陳嘉偉 王衛(wèi)龍 丁雪瑞 趙倩倩 安曉剛 王人鳳 盧連軍

耳聾是人類最常見的感覺神經(jīng)系統(tǒng)疾病，全世界有超過50%的先天性耳聾由遺傳因素導(dǎo)致[1]?；蛑委熼L期以來被認(rèn)為是治療遺傳性感音神經(jīng)性耳聾的潛在方法之一，選擇正確的基因載體及合適的載體導(dǎo)入途徑是基因治療的兩個(gè)關(guān)鍵因素。利用病毒載體將外源基因?qū)氩溉閯?dòng)物內(nèi)耳的研究已有廣泛報(bào)道[2～4]，腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus，AAV)由于其免疫原性低、對人類無致病性以及穩(wěn)定表達(dá)時(shí)間長等特點(diǎn)，已經(jīng)成為研究基因治療最常用的病毒載體。小鼠是研究遺傳發(fā)育與疾病發(fā)生最常用的模型動(dòng)物，多種基因修飾小鼠模型的建立為研究遺傳性耳聾帶來了極大便利[5]；然而，由于小鼠耳蝸體積小、存在鐙骨動(dòng)脈等因素，給手術(shù)操作帶來了一定的困難；因此，采用合適的方法將病毒載體導(dǎo)入內(nèi)耳并表達(dá)是基因治療遺傳性耳聾的基礎(chǔ)。本研究采用耳后入路經(jīng)圓窗膜鼓階顯微注射的方法，將帶有綠色熒光蛋白基因的重組腺相關(guān)病毒AAV2/9-GFP導(dǎo)入小鼠耳蝸鼓階，觀察其在內(nèi)耳的表達(dá)，為遺傳性耳聾的基因治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 攜帶綠色熒光蛋白(ZsGreen1)的重組腺相關(guān)病毒(AAV2/9-GFP，滴度1.6×1012vg/ml)，購自上海漢恒生物科技有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康的5～6周齡野生型C57BL/6J小鼠24只，雌性，體重15～20 g(由空軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)。隨機(jī)分為三組：實(shí)驗(yàn)組12只，人工外淋巴液組6只，均以左耳為手術(shù)耳，分別注射AAV2/9-GFP和人工外淋巴液；空白對照組6只，正常飼養(yǎng)，不做任何處理。

1.3內(nèi)耳顯微注射方法 動(dòng)物用4%水合氯醛10 ml/kg體重腹腔注射麻醉成功后，置于37 ℃電熱板維持體溫，眼部涂抹少量紅霉素眼膏保持角膜濕潤，左側(cè)耳后備皮。動(dòng)物取右側(cè)臥位，術(shù)區(qū)以碘伏消毒，周圍覆蓋無菌紗布，在手術(shù)顯微鏡下，用眼科剪于耳后1～2 mm處剪開皮膚及皮下組織(圖1a)，暴露耳大神經(jīng)及胸鎖乳突肌(圖1b和c)，向上分離牽開胸鎖乳突肌，可見位于其深面的顱外段面神經(jīng)及二腹肌后腹(圖1d)；向后鈍性分離二腹肌后腹，暴露聽泡后壁(圖1e)，用顯微鑷挑除部分聽泡后壁骨質(zhì)，暴露圓窗龕及其下方的鐙骨動(dòng)脈(圖1f)；用拉制好的玻璃微管穿刺圓窗膜，可見外淋巴液流出(圖1g)，等待3～5分鐘直至外淋巴液外流減緩，用微量上樣針(Eppendorf Microloader)經(jīng)圓窗膜向鼓階內(nèi)緩慢注射2 μl AAV2/9-GFP或人工外淋巴液(圖1h)；取一塊筋膜組織迅速封閉圓窗龕，脂肪塊封閉聽泡骨壁缺損，復(fù)位耳后肌肉，用5-0可吸收縫線分層縫合切口，碘伏消毒切口皮膚。

1.4聽性腦干反應(yīng)(ABR)測試 三組動(dòng)物術(shù)后均存活，術(shù)后第21 d進(jìn)行ABR測試。測試儀器為TDT system3(Tucker-Davis Technologies，美國)，小鼠麻醉后置于隔聲室內(nèi)，取俯臥位，記錄電極置于顱頂正中，參考電極置于耳后，地線接尾部；選用短純音(tone burst)為刺激聲，上升/下降平臺為10 ms，疊加1 024次，給聲強(qiáng)度從90 dB以5 dB遞減，依次測試4、8、16、32 kHz，以能重復(fù)引出可辨波Ⅰ的最小刺激強(qiáng)度為反應(yīng)閾。

