陳鈺泉 劉玉婷 仇敏

摘要：通過在植物皂素液中添加不同濃度植物（川芎、旱蓮草、香附、白芷、當(dāng)歸、黃芪）提取混合液及葡萄糖，測定植物皂素發(fā)酵液中枯草芽孢桿菌共表達(dá)蛋白酶、果膠酶活性。直接發(fā)酵時(shí)，發(fā)酵液中蛋白酶、果膠酶活性分別在發(fā)酵32、24 h時(shí)達(dá)到最大值，分別為3 984、227 U/ml;添加5%混合植物提取液后，發(fā)酵液中蛋白酶活性下降了37.55%，果膠酶活性提高了3.83倍;當(dāng)皂素提取液中的植物提取液添加量提高至10%后，發(fā)酵液中蛋白酶活性最大值下降了66.59%;果膠酶活性最大值提高了4.94倍。當(dāng)以添加5%葡萄糖的皂素提取液作為發(fā)酵基質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，發(fā)酵液中蛋白酶、果膠酶活性分別在發(fā)酵40、8 h時(shí)達(dá)到最大值，分別為2 451、1 390 U/mL;當(dāng)在添加5%葡萄糖的皂素提取液中添加5%混合植物提取液后，發(fā)酵液中蛋白酶活性最大值降低 61.32%，果膠酶活性最大值提高5.54%;當(dāng)在添加5%葡萄糖的皂素提取液中添加10%混合植物提取液后，發(fā)酵液中蛋白酶活性最大值降低33.37%，果膠酶活性最大值提高30.65%。當(dāng)直接在皂素提取液中添加植物提取液而不添加葡萄糖時(shí)，植物提取液添加量的提高對果膠酶活性有促進(jìn)作用，對蛋白酶活性有抑制作用;當(dāng)在皂素提取液中添加5%葡萄糖時(shí)，植物提取液添加量的提高同樣利于果膠酶活性的提高。

關(guān)鍵詞：果膠酶;蛋白酶;皂素;發(fā)酵;枯草芽孢桿菌

中圖分類號(hào)：S188+.4?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2019）11-0322-05

植物來源的皂苷包括三萜皂苷和甾體皂苷，因其水溶液振搖后可產(chǎn)生持久性似肥皂溶液的泡沫而得名[1]。在自然界中，三萜皂苷主要分布于無患子科、豆科、茶科、菊科、五加科、桔梗科、遠(yuǎn)志科、傘形科、葫蘆科等植物中;而甾體皂苷主要分布在百合科、薯蕷科、玄參科、姜科、豆科等植物中。無患子、茶餅和艾草中都含有豐富的三萜皂苷[1-4]，這類皂苷屬于一種優(yōu)良的非離子表面活性劑，具有較好的去污洗滌能力及體外抗菌殺蟲、抗氧化活性，易于生物降解，在臨床上主要被應(yīng)用于各類殺蟲止癢以及出血癥、內(nèi)科、婦科等疾病的治療。

川芎為傘形科植物川芎（Ligusticum chuanxiong Hort）的干燥根莖，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其性溫，味辛、微苦，具有活血行氣、祛風(fēng)止痛的功效[5]，臨床上常被用于治療胸痹心痛、胸脅刺痛、跌撲腫痛、月經(jīng)不調(diào)、頭痛、風(fēng)濕痹痛等疾病[6]。旱蓮草（Herba ecliptae），別稱墨旱蓮[7]，為菊科鱧腸的干燥地上部分，具有促使毛發(fā)生長、降低血脂、止血、免疫調(diào)節(jié)等藥理作用[8]。香附為莎草科植物莎草（Cyperus rotundus L.）的干燥根莖，具有疏肝解郁、理氣寬中、調(diào)經(jīng)止痛的功效，臨床上常被用于治療肝郁氣滯、胸脅脹痛、疝氣疼痛、乳房脹痛、月經(jīng)不調(diào)等疾病[9]。白芷（Angelica dahurica）[10]，為傘形科植物，具有發(fā)散風(fēng)寒、通竅止痛、燥濕止帶、消腫排膿等功效[11]。當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸[Angelia Sinensis（Oliv.）Diels]的干燥根，具有補(bǔ)血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤腸通便的功效[12]，主要被用于月經(jīng)不調(diào)、血虛頭痛、腸燥便難、崩漏、跌撲損傷等疾病的治療[13]。黃芪為豆科植物蒙古黃芪[Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge. var. mongholicus （Bge.） Hsiao]或膜莢黃芪[Astragalus membrana-ceus （Fisch.） Bge.]的干燥根，歸脾肺二經(jīng)，具有補(bǔ)中益氣、健脾益肺、托毒生肌的功效[14-15]。

