張 斌，陳兆貴，鄒俊杰

（惠州學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，廣東 惠州 516007）

果醋類產(chǎn)品是經(jīng)過生物發(fā)酵的健康飲品，其中醋酸發(fā)酵是生物發(fā)酵中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其對果醋產(chǎn)品最終的營養(yǎng)風(fēng)味及保健功效起到非常重要的作用。國內(nèi)外學(xué)者一直都對醋酸發(fā)酵工藝及關(guān)鍵點(diǎn)的研究非常重視。劉國明等[1]利用正交分析法對荔枝醋酸發(fā)酵菌種篩選及工藝進(jìn)行優(yōu)化，探明風(fēng)味最佳荔枝醋的發(fā)酵工藝；屈利民等[2]研究了荔枝果醋的3種不同發(fā)酵方式，并采用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行了分析比較；張霽紅等[3]研究了蘋果醋液態(tài)深層發(fā)酵方法，優(yōu)選出了菌株Y010及其在發(fā)酵過程中乙醇脫氫酶活性與產(chǎn)酸量和產(chǎn)酸速率的關(guān)系；HIDALGO C等[4]應(yīng)用分子生物學(xué)方法對柿子醋酸發(fā)酵進(jìn)行研究，對柿子在醋酸化過程中產(chǎn)生的醋酸菌進(jìn)行了鑒定。

醋酸發(fā)酵是在醋酸菌氧化酶的作用下將酒精氧化生成醋酸，理論上100 g酒精能生成130.4 g醋酸，由于發(fā)酵過程中醋酸會被作為醋酸菌生長繁殖的碳源營養(yǎng)而被消耗一部分，外加醋酸的揮發(fā)、氧化分解、酯化反應(yīng)等原因，在實(shí)際中一般只能達(dá)到理論值的85%左右[3-5]。醋酸發(fā)酵受到醋酸菌接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、初始酒精度等因素的影響。本試驗(yàn)應(yīng)用響應(yīng)面優(yōu)化方法對荔枝醋酸發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化研究，以考察荔枝醋酸發(fā)酵的最佳工藝參數(shù)，提高醋酸產(chǎn)量，旨在為荔枝醋的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

荔枝清汁：廣東禎州荔枝產(chǎn)業(yè)股份有限公司；滬釀1.01號醋酸菌：海博生物技術(shù)有限公司；澳大利亞R2酵母：上海杰兔工貿(mào)有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV1810紫外可見分光光度計(jì)、愛拓RX-5000α自動阿貝折光儀：北京普析通用儀器公司；DDSJ-318型電導(dǎo)率儀：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；雷磁PHSJ-5型pH測定儀：上海儀電分析儀器有限公司；生物發(fā)酵罐：張家口奧斯特不銹鋼有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 荔枝醋酸發(fā)酵工藝

荔枝清汁→成分調(diào)整（總糖250 g/L）→酒精發(fā)酵（酵母菌250 mg/L 28℃、6～8 d）→醋酸發(fā)酵（11 d）→指標(biāo)檢測→過濾→滅菌（130℃、2 min）→荔枝原醋

1.3.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

通過單因素試驗(yàn)分別考察醋酸菌接種量（0.30 g/L、0.50 g/L、0.70 g/L、0.90 g/L）、初始酒精度（5%vol、6%vol、7%vol、8%vol）、醋酸發(fā)酵溫度（25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃）對醋酸發(fā)酵中總酸含量的影響。

1.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

利用在單因素試驗(yàn)獲得的最佳接種量、溫度和初始酒精度范圍，在Box-Behnken響應(yīng)曲面法設(shè)計(jì)3因素3水平試驗(yàn)，以醋酸菌接種量、發(fā)酵溫度和初始酒精度3個因子為自變量，以總酸含量為響應(yīng)值，試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見表1。

表1 醋酸發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology for conditions optimization of acetic acid fermentation

1.3.4 指標(biāo)測定

總酸的測定[6]：酸堿中和滴定法（以醋酸含量計(jì)）；酒精度的測定[7]：密度瓶法。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種量對醋酸發(fā)酵的影響

醋酸菌接種量對荔枝醋酸發(fā)酵的影響見圖1。由圖1可以看出，各發(fā)酵樣在前6 d的產(chǎn)酸量都呈現(xiàn)遞增趨勢，彼此差別不明顯。在第7天后，接種量0.70～0.90 g/L的發(fā)酵樣產(chǎn)酸速度變緩，發(fā)酵周期較長，接種量0.30～0.50 g/L的發(fā)酵樣產(chǎn)酸速度較高，當(dāng)接種量為0.30 g/L時醋酸產(chǎn)量達(dá)到5.14 g/100 mL?？梢娮顑?yōu)接種量范圍為0.30～0.50 g/L。

