禹曉婷，蘇 偉*，齊 琦，姜 麗

（1.貴州大學生命科學學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025）

中國酒曲歷史悠久，品種多樣，酒曲的種類及品質決定著酒體的風格、香味物質以及營養(yǎng)成分的組成，因此有“曲乃酒之骨”和“好曲出好酒”的說法[1-3]，而藥曲則是指制曲時加入中藥材。中藥材在傳統(tǒng)藥曲制作中有長期和廣泛的應用。制曲添加中藥材，一方面可以抑制雜菌、促進有益微生物的生長代謝；另一方面也賦予發(fā)酵食品一定的風味，還有一個重要目的是開發(fā)保健功效[4]。在《齊民要術·河東神曲方》、《白醪曲》、《北山酒經(jīng)》和《蘇軾·酒經(jīng)》中均有用藥制曲的記載，因此有“無藥不成曲”的說法[5-7]。趙申升[8]、羅歆[9]、李新社[10]等均在制曲時加入一定比例的中藥材，得到了糖化能力和液化能力較高的中藥曲。在越南，人們添加肉豆蔻皮、甘草根、細辛、白豆蔻果、茴香和丁香等制曲，主要目的是加強香氣，抑制有害微生物的生長[11]。

傳統(tǒng)酒曲制作大多是以麩皮或者谷物為基質，不添加任何外加基質，通過自然接種微生物，所制得酒曲微生物種類繁多，品質參差不齊，加上工藝落后，生產(chǎn)環(huán)境差，設備簡陋，造成在米酒發(fā)酵過程中常常伴有雜菌污染，使米酒品質不穩(wěn)定，因此Yu等[12]利用分離的米曲霉CJCM-4對米曲的制備進行優(yōu)化。根霉是小曲的最主要糖化菌[13]，對發(fā)酵酒乙醇、高級醇含量等都有顯著影響，同時還具備產(chǎn)多種脂及多種有機酸的能力，對米酒的質量和風味有重要影響[14-15]。本研究采用純種根霉和酵母接種到藥食同源基質制曲，既可以避免發(fā)酵過程中雜菌污染嚴重的問題，又可以通過新基質賦予酒體豐滿風味，同時增加保健功效，趙婷婷等[16]利用1 株產(chǎn)香酵母協(xié)同米根霉發(fā)酵，生產(chǎn)出滋味豐富的米酒。

本研究以枸杞、覆盆子、山藥、酸棗仁、芡實、沙棘、干姜、甘草、桑葚、人參、牛蒡根和瑪卡12 味藥食同源的物質作為制曲基質，該12 味中藥材有滋陰補腎、開胃健脾、通達氣血等作用。通過將其制成酒曲，在微生物作用下使藥材中的有效成分充分釋放，并隨著發(fā)酵進入酒體，以期達到增加米酒營養(yǎng)成分的效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

各藥材質量分數(shù)：瑪卡33.5%、人參6.7%、酸棗仁3.3%、牛蒡根6.7%、甘草3.3%、干姜3.3%、芡實6.7%、山藥6.7%、桑葚子2.0%、覆盆子4.5%、枸杞20.0%、沙棘3.3%。以上藥材均為市購，粉碎混合后干燥，密封備用（工廠已粉碎完成）。

Z-20根霉曲（傳統(tǒng)曲） 四川瀘州市釀酒科學研究所；增香酵母 貴州輕工釀酒研究所；三氯甲烷美國天地公司；愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚、對乙基苯酚、苯酚、2-甲酚 德國DR公司；28 種標準物質和內(nèi)標物乙酸丁酯 國家標準物質中心；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

Trace GC Ultra-DSQ MS氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用儀、固相萃取C18柱（1 000 mg/6 mL） 美國賽默飛世爾公司；FA2004N電子天平 上海菁海儀器有限公司；DHP-420型電熱恒溫培養(yǎng)箱 天津天泰儀器有限公司；HHS6型電熱恒溫水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司；DK-98-II型電子調溫萬用爐 天津市泰斯特儀器有限公司；MB90型水分測定儀 奧豪斯儀器（常州）有限公司；L5S紫外-可見分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 材料預處理