本試驗(yàn)通過在植物皂素液中添加川芎、旱蓮草、香附、白芷、當(dāng)歸、黃芪等多種植物提取液，考查多種植物提取液對枯草芽孢桿菌發(fā)酵皂素提取液共表達(dá)蛋白酶、果膠酶活性的影響，以期為工業(yè)化發(fā)酵皂素提取液制備洗滌劑提供依據(jù)。

1 材料

1.1 試劑與儀器

福林酚、三氯乙酸、酪蛋白、果膠、牛血清白蛋白、蛋白胨、牛肉膏、瓊脂粉、一水硫酸錳購于天津市大茂化學(xué)試劑廠。

TDZS-WS型離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）;HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）;759S型紫外分光光度計(jì)（上海儀電分析儀器有限公司）;G48661F型移液槍（德國艾本德股份公司）;BSA224S型分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司];YXQ-LS-50SII立式蒸汽壓力滅菌柜（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）。

1.2 試驗(yàn)菌株

枯草芽孢桿菌CICC23083購于商城北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司。

2 方法

2.1 多種植物提取液的制備

川芎提取液的提取方法參照文獻(xiàn)[16]，旱蓮草提取液的提取方法參照文獻(xiàn)[17]，香附提取液的提取方法參照文獻(xiàn)[18]，白芷提取液的提取方法參照文獻(xiàn)[19]，當(dāng)歸提取液的提取方法參照文獻(xiàn)[20]，黃芪提取液的提取方法參照文獻(xiàn)[21]，將各提取液濃縮至1 g/mL，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 發(fā)酵基質(zhì)的準(zhǔn)備

按照質(zhì)量比分別為90%、5%、5%稱取適量無患子、艾草、茶籽粕，在60 ℃條件下以1 g ∶ 18 mL的固液比在pH值為9的水溶液中提取3 h。經(jīng)2 810 r/min離心10 min，取上清液，將川芎、旱蓮草、白芷、黃芪、香附、當(dāng)歸提取液等體積混合后，在皂素提取液的上清液中分別添加5%、10%該混合植物提取液作為發(fā)酵基質(zhì)，以不添加混合植物提取液的皂素提取液為直接發(fā)酵基質(zhì)。

2.3 酶液的制備

向發(fā)酵基質(zhì)中接種5%枯草芽孢桿菌菌液進(jìn)行發(fā)酵，每 8 h 取發(fā)酵液在4 000 r/min下離心10 min，取上清液，為粗酶液。

2.4 蛋白酶活性測定

在1 mL酪蛋白（1%）底物中加入1 mL粗酶液，在 40 ℃、pH值為7的條件下反應(yīng)10 min后加入2 mL三氯乙酸（0.4 mol/L）終止反應(yīng)，用紫外分光光度計(jì)在680 nm處測定溶液的吸光度。以1 min水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸需要的酶量為1個(gè)活性單位[22]。

2.5 果膠酶活性測定

在25 mL比色管中加入1 mL果膠溶液（1%），50 ℃預(yù)熱10 min，加入2 mL pH值為5的緩沖溶液和1 mL粗酶液，在50 ℃條件下反應(yīng)30 min，迅速加入4 mL 3，5-二硝基水楊酸（DNS）試劑，在 100 ℃ 條件下水浴5 min，取出后迅速用流水冷卻以終止顯色反應(yīng)，在540 nm處測定溶液吸光度。以 1 mL 酶液在50 ℃、pH值為5.0的條件下，1 min分解果膠產(chǎn)生1 μg D-半乳糖醛酸需要的酶量為1個(gè)酶活性單位[23]。