圖1 醋酸菌接種量對荔枝醋酸發(fā)酵的影響Fig.1 Effect of acetic acid bacteria inoculum on acetic acid fermentation of litchi

在醋酸發(fā)酵中，醋酸桿菌的主要作用是將酒精氧化為醋酸，足量的醋酸菌不僅可以縮短發(fā)酵周期，還能降低污染雜菌的幾率，但如果醋酸菌接種量過大，不僅將酒精作為碳源，還會以甘油、甘露醇等多元醇作為碳源，發(fā)酵液中的營養(yǎng)物質(zhì)會供應(yīng)不足，會繼續(xù)把醋酸氧化成二氧化碳和水，也會氧化乙醇之外的其他醇類和糖類生成相應(yīng)的酸、酮等物質(zhì)，同時會導(dǎo)致代謝雜質(zhì)增多，容易產(chǎn)生過早老化和自溶現(xiàn)象[8-11]。

2.2 初始酒精度對醋酸發(fā)酵的影響

初始酒精度對醋酸發(fā)酵的影響見圖2。由圖2可知，在前3 d中，4個發(fā)酵樣的產(chǎn)酸速度都呈現(xiàn)遞增的趨勢。第4天后表現(xiàn)出不同的趨勢，初始酒精度5%vol～6%vol的發(fā)酵樣產(chǎn)酸一直呈現(xiàn)遞增趨勢。初始酒精度5%vol和6%vol的發(fā)酵樣在第11天時總酸含量分別達(dá)到5.39 g/100 mL和5.38 g/100 mL，而初始酒精度為4%vol和7%vol的發(fā)酵樣僅為1.83 g/100 mL和3.14 g/100 mL，其中初始酒精度7%vol的發(fā)酵樣，產(chǎn)酸速率緩慢，產(chǎn)酸量不斷下降?？梢姵跏季凭确秶?%vol～6%vol時最有利于醋酸發(fā)酵。

圖2 初始酒精度對醋酸發(fā)酵的影響Fig.2 Effect of initial alcohol content on acetic acid fermentation of litchi

在醋酸發(fā)酵過程中，隨著發(fā)酵時間的延長，酒精度逐漸下降，酸度不斷升高，一般醋酸發(fā)酵的適宜酒精度范圍為5%vol～12%vol。初始酒精度為醋酸菌的繁殖代謝提供了必需的營養(yǎng)物質(zhì)，在一定的酒度范圍內(nèi)，總酸產(chǎn)量會隨著酒精度的增大逐漸增加，但是初始酒精度過高時，反而會抑制醋酸菌的生長代謝活動，導(dǎo)致醋酸菌不適應(yīng)高酒精度環(huán)境，從而影響發(fā)酵進(jìn)程，使醋酸產(chǎn)量下降，同時延長了發(fā)酵周期[12-16]。

2.3 發(fā)酵溫度對醋酸發(fā)酵的影響

發(fā)酵溫度對荔枝醋酸發(fā)酵的影響見圖3。由圖3可知，當(dāng)醋酸發(fā)酵溫度為30～35℃時產(chǎn)酸速度最快，產(chǎn)酸量也較高。在35℃時，醋酸產(chǎn)量在第11天達(dá)到5.22 g/100 mL。發(fā)酵溫度在40℃時，醋酸產(chǎn)率先升高后降低，這是由于發(fā)酵溫度過高，醋酸菌在第8天時失活，提前老化而導(dǎo)致醋酸量下降。發(fā)酵溫度在25℃時，雖然醋酸產(chǎn)量整體呈現(xiàn)上升趨勢，但是醋酸菌生長代謝緩慢，發(fā)酵周期長，醋酸產(chǎn)量偏低?？梢娮钸m醋酸發(fā)酵溫度為30～35℃。

一般情況下，醋酸菌生長繁殖的適宜溫度為28～33℃，醋酸菌生長的最適pH值為3.5～6.5，在發(fā)酵液中醋酸含量達(dá)1.5%～2.5%時，其生長繁殖就會停止，醋酸發(fā)酵過程依賴于細(xì)胞膜上具有高活性的乙醇脫氫酶以及乙醛脫氫酶，發(fā)酵過程中乙醇在乙醇脫氫酶作用下被氧化成乙醛，乙醛在乙醛脫氫酶作用下被氧化為乙酸。酶的催化反應(yīng)有最適條件，一般在最適溫度下，酶的催化反應(yīng)才能達(dá)到最大值[17-19]。理論上，一般發(fā)酵溫度每上升10℃，催化反應(yīng)速率提升1～2倍。但是，當(dāng)溫度過高時，酶的催化能力會大大降低，甚至?xí)?dǎo)致其喪失催化活性[20-22]。