1.5耳蝸解剖及免疫熒光染色 術(shù)后21 d完成ABR測試后處死動(dòng)物，迅速剪下頭部，沿枕骨大孔剪開頂骨，去除腦組織，向兩側(cè)分開暴露顳骨內(nèi)面，取出耳蝸置于4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液中，在體式顯微鏡下摘除鐙骨，開放前庭窗與蝸窗，并于蝸頂打孔，4 ℃固定過夜；10%EDTA溶液4 ℃脫鈣7 d(每2～3 d換液一次)；在體式顯微鏡下用Vannas彈簧剪將耳蝸分為底回、中回、頂回三部分，去除蝸殼、螺旋韌帶及前庭膜，將耳蝸基底膜移入96孔板。

耳蝸基底膜用1%TritonX-100透化15 min，PBS漂洗3遍(每次5 min)，5%驢血清封閉45 min。PBS漂洗3遍(每次5 min)，加入1∶1 000稀釋兔源Myosin VIIa一抗(Proteus Bioscience，美國)50 μl，4 ℃孵育48 h。PBS漂洗3遍(脫色搖床，30 min)，加入1∶200稀釋驢抗兔594 nm二抗(Thermo Fisher Scientific，美國)50 μl，4℃避光孵育過夜；PBS漂洗3遍(脫色搖床，30 min)，加入50 μl DAPI室溫30 min；PBS漂洗3遍(每次5min)，80%甘油溶液封片，激光共聚焦顯微鏡(Nikon，日本)觀察并拍照。以200 μm為計(jì)數(shù)單位對基底膜各段內(nèi)毛細(xì)胞總數(shù)及GFP陽性內(nèi)毛細(xì)胞個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。

圖1 耳后徑路經(jīng)圓窗膜鼓階顯微注射的手術(shù)步驟 a.皮膚切口;b和c.剪開皮膚和皮下組織可見:耳大神經(jīng)(GAN),胸鎖乳突肌(SCM);d.牽開胸鎖乳突肌,可見位于深面的面神經(jīng)(FN)和二腹肌后腹(PBD);e.向后鈍性分離二腹肌后腹,暴露聽泡后壁(TB);f.挑除部分聽泡后壁骨質(zhì),暴露圓窗龕(RWN)及其下方的鐙骨動(dòng)脈(SA);g.用玻璃微管(MP)穿刺圓窗膜;h.用微量上樣針(ML)經(jīng)圓窗膜向鼓階內(nèi)注射病毒載體

圖2 實(shí)驗(yàn)組耳蝸基底膜鋪片激光共聚焦顯微鏡觀察 轉(zhuǎn)染21 d后可見耳蝸基底膜底回至頂回均有GFP表達(dá),主要轉(zhuǎn)染內(nèi)毛細(xì)胞,轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞呈逐漸減少的趨勢(×600)

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 三組動(dòng)物各頻率ABR閾值差異比較采用SPSS23軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，兩兩比較采用LSD法，各段耳蝸基底膜內(nèi)毛細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率差異比較采用3×2表χ2檢驗(yàn)(Chi-square test)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

術(shù)后動(dòng)物均存活，未見步態(tài)不穩(wěn)、頭部傾斜等前庭功能障礙表現(xiàn)。

2.1各組ABR反應(yīng)閾比較 實(shí)驗(yàn)組及人工外淋巴液組動(dòng)物左耳ABR各頻率閾值均不同程度升高，與空白對照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組與人工外淋巴液組動(dòng)物左耳ABR各頻率反應(yīng)閾比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；各組動(dòng)物右耳ABR各頻率反應(yīng)閾比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

2.2耳蝸組織大體觀察 各組動(dòng)物取材時(shí)見中耳腔清潔、干燥，無炎癥反應(yīng)及膿、血性分泌物，聽骨鏈完整。圓窗龕內(nèi)填塞的筋膜已纖維化，部分動(dòng)物圓窗龕內(nèi)可見少許陳舊血性分泌物。

表1 各組動(dòng)物術(shù)后21 d左、右耳tb-ABR各頻率反應(yīng)閾

2.3耳蝸基底膜激光共聚焦顯微鏡觀察 鏡下可見耳蝸基底膜上整齊排列的一排內(nèi)毛細(xì)胞與三排外毛細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物左耳從基底膜底回至頂回均可見GFP表達(dá)，轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞呈逐漸減少的趨勢(圖2)；底回、中回及頂回的內(nèi)毛細(xì)胞平均轉(zhuǎn)染效率從高到低分別為82.7%、75.0%、44.7%，底回與頂回、中回與頂回轉(zhuǎn)染效率比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，底回與中回轉(zhuǎn)染效率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。AAV2/9-GFP主要轉(zhuǎn)染內(nèi)毛細(xì)胞，轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞形態(tài)正常，未見萎縮、脫落等細(xì)胞毒性表現(xiàn)；外毛細(xì)胞未見GFP表達(dá)。實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物對側(cè)耳、人工外淋巴液組及空白對照組均未見GFP表達(dá)。