2.6 洗滌效果測定

以25%黃油、25%豬油、50%花生油配比，另加5%甘油酯配制人工污垢，稱量涂抹人工污垢前后的干凈培養(yǎng)皿底座的質(zhì)量，用發(fā)酵液洗滌涂抹有人工污垢的培養(yǎng)皿底座后稱質(zhì)量，以評價(jià)發(fā)酵液的洗滌性能[24]。洗滌性能計(jì)算公式：

Y=（m1-m2）/（m1-m0）×100%。

式中：Y表示洗滌性能;m0表示涂抹人工污垢前培養(yǎng)皿底座的質(zhì)量;m1表示涂抹人工污垢后培養(yǎng)皿底座的質(zhì)量;m2表示用發(fā)酵液洗滌涂抹有人工污垢的培養(yǎng)皿底座后干凈培養(yǎng)皿底座的質(zhì)量。

3 結(jié)果與分析

3.1 枯草芽孢桿菌發(fā)酵皂素提取液共表達(dá)蛋白酶和果膠酶活性

從圖1-A可以看出，以皂素提取液為發(fā)酵基質(zhì)，接種枯草芽孢桿菌發(fā)酵24 h時(shí)，發(fā)酵液達(dá)到最大生物量，并在發(fā)酵24～48 h內(nèi)維持相對穩(wěn)定的生物量，表明植物皂素提取液富含可以滿足枯草芽孢桿菌生長的營養(yǎng)物質(zhì)。在發(fā)酵過程中，果膠酶活性隨時(shí)間的變化趨勢與生物量相似。在發(fā)酵24 h時(shí)，發(fā)酵液中果膠酶活性達(dá)到最大值，為227 U/mL，此后果膠酶活性開始下降，并在發(fā)酵32～48 h內(nèi)保持穩(wěn)定水平。然而，蛋白酶活性隨時(shí)間的變化趨勢與果膠酶不一樣。蛋白酶活性在最初發(fā)酵的16 h內(nèi)較小，在發(fā)酵16～32 h范圍內(nèi)迅速增大，且在發(fā)酵32 h時(shí)達(dá)到最大值，為3 984 U/mL。此后，蛋白酶活性開始下降，發(fā)酵40 h時(shí)，蛋白酶活性為 3 069 U/mL。因此，蛋白酶活性的峰值滯后于生物量及果膠酶活性。

在皂素提取液中添加5%混合植物提取液，接種枯草芽孢桿菌進(jìn)行發(fā)酵，考察5%混合植物提取液對枯草芽孢桿菌發(fā)酵不添加葡萄糖的皂素液共表達(dá)蛋白酶、果膠酶活性的影響，結(jié)果見圖1-B。

從圖1-B可以看出，在發(fā)酵0～32 h內(nèi)，發(fā)酵液的生物量隨著時(shí)間的延長而增大，發(fā)酵32 h后，生物量開始逐漸降低。蛋白酶、果膠酶活性隨著生物量的增長而增大。蛋白酶、果膠酶活性分別在發(fā)酵40、32 h時(shí)達(dá)到最大值，分別為 2 488、1 097 U/mL。蛋白酶活性的最大值比果膠酶延遲8 h。與直接發(fā)酵相比，添加5%混合植物提取液后，發(fā)酵液中蛋白酶活性的最大值下降了37.55%，果膠酶活性的最大值提高了3.83倍。

在皂素提取液中添加10%混合植物提取液，接種枯草芽孢桿菌進(jìn)行發(fā)酵，考察10%混合植物提取液對枯草芽孢桿菌發(fā)酵不添加葡萄糖的皂素液共表達(dá)蛋白酶、果膠酶活性的影響，結(jié)果見圖1-C。