市購當年生長藥材，洗凈挑出雜質，干燥并粉碎，干燥后藥材自身含水量在10%～13%為最佳，密封備用。

1.3.2 制曲工藝流程及操作要點

1.3.2.1 制曲工藝流程

取粉碎后藥材潤料0.5 h→蒸煮上汽10 min→迅速降溫并打撒→裝入三角瓶→接種根霉和酵母→三角瓶恒溫培曲→扣瓶1 次（24 h左右）→出曲低溫烘干→密封保藏

1.3.2.2 制曲操作要點

選用品質上佳的各藥食同源藥材并粉碎，混合均勻。潤料，控制含水量，浸潤藥材30 min，上鍋蒸煮至上汽，10 min后取出迅速打散并降溫至25～30 ℃裝入滅菌三角瓶。根據(jù)藥材質量接入根霉與酵母，混合均勻。三角瓶恒溫培養(yǎng)24 h左右瓶內(nèi)布滿菌絲，菌絲聯(lián)結基質成塊后翻曲。再經(jīng)12 h左右生長完成。取出實驗曲于在低于40 ℃培養(yǎng)箱中逐步升溫干燥。若出現(xiàn)黑灰色孢子，則說明基質水分過高，應減少潤料水分。

1.3.3 最佳酵母接種量的選擇

接種酵母是為充分分解藥材中的蛋白質，降低米酒中沉淀物質，同時增加米酒中氨基酸含量[17]。酵母能夠以乙醇為碳源，具備乙醇發(fā)酵能力和醋酸發(fā)酵能力，能產(chǎn)生以酯香為主的多種香味物質[18]，在根霉接種量0.3%、培曲時間40 h、基質含水量65%和培曲溫度28 ℃條件下，選擇酵母接種量為藥材干質量的0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%，以曲液化酶活力為指標，選擇最佳酵母添加量。

1.3.4 單因素試驗

固定根霉接種量0.3%、培曲時間40 h、基質含水量65%和培曲溫度28 ℃為單因素試驗條件，以糖化酶、液化酶活力值為評價指標，選擇根霉接種量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，以藥材干質量計）、培曲時間（32、36、40、44、48 h）、基質含水量（55%、60%、65%、70%、75%）、培曲溫度（26、28、30、32、34 ℃）4 個因素進行單因素試驗，考察各因素對產(chǎn)酶能力的影響。

1.3.5 制曲工藝響應面優(yōu)化試驗

在單因素試驗的基礎上，以基質含水量、根霉接種量、培曲時間和培曲溫度4 個因素為自變量，以糖化酶活力為響應值，根據(jù)Box-Behnken試驗設計原理進行4因素3水平試驗設計，并進行數(shù)據(jù)擬合優(yōu)化制曲工藝[19-20]，試驗因素水平見表1。

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels used in response surface methodology

1.3.6 實驗曲指標測定

含水量的測定：采用干燥法[21]；糖化酶、液化酶活力測定：采用文獻[22]方法；蛋白酶活力測定：采用SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測定法》方法；纖維素酶測定：采用二硝基水楊酸法[23]；果膠酶測定：采用分光光度法[24]；脂肪酶活力測定：參考GB/T 23535—2009《糧食、油料的脂肪酶活動度的測定》方法。

1.3.7 米酒揮發(fā)性成分的測定

米酒揮發(fā)性成分測定具體方法參照文獻[25-27]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert V8.0.6響應面設計軟件Origin 8.0和IBM SPSS Statistics 25進行數(shù)據(jù)處理，結果以 ±s表示。

2 結果與分析

2.1 酵母最佳接種量的確定

由圖1可知，當酵母添加量為1.5%時，曲液化酶活力達到最大值（1.32±0.032）g/（g·h），此時α-淀粉酶將淀粉水解為糊精及少量麥芽糖和葡萄糖，發(fā)酵液濃度和黏度降低。酵母添加量過少，導致藥材中有機物利用率低，酵母聚集生長差；酵母添加量過多，酵母生長所需要營養(yǎng)物質不足，同樣會導致液化酶活力降低。因此酵母添加量1.5%是實驗曲制作的最佳接種量。

圖1 酵母添加量對液化酶活力的影響Fig. 1 Effect of yeast inoculum amount on liquefaction enzyme activity

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 根霉接種量對酶活力的影響

圖2 根霉接種量對糖化酶、液化酶活力的影響Fig. 2 Effects of Rhizopus inoculum size on liquefaction enzyme and glucoamylase activity

由圖2可知，接種量在0.1%～0.5%范圍內(nèi)變化時，糖化酶、液化酶活力呈先上升后快速下降的趨勢。當接種量為0.3%時，酶活力最高，隨著接種量繼續(xù)增大，酶活力開始逐漸降低。這是因為當接種量較大時，根霉將基質營養(yǎng)物質都用來自身生長，使生長發(fā)育加快，導致較早進入衰老期，不利于酶等代謝產(chǎn)物的合成分泌[28]。合適的接種量有利于在較短的時間內(nèi)產(chǎn)生更多高活性的糖化酶。因此，設計響應面試驗時選用根霉接種量0.2%、0.3%、0.4%。