3 討論

在基因治療遺傳性耳聾的研究中，腺病毒(adenovirus，Ad)和腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus，AAV)是兩種常用的病毒載體，但腺病毒轉(zhuǎn)染后不整合至宿主細(xì)胞內(nèi)，維持表達(dá)時(shí)間短，且腺病毒的免疫原性較高，這些都限制了其在基因治療中的應(yīng)用[6]。腺相關(guān)病毒能夠有效轉(zhuǎn)染內(nèi)耳毛細(xì)胞、支持細(xì)胞并整合至宿主的基因組上，使外源基因在宿主細(xì)胞內(nèi)長期穩(wěn)定表達(dá)，改變細(xì)胞表型，糾正遺傳缺陷[7,8]。腺相關(guān)病毒是復(fù)制缺陷病毒，免疫原性極低，對人類無致病性，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明其無耳毒性[3]，是遺傳性耳聾基因治療的理想載體。不同血清型的腺相關(guān)病毒對動(dòng)物內(nèi)耳的轉(zhuǎn)染能力有一定差異[9]，有研究表明腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染內(nèi)耳主要局限于內(nèi)毛細(xì)胞，而外毛細(xì)胞幾乎沒有轉(zhuǎn)染[10,11]；本研究結(jié)果與之類似。Bence等[12]發(fā)現(xiàn)外泌體相關(guān)腺相關(guān)病毒(exosome-associated AAV)具有比傳統(tǒng)腺相關(guān)病毒更高的轉(zhuǎn)染效率，并能夠轉(zhuǎn)染外毛細(xì)胞，這可能成為遺傳性耳聾基因治療的一個(gè)發(fā)展方向。本研究采用AAV2/9-GFP作為載體，經(jīng)圓窗膜鼓階顯微注射轉(zhuǎn)染小鼠耳蝸，于術(shù)后21天觀察，發(fā)現(xiàn)從耳蝸底回到頂回內(nèi)毛細(xì)胞均可見GFP表達(dá)，且實(shí)驗(yàn)組與人工外淋巴液組術(shù)耳ABR反應(yīng)閾無差異，說明其安全，無耳毒性。

小鼠是研究遺傳性耳聾的理想模型動(dòng)物，但由于其耳蝸體積小，術(shù)中觀察、操作較為困難。此外，與人類不同的是，嚙齒類動(dòng)物的鐙骨動(dòng)脈在出生后不發(fā)生退化，其從頸內(nèi)動(dòng)脈分出后穿過二腹肌后腹進(jìn)入聽泡，緊鄰圓窗龕的正下方走行，并穿過鐙骨兩弓之間，如術(shù)中不慎損傷會發(fā)生難以控制的大出血[13，14]。本研究操作過程中的體會是：在暴露聽泡時(shí)，應(yīng)將二腹肌后腹從聽泡表面鈍性向后分離，充分暴露聽泡后壁，從面神經(jīng)穿出聽泡處(莖乳孔)的后上方挑開部分骨壁，即可直接暴露圓窗龕及其下方的鐙骨動(dòng)脈；穿刺圓窗膜之前，如果中耳腔有出血，應(yīng)用明膠海綿拭凈，防止血液沿圓窗進(jìn)入內(nèi)耳。穿刺圓窗膜后可見外淋巴液流出，等待數(shù)分鐘至其外流停止再進(jìn)行注射，可以防止外淋巴液將病毒載體沖出而導(dǎo)致注射失敗。整個(gè)操作過程中應(yīng)注意保護(hù)面神經(jīng)，防止因損傷面神經(jīng)造成動(dòng)物術(shù)后無法閉眼、正常進(jìn)食甚至死亡。

