(fā)生的早期，發(fā)揮著重要的致炎作用[12-13]。IL-6主要由活化的T淋巴細胞和成纖維細胞分泌，其最主要的生物學作用也是促炎作用，此外還具有刺激B淋巴細胞產(chǎn)生抗體等免疫學功能。研究表明，IL-6在腦梗死發(fā)生發(fā)展過程中也發(fā)揮著重要的促炎作用[14]。TNF，主要由活化的巨噬細胞分泌，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α具有介導炎癥反應和調(diào)節(jié)細胞增殖分化的功能。近年來的研究表明，在腦梗死的發(fā)生早期，也有TNF-α參與其中，主要發(fā)揮介導炎癥反應的作用[15]。

本研究結(jié)果顯示，非穴區(qū)對照組和針刺組大鼠缺血半暗帶腦組織中IL-1、IL-6、TNF-α含量顯著升高，針刺百會、四神聰穴干預后，含量顯著降低。結(jié)果提示，當腦缺血損傷發(fā)生時，缺血半暗帶腦組織中迅速發(fā)生了炎癥反應，缺血半暗帶腦組織中IL-1、IL-6、TNF-α含量迅速升高。而針刺百會、四神聰穴干預后，IL-1、IL-6、TNF-α含量顯著降低，說明針刺百會、四神聰穴對IL-1、IL-6、TNF-α的分泌具有一定的抑制作用，從而發(fā)揮針刺對MCAO模型大鼠的腦保護作用。

綜上所述，針刺百會、四神聰穴對MCAO模型大鼠具有一定的抗炎作用，該作用可能是通過抑制缺血半暗帶腦組織中IL-1、IL-6、TNF-α分泌而實現(xiàn)的，但其抑制IL-1、IL-6、TNF-α分泌的具體機制尚需進一步研究。