2.2.2 培曲時間對酶活力的影響

由圖3可知，當培養(yǎng)時間在32～48 h時，糖化酶、液化酶活力隨培養(yǎng)時間增加呈先上升后下降的趨勢，在40 h時酶活力最大，32～36 h酶活力增加幅度小的原因是根霉生長處于遲緩期，菌體攝取營養(yǎng)物質主要用于自身細胞質生長，酶分泌較少。當進入菌絲體快速生長階段，產(chǎn)生大量代謝產(chǎn)物，隨著菌體大量生長代謝，基質中營養(yǎng)物質被消耗，菌體生長緩慢，逐漸進入衰亡期，代謝物逐漸變少[29]，因此酶活力降低。傳統(tǒng)的培曲時間一般較長，一般為幾天到幾十天不等[1]，本研究僅用40 h左右便使酒曲達到相同效果的酶活力，說明添加中藥對酵母和根霉生長產(chǎn)酶均有積極作用。因此，選培養(yǎng)時間為36、40、44 h設計響應面試驗。

圖3 培曲時間對根霉糖化酶、液化酶活力的影響Fig. 3 Effect of cultivation time on liquefaction enzyme and glucoamylase activity

2.2.3 基質含水量對酶活力的影響

圖4 基質含水量對根霉糖化酶、液化酶活力的影響Fig. 4 Effect of matrix moisture contents on liquefaction enzyme and glucoamylase activity

由圖4可知，當藥材含水量在55%～75%之間時，糖化酶、液化酶活力均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，當基質含水量在65%時，酶活力最大。根霉屬好濕型微生物，喜歡生長在潮濕的環(huán)境，因此水分的改變對根霉在麩皮中的繁殖有很大影響。當基質含水量低時，根霉水分短缺，菌體繁殖漸次變慢至停止；增大基質含水量，根霉生長雖快，但基質聚集成團，基質內(nèi)菌體通過無氧呼吸產(chǎn)乙醇而妨礙根霉菌絲的連續(xù)繁殖，基質中出現(xiàn)灰黑孢子, 有異味等問題，降低了糖化酶活力。因此，選擇基質含水量為60%、65%、70%進行響應面設計。

2.2.4 培曲溫度對酶活力的影響

由圖5可以看出，當培曲溫度在26～34 ℃時，糖化酶、液化酶活力均呈先增高后降低的趨勢，當培曲溫度在28 ℃時，酶活力均達到最大。溫度主要是通過影響微生物體內(nèi)的核酸、蛋白質等生物大分子的結構與功能影響微生物生長、繁殖以及新陳代謝。過高的環(huán)境溫度會導致部分生物大分子變性失活，而過低的溫度會使酶活力鈍化，細胞的新陳代謝活動減弱。因此，選擇培曲溫度為26、28、30 ℃。

圖5 培曲溫度對根霉糖化酶、液化酶活力的影響Fig. 5 Effect of culture temperature on liquefaction enzyme and glucoamylase activity

2.3 響應面試驗結果

2.3.1 響應面試驗設計與結果

以霉菌接種量、培曲時間、基質含水量、培曲溫度為因素，糖化酶活力為響應值進行制曲優(yōu)化試驗。響應面Box-Behnken試驗設計及結果見表2。

表2 Box-Behnken試驗設計及結果Table 2 Box-Behnken design with experiment and predicted values of glucoamylase activity

2.3.2 模型方差分析及響應面分析

表3 回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variances for the developed regression equation

從表3可看出，模型極顯著，失擬項不顯著，說明該回歸模型預測值與實測值有較好的擬合水平，該模型適用于對中藥制曲工藝進行分析和預測?；貧w系數(shù)R2為0.983 5，表明該模型相關度好。=0.967 0，表明有96.7%的響應值變化可以用模型來解釋，模型具有良好的擬合度，試驗誤差較小，可以對結果進行準確分析和預測。回歸方程中各變量對指標（響應值）影響的顯著性，由F檢驗判定，結果表明：D、CD、A2、B2、C2、D2達到極顯著水平，AB達到顯著水平。僅考慮顯著項，得到的二次多元回歸方程為：糖化酶活力=776.87－7.70A－0.33B＋9.39C＋30.31D＋19.58AB＋1.50AC＋4.50BC＋3.75BD－28.67CD－104.03A2－106.40B2－107.91C2－145.11D2?；貧w方程一次項系數(shù)絕對值的大小，決定了各因素對響應值影響的主次順序，所以各因素對響應值影響排序為：培曲溫度＞基質含水量＞根霉接種量＞培曲時間。