由圖1-C可知，在發(fā)酵0～32 h內(nèi)，皂素發(fā)酵液的生物量隨著時(shí)間的延長而增大;在發(fā)酵時(shí)間為32～48 h時(shí)，皂素發(fā)酵液的生物量略有下降。蛋白酶、果膠酶活性最初隨著生物量的增大而提高，并在發(fā)酵24 h后達(dá)到最大值，分別為1 331、1 348 U/mL。與直接發(fā)酵相比，當(dāng)皂素提取液中的植物提取液提高至10%后，發(fā)酵液中蛋白酶活性達(dá)到最大值的時(shí)間縮短了8 h，最大值下降了66.59%;果膠酶活性最大值提高了4.94倍。

3.2 枯草芽孢桿菌發(fā)酵添加5%葡萄糖的皂素提取液共表達(dá)蛋白酶、果膠酶活性

從圖2-B可以看出，在皂素提取液中添加5%葡萄糖后，枯草芽孢桿菌生物量在發(fā)酵48 h后達(dá)到最大值。與不添加葡萄糖直接以皂素提取液進(jìn)行發(fā)酵（圖2-A）相比，添加5%葡萄糖后，發(fā)酵液中枯草芽孢桿菌的生物量峰值明顯推遲了。發(fā)酵液中蛋白酶活性隨時(shí)間的變化趨勢與直接發(fā)酵皂素提取液類似。在發(fā)酵前16 h中，蛋白酶活性處于較低的水平，此后不斷增加，并在發(fā)酵40 h時(shí)達(dá)到最大值，為 2 451 U/mL，比直接發(fā)酵降低了38.48%。表明在皂素提取液中添加5%葡萄糖可為枯草芽孢桿菌提供足夠的能量物質(zhì)來維持較長時(shí)間的繁殖。然而，果膠酶活性隨時(shí)間的變化趨勢與直接發(fā)酵皂素提取液不同。在添加5%葡萄糖后，果膠酶活性的最大值為1 390 U/mL，比直接發(fā)酵皂素提取液高 5.12倍。表明葡萄糖對果膠酶活性有較大的影響，這種可消

化的碳水化合物可作為枯草芽孢桿菌新陳代謝的主要能量來源，優(yōu)先為枯草芽孢桿菌表達(dá)與分泌果膠酶提供能量和物質(zhì)，最終導(dǎo)致蛋白酶的表達(dá)相對缺乏。

在添加5%葡萄糖的皂素提取液中添加5%混合植物提取液后，接種枯草芽孢桿菌進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果如圖2-C所示。

由圖2-C可知，在發(fā)酵0～32 h內(nèi)，皂素發(fā)酵液的生物量隨著時(shí)間的延長而增大，并在發(fā)酵32 h時(shí)達(dá)到最大值。蛋白酶、果膠酶活性隨著生物量的增大而提高，并在發(fā)酵32 h時(shí)達(dá)到最大值，分別為948、1 467 U/mL。表明與以添加5%葡萄糖的皂素提取液作為發(fā)酵基質(zhì)相比，進(jìn)一步添加5%混合植物提取液后，發(fā)酵液中果膠酶活性的最大值提高 5.54%，蛋白酶活性的最大值降低61.32%。

在添加5%葡萄糖的皂素提取液中添加10%混合植物提取液后，接種枯草芽孢桿菌進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果如圖2-D所示。

由圖2-D可知，在發(fā)酵0～32 h內(nèi)，皂素發(fā)酵液的生物量隨著時(shí)間的延長而增大;在發(fā)酵時(shí)間為32～48 h時(shí)，皂素發(fā)酵液的生物量略有下降。果膠酶、蛋白酶活性在一定范圍內(nèi)隨著生物量的增大而提高，并在發(fā)酵16 h時(shí)，果膠酶活性達(dá)到最大值，為1 816 U/mL;發(fā)酵32 h時(shí)，蛋白酶活性達(dá)到最大值，為1 633 U/mL。結(jié)果表明，與以添加5%葡萄糖的皂素提取液作為發(fā)酵基質(zhì)相比，進(jìn)一步添加10%混合植物提取液后，發(fā)酵液中蛋白酶活性最大值降低33.37%，果膠酶活性最大值提高30.65%。