耳蝸經(jīng)固定、脫鈣后，基底膜脆性增加，在去除蝸殼和螺旋韌帶的過程中極易發(fā)生基底膜損傷和斷裂。此外，由于小鼠的蝸管圍繞蝸軸盤旋2周，豚鼠蝸管盤旋可達(dá)4周[15]，將整個(gè)基底膜直接鋪片易發(fā)生褶皺、重疊，影響之后的染色觀察。本研究采用“分段鋪片”法，先將耳蝸分為底、中、頂回三部分，再沿外側(cè)螺旋溝一并剪除螺旋韌帶及蝸殼；此方法可操作性強(qiáng)，不易損傷基底膜，鋪片時(shí)不發(fā)生折疊，并可對同一基底膜進(jìn)行不同標(biāo)記物的染色觀察。

內(nèi)耳基因?qū)氲氖中g(shù)入路一般有耳后入路和腹側(cè)入路[16]。常用的載體導(dǎo)入途徑有經(jīng)圓窗膜穿刺鼓階導(dǎo)入、經(jīng)耳蝸開窗鼓階或中階導(dǎo)入、完整圓窗膜滲透導(dǎo)入、經(jīng)后半規(guī)管開窗導(dǎo)入等。經(jīng)圓窗膜穿刺鼓階導(dǎo)入途徑解剖標(biāo)志清晰、導(dǎo)入確切、可操作性強(qiáng)，但由于破壞了圓窗膜的完整性，術(shù)后可能遺留聽力損失[17,18]。經(jīng)耳蝸開窗導(dǎo)入途徑保留了完整的圓窗膜，但在打孔時(shí)可能造成耳蝸基底回?fù)p傷，從而導(dǎo)致高頻聽力損失[19]；該方法可導(dǎo)入鼓階或中階，小鼠耳蝸中階內(nèi)淋巴液體積約為0.19 μl，前庭階和鼓階外淋巴液體積約為0.6 μl，可根據(jù)所需病毒的體積選擇導(dǎo)入部位[20]。完整圓窗膜滲透導(dǎo)入途徑是將浸有病毒載體的明膠海綿填塞于圓窗龕內(nèi)，病毒載體依靠滲透作用透過圓窗膜導(dǎo)入鼓階外淋巴液，其轉(zhuǎn)染效率較低。最近有研究發(fā)現(xiàn)利用膠原酶或透明質(zhì)酸預(yù)先處理圓窗膜后進(jìn)行完整圓窗膜滲透導(dǎo)入，轉(zhuǎn)染效率接近經(jīng)圓窗膜穿刺或經(jīng)耳蝸開窗導(dǎo)入途徑，且保留了內(nèi)耳的完整性，無聽力損失[21,22]。經(jīng)后半規(guī)管開窗導(dǎo)入途徑是在后半規(guī)管骨壁打孔，將病毒載體導(dǎo)入內(nèi)耳，對前庭和耳蝸均有較高的轉(zhuǎn)染效率；此方法無需打開聽泡，保留了正常的中耳結(jié)構(gòu)，能夠更好地保存聽力，缺點(diǎn)是無法確切辨認(rèn)導(dǎo)入至內(nèi)淋巴液或外淋巴液，且可能造成前庭功能損傷[23,24]。本研究采用經(jīng)圓窗膜鼓階顯微注射導(dǎo)入載體，取得了良好的轉(zhuǎn)染效率，但術(shù)耳的ABR反應(yīng)閾較空白對照組升高。

本研究發(fā)現(xiàn)AAV2/9-GFP經(jīng)圓窗膜鼓階顯微注射后在耳蝸底回、中回的轉(zhuǎn)染效率高于頂回，可能與病毒載體的導(dǎo)入位點(diǎn)有關(guān)，經(jīng)圓窗膜途徑導(dǎo)入使靠近底回的外淋巴液中病毒滴度較高，而較難擴(kuò)散至頂回。本研究中實(shí)驗(yàn)組和人工外淋巴液組動(dòng)物術(shù)側(cè)耳在術(shù)后均發(fā)生了聽力損失，分析其可能的原因有：①液體注射過程對內(nèi)耳造成的機(jī)械損傷；②圓窗封閉或圓窗發(fā)生骨化，限制了外淋巴液的波動(dòng)；③聽泡骨壁缺損處填塞的脂肪塊影響聽骨鏈的正?；顒?dòng)。因此，如何在導(dǎo)入外源基因的同時(shí)維持正常的中耳及內(nèi)耳結(jié)構(gòu)、避免發(fā)生聽力損失是一個(gè)值得深入研究和探討的問題。

本研究采用經(jīng)圓窗膜鼓階顯微注射的方法將AAV2/9-GFP導(dǎo)入小鼠耳蝸，結(jié)果顯示其能夠在內(nèi)耳毛細(xì)胞中表達(dá)，且轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，說明該方法可行，為研究腺相關(guān)病毒載體在遺傳性耳聾基因治療中的臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。