圖3 發(fā)酵溫度對荔枝醋酸發(fā)酵的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on acetic acid fermentation of litchi

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化醋酸發(fā)酵條件

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法優(yōu)化荔枝醋酸發(fā)酵工藝，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，以發(fā)酵11 d的總酸產(chǎn)量為響應(yīng)值，利用Design-Expert.V8.0.6軟件對A（醋酸菌接種量）、B（初始酒精度）、C（發(fā)酵溫度）3個因素設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表2 醋酸發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of response surface methodology for conditions optimization of acetic acid fermentation

應(yīng)用Design-Expert.V8.0.6軟件對荔枝醋酸發(fā)酵條件進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，獲得自變量為A（接種量）、B（初始酒精度）、C（溫度），響應(yīng)值為Y值（總酸產(chǎn)量）的二次多元回歸方程：Y=50.74+1.16A+0.86B-0.89C-1.56AB-1.88AC+2.60BC-3.97A2-1.79B2-3.33C2。為檢驗(yàn)方程的可靠性，對方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of response surface methodology results

如表3所示，P失擬項(xiàng)=0.885 8＞0.05，說明模型失擬度不顯著；回歸模型的調(diào)整確定系數(shù)（R2adj）為0.959 9，表明有95.99%響應(yīng)值變化是可解釋的，且相關(guān)系數(shù)（R2）為0.982 5，與R2adj比較接近，說明此模型擬合程度好，誤差也較小，在荔枝醋酸發(fā)酵工藝參數(shù)的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)上可以使用該模型進(jìn)行分析。一次項(xiàng)A（接種量）、交互項(xiàng)AB、AC、BC、二次項(xiàng)A2、B2、C2的P值均＜0.01，說明對結(jié)果影響極顯著（P＜0.01）；B（初始酒精度）、C（溫度）的P值小于0.05，說明對結(jié)果影響顯著。

2.5 發(fā)酵條件的響應(yīng)面分析與優(yōu)化

在回歸模型方差分析結(jié)果的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步考察醋酸菌接種量（A）、初始酒精度（B）和發(fā)酵溫度（C）其交互作用對響應(yīng)值Y（總酸產(chǎn)量）影響的響應(yīng)面及等高線，結(jié)果見圖4。等高線形狀可以反映交互作用大小，當(dāng)為橢圓形時，表示交互作用顯著；而當(dāng)?shù)雀呔€形狀為圓形，則表示交互作用不顯著。

由圖4可知，接種量和初始酒精度的交互作用對總酸含量的影響極顯著，發(fā)酵溫度和初始酒精度的相互作用對總酸含量影響極顯著，發(fā)酵溫度與接種量的交互作用對總酸含量的影響極顯著。

圖4 各因素交互作用對總酸含量影響的響應(yīng)面和等高線Fig.4 Response surface plots and contour line of effects of interactions between various factors on total acid content

根據(jù)所建立的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行參數(shù)的最優(yōu)化分析，可得荔枝醋酸發(fā)酵的最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度32.08℃，初始酒精度5.52%vol，接種量0.42 g/L，該工藝條件下荔枝果醋含量的總酸理論值為5.10 g/100 mL。

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

為了驗(yàn)證響應(yīng)面優(yōu)化方法得到的多元回歸模型的準(zhǔn)確性，保證試驗(yàn)的可操作性，將最佳發(fā)酵工藝條件修正為發(fā)酵溫度32℃，初始酒精度5.5%vol，接種量0.42 g/L。在該條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，得到醋酸發(fā)酵后總酸的平均值為4.91 g/100 mL，實(shí)際值與理論值較為接近，說明該模型準(zhǔn)確可靠，能較好地預(yù)測荔枝果醋飲料的酸度，利用該模型在實(shí)踐中進(jìn)行預(yù)測是可行的。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法對荔枝醋酸發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，建立了總酸產(chǎn)量與初始酒精度、發(fā)酵溫度、接種量3個因素的二次多項(xiàng)式回歸模型，由該模型得到的優(yōu)化發(fā)酵工藝參數(shù)為發(fā)酵溫度32℃，初始酒精度5.5%vol，醋酸菌接種量0.42 g/L。在此優(yōu)化條件下，總酸產(chǎn)量為4.91 g/100 mL，與理論值5.10 g/100 mL接近。經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)證明該模型合理可靠。