3.3 洗滌效果

由圖3可知，直接以皂素提取液為發(fā)酵基質(zhì)，用枯草芽孢桿菌進(jìn)行發(fā)酵16 h后，皂素發(fā)酵液的洗滌效果沒有明顯增加，這可能與果膠酶活性較低（≤170 U/mL）和蛋白酶活性很低有關(guān)。然而，在發(fā)酵24 h時(shí)，發(fā)酵液中蛋白酶活性急劇增大，達(dá)到3 446 U/mL，果膠酶活性達(dá)到最大值（227 U/mL），此時(shí)，皂素發(fā)酵液的洗滌效果得到明顯提高。與發(fā)酵前皂素提取液的洗滌效果相比，經(jīng)枯草芽孢桿菌發(fā)酵32 h后的皂素提取液洗滌效果提升了8.18百分點(diǎn)，此時(shí)，蛋白酶活性達(dá)到最大值，為3 984 U/mL，同時(shí)果膠酶表現(xiàn)出相對較高的活性。

在皂素提取液中添加5%葡萄糖后，以枯草芽孢桿菌進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)合圖3與圖2-B可以看出，發(fā)酵8 h后發(fā)酵液中果膠酶活性達(dá)到最大值（1 390 U/mL）， 發(fā)酵液中的蛋白酶活

性在發(fā)酵24 h后也明顯增大（1 004 U/mL）。然而，當(dāng)發(fā)酵至32 h時(shí)，果膠酶活性開始明顯減?。? 146 U/mL），同時(shí)洗滌效果也開始明顯下降。從這些結(jié)果可以推論出，提高蛋白酶、果膠酶活性可以在一定程度上提高皂素提取液的洗滌效果。同時(shí)提示，將蛋白酶和果膠酶應(yīng)用于純植物皂素洗滌劑中可以避免化學(xué)洗滌劑帶來的環(huán)境污染問題。

從圖3可以看出，無論是直接以皂素提取液為發(fā)酵基質(zhì)，還是以添加5%葡萄糖的皂素提取液作為發(fā)酵培養(yǎng)液，經(jīng)枯草芽孢桿菌發(fā)酵后，發(fā)酵液中的皂素濃度都沒有明顯變化。表明枯草芽孢桿菌和發(fā)酵條件對皂素提取液中的皂素濃度沒有明顯影響。

4 結(jié)論

多種植物皂素提取液中富含果膠，這些果膠與溶液中的蛋白類物質(zhì)結(jié)合后容易發(fā)生絮凝沉淀，從而導(dǎo)致皂素提取液性能極不穩(wěn)定。因此，本研究以共表達(dá)蛋白酶和果膠酶的枯草芽孢桿菌CICC23083為發(fā)酵菌株，對多種植物皂素提取液進(jìn)行發(fā)酵，考察川芎、旱蓮草、香附、白芷、當(dāng)歸、黃芪等多種植物提取液對枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。結(jié)果表明，當(dāng)直接在皂素提取液中添加植物提取液而不添加葡萄糖時(shí)，植物提取液添加量的提高對蛋白酶活性有抑制作用，對果膠酶活性有促進(jìn)作用，這可能表明，蛋白酶作為枯草芽孢桿菌的內(nèi)源性酶，當(dāng)培養(yǎng)液中富含足夠供枯草芽孢桿菌生長繁殖的營養(yǎng)物質(zhì)時(shí)，枯草芽孢桿菌優(yōu)先利用這些營養(yǎng)物質(zhì)合成自身生長繁殖需要的菌體蛋白，導(dǎo)致枯草芽孢桿菌優(yōu)先分泌果膠酶，而不是內(nèi)源性蛋白酶;當(dāng)在皂素提取液中添加5%葡萄糖時(shí)，植物提取液添加量的提高不利于蛋白酶活性的提高，同時(shí)利于果膠酶活性的提高。

本研究明確了枯草芽孢桿菌對添加不同量混合植物提取液的皂素提取液發(fā)酵效果，為以混合植物為原料的生物發(fā)酵技術(shù)和純中藥發(fā)酵產(chǎn)品開發(fā)奠定了理論基礎(chǔ)。

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