2.3.3 響應面分析與條件優(yōu)化

等高線圖可以直觀地反映兩變量交互作用的顯著程度，圓形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓形與之相反[30]。根據(jù)回歸方程繪制響應面見圖6。

圖6 各因素交互作用對曲糖化酶活力的響應面和等高線圖Fig. 6 Response surface and contour plots showing interactive effects of various factors on glucoamylase activity

從圖6a可以看出，基質含水量65%、培曲溫度28 ℃時，霉菌接種量和培曲時間交互作用顯著。從三維立體圖可以看出，增大根霉接種量和培曲時間有利于糖化酶活力的提高，糖化酶活力在極大值點。當培曲時間保持不變時，隨著根霉接種量增加，糖化酶活力先增高后降低，但不管培曲時間較長還是較短，糖化酶活力升高和降低的幅度較一致；當保持根霉接種量不變時，隨著培曲時間增加，糖化酶活力也呈先增加后降低的趨勢。由等高線圖可知，根霉接種量對糖化酶活力的影響比培曲時間要大，這與方差分析結果一致。當培曲時間在37.96～41.94 h，根霉接種量在0.25%～0.35%時，對糖化酶活力提高最為有利。

從圖6b可以看出，當根霉接種量0.3%、培曲時間40 h時，培曲溫度和基質含水量交互作用顯著。從三維立體圖可以看出，響應面坡度較大較為陡峭，這說明糖化酶活力對培曲溫度和基質含水量改變有較高的敏感度。當培曲溫度和基質含水量分別保持不變時，隨著基質含水量和培曲溫度的分別增加，糖化酶活力均呈現(xiàn)出急劇增加后又急劇降低的趨勢，由等高線圖可知，培曲溫度對糖化酶活力的影響比基質含水量大，與方差分析結果一致。當基質含水量在60.90%～69.5%，培曲溫度在26.75 ～29.67 ℃時，對糖化酶活力的提高最有利。

利用Design-Expert 8.0.6軟件進行最佳工藝參數(shù)組合，優(yōu)化結果為：根霉接種量0.3%、培曲時間39.99 h、基質含水量65.15%和培曲溫度28.20 ℃，在此條件下曲糖化酶活力預測值為778.65 mg/（g·h）?？紤]到實際操作情況，將各條件修正到根霉接種量0.3%、培曲時間40 h、基質含水量65%和培曲溫度28 ℃，在該條件下進行3 次實驗，得到的結果平均值為（779.233±0.577）mg/（g·h），與預測值接近，說明該模型很好地預測了曲的糖化酶活力，優(yōu)化工藝條件可靠。

2.4 酶系分析結果

采用最佳優(yōu)化方案制曲與傳統(tǒng)曲進行糖化酶、液化酶、蛋白酶、纖維素酶、果膠酶以及脂肪酶活力分析比較，見表4。

表4 酒曲酶系分析比較Table 4 Comparison of multi-enzyme analysis of new and traditional koji

由表4可知，實驗曲和傳統(tǒng)曲之間同種酶其酶活力也可能存在顯著性差異。實驗曲的糖化酶、液化酶活力較傳統(tǒng)曲有明顯提高，糖化酶活力為（779.233±0.577）mg/（g·h），約是傳統(tǒng)曲的1.3 倍，液化酶活力為（2.730±0.231）g/（g·h），約為傳統(tǒng)曲的2.8 倍，差異極顯著（P＜0.001），這說明實驗曲具有明顯強化酒發(fā)酵的能力，對根霉和酵母的生長有促進作用。實驗曲的蛋白酶活力較傳統(tǒng)曲高，酸性和中性蛋白酶存在極顯著差異（P＜0.001），堿性蛋白酶差異顯著（P=0.027），這可以解決釀酒過程中蛋白質分解不完全，出現(xiàn)沉淀等問題，同時也可增加酒釀中氨基酸含量。實驗曲的酸性纖維素酶活力約為傳統(tǒng)曲酶活力的1.6 倍，說明藥材中的某些物質可以促進微生物生長，同時促進微生物分泌纖維素酶[31]。兩種曲果膠酶活力分別為（260.730±3.300）U/g和（235.427±3.810）U/g，酶活力相差不大。纖維素酶可降解發(fā)酵原料中的纖維素，果膠酶能夠分解酒曲原料中果膠物質生成甲醇和聚半乳糖醛酸，兩者都能夠提高原料的利用率[32]。實驗曲脂肪酶活力（（18.888±3.849）U/g）較傳統(tǒng)曲（（15.555±1.924）U/g）高，說明實驗曲能夠更好的將原料中的脂肪類物質轉化為脂肪酸、甘油二酯等物質，可以更好地為酒體中的香氣成分做貢獻。

2.5 酒曲釀酒GC-MS揮發(fā)性成分分析

圖7 實驗曲釀造米酒中揮發(fā)性成分GC-MS總離子流圖Fig. 7 GC-MS total ion chromatogram of volatile components in new rice mwine

圖8 傳統(tǒng)曲釀造米酒中揮發(fā)性成分GC-MS總離子流圖Fig. 8 GC-MS total ion current chromatogram of volatile components in traditional rice wine

表5 米酒揮發(fā)性成分分析結果Table 5 Volatile component analysis results of rice wines

實驗曲釀造米酒和傳統(tǒng)曲釀造米酒GC-MS總離子圖見圖7和圖8，鑒定的香氣物質見表5，共檢測了33 種成分，其中醇類7 種、酯類8 種、酸類10 種、醛類3 種、酚類5 種。實驗曲釀造米酒中醇類物質含量均高于傳統(tǒng)釀造米酒，特別是異戊醇、正乙醇質量濃度高達（109.394±14.474）μg/100 mL和（100.364±24.177）μg/100 mL，是傳統(tǒng)曲釀造米酒的11 倍和14.5 倍，這使得米酒的果香味與清香味大大增加。醇類是酒體呈香的主體成分，少量的高級醇能賦予酒體高雅的水果香，同時還是形成酯類物質的前體，對于酒體風格的體現(xiàn)有重要的作用[36]。酯類物質中，以乳酸乙酯、丁酸乙酯為主體香氣物質，質量濃度分別達到了（259.894±10.748）μg/100 mL和（187.552±0.845）μg/100 mL，與傳統(tǒng)酒曲釀造米酒比較，質量濃度遠遠高于其（19.922±0.267）μg/100 mL和（0.867±0.013）μg/100 mL，賦予酒體多種果香味，是酒中香氣組成的重要物質，影響酒體的香型及風格[37]。酸類物質能與醇類物質反應生成相應的酯類物質，從而賦予酒體香味，適量的酸類物質能提高酒體的整體協(xié)調性，過高或過低都會給酒體呈香帶來負面影響[38]。其乙酸含量相對都較大，實驗曲釀酒乙酸質量濃度達到（560.939±18.185）μg/100 mL，而傳統(tǒng)曲釀酒為（135.240±5.113）μg/100 mL，這與易欣等[39]研究一致。醛類物質對酒體香味也有一定影響，乙醛能賦予酒體果香、咖啡香、且?guī)в幸欢ㄇ逑悖瑢嶒炃勗烀拙浦? 種醛類物質含量均高于傳統(tǒng)曲釀酒。

3 結 論

以藥食同源物質制曲，通過單因素試驗和Box-Behnken設計試驗，采用響應面分析法優(yōu)化藥食同源物質制曲工藝條件，確定的優(yōu)化工藝條件參數(shù)為：根霉接種量0.3%、培曲時間40 h、基質含水量65%和培曲溫度28 ℃，在此條件下實驗曲糖化酶活力為（779.233±0.577） mg/（g·h）。在本實驗范圍內(nèi)建立的二次線性回歸模型準確有效，可用來預測設定條件范圍內(nèi)及其周圍的藥食同源物質制曲工藝參數(shù)，對實驗有較好擬合性，有一定的實用價值。對實驗曲酶系測定結果表明，糖化酶、液化酶、酸性與中性蛋白酶、纖維素酶活力等均極顯著高于傳統(tǒng)曲（P＜0.000 1），說明實驗曲具有良好的發(fā)酵性能。對實驗曲釀酒主要33 種物質分析表明，醇類以正丙醇（75.488±17.389）μg/100 mL、異戊醇（109.394±14.474）μg/100 mL、正乙醇（100.364±24.177）μg/100 mL為主，酯類物質中以乙酸乙酯（76.468±1.513）μg/100 mL、乳酸乙酯（19.922±0.267）μg/100 mL居多，賦予酒體果香和酯香，酸類以乙酸（135.240±5.113）μg/100 mL、丙酸（34.879±17.671）μg/100 mL居多，說明采用藥食同源基質制曲，在微生物作用下，基質中的有效成分能夠很好地融入酒體，提高米酒的營養(yǎng)成分。發(fā)酵所得的黑糯米酒暗紅發(fā)亮，酒體清澈，質地均勻，有淡淡藥香，酸甜可口，口感醇厚柔和，是一種能受到消費者喜愛的米酒。