曹 鵬 張 波 張欣珂 劉月 何 非 段長青*

（1 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院 葡萄與葡萄酒中心 北京100083 2 農(nóng)業(yè)部葡萄酒加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京100083 3 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 蘭州730070）

顏色是紅葡萄酒重要的感官品質(zhì)，可反映葡萄原料和釀造工藝的優(yōu)劣，也是影響消費(fèi)者評判葡萄酒質(zhì)量與消費(fèi)的關(guān)鍵[1-2]。葡萄酒中花色苷的含量、種類決定了酒體的色澤特征和陳釀潛力[3]。然而，游離花色苷易受外界環(huán)境影響而降解，使得我國部分產(chǎn)區(qū)特別是產(chǎn)業(yè)規(guī)模較大的新疆、寧夏等西部產(chǎn)區(qū)，存在著紅葡萄酒顏色穩(wěn)定性差，陳釀期短等問題。

花色苷與輔色素進(jìn)行輔色化作用，具有增強(qiáng)葡萄酒色澤，提高顏色穩(wěn)定性的效果。研究發(fā)現(xiàn)新鮮紅葡萄酒中輔色作用可貢獻(xiàn)30%～50%的顏色總量；而在陳釀紅葡萄酒中輔色作用也有8%～30%的顏色貢獻(xiàn)[4]。另有研究認(rèn)為，輔色作用進(jìn)一步形成聚合色素，對陳釀型紅葡萄酒的顏色穩(wěn)定起重要作用[5]。多酚化合物分子中具有可極化的平面結(jié)構(gòu)，并含有富電子的π 系統(tǒng)[5]，可與缺少電子的花色苷烊鹽離子結(jié)合，使其芳香結(jié)構(gòu)和花色苷烊鹽離子結(jié)構(gòu)平面中的發(fā)色團(tuán)呈 “π-π” 堆疊狀態(tài)，從而起到保護(hù)花色苷，防止其與水分子發(fā)生親核加成反應(yīng)而脫色[4]，是目前研究較多的一類輔色素[6-8]。有研究利用蘆丁處理紅葡萄酒，發(fā)現(xiàn)在波長520 nm 處產(chǎn)生明顯的增色效果[9]。而槲皮素作為輔色素與花色苷形成穩(wěn)定性高的色素復(fù)合體，并產(chǎn)生紅移變化[10]。Quinn 等[11]認(rèn)為陳釀過程中橡木桶中酚類物質(zhì)被浸提到酒中，提高了酒體顏色的穩(wěn)定性。José 等[12]在葡萄酒釀造過程中添加酚類物質(zhì)，使得酒體在陳釀過程中的顏色和酒中酚類化合物的穩(wěn)定性大大提高。

目前關(guān)于多酚類輔色素的研究有較多報(bào)道，而多數(shù)研究仍主要集中在模擬反應(yīng)環(huán)境下的相關(guān)指標(biāo)測定，對于真實(shí)紅葡萄酒溶液體系下的輔色效應(yīng)，特別是陳釀過程中對顏色貢獻(xiàn)的研究還鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)擬通過在“赤霞珠”干紅葡萄酒陳釀前添加輔色物質(zhì)——咖啡酸，研究其對干紅葡萄酒陳釀過程中顏色的影響，以期為葡萄酒陳釀提供一定的科學(xué)依據(jù)并產(chǎn)生實(shí)踐指導(dǎo)作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及試劑

試驗(yàn)酒樣，中信國安公司2012年生產(chǎn)的“赤霞珠”干紅葡萄酒。陳釀?dòng)孟鹉就盀榧?xì)紋理中度烘烤225 L 二次桶，戴普斯公司。在陳釀前分別以不同質(zhì)量濃度（100，200，400 mg/L）加入咖啡酸的干紅葡萄酒進(jìn)行橡木桶陳釀，未做添加的橡木桶陳釀樣品為對照。

乙醛、亞硫酸、無水乙醇、氯化鈉，北京化工廠；酒石酸為分析純，天津市津科精細(xì)化工研究所；乙腈、甲醇、醋酸色譜純，美國Fisher 公司（Fairlawn，NJ，USA），純度達(dá)98%以上；實(shí)驗(yàn)用水，采用Milli-Q（Millipore bedford，MA）純化水系統(tǒng)制得；咖啡酸（食品級，純度>95%），陜西慈緣生物科技有限公司；二甲花色素-3-O-葡萄糖苷、非花色苷酚等標(biāo)準(zhǔn)品，美國Sigma-Aldrich 公司；其它藥品和試劑（除特殊說明外），美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器及設(shè)備

紫外-可見分光光度計(jì)，日本島津公司；Agilent 1100 HPLC/MSD Trap-VL 儀、Agilent 1200 HPLC-VWD-MS 儀，美國安捷倫公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 理化指標(biāo)分析 酒樣常規(guī)指標(biāo)測定方法參照國標(biāo)GB/T15038-2006 方法[13]。

1.3.2 色度-色調(diào)測定 采用CIELAB[14]法，酒樣經(jīng)0.45 μm 水系膜過濾，選擇2 mm 光徑比色皿，利用紫外-可見分光光度計(jì)分別測定波長440，530，600 nm 處的透光率，純水作為對照，建立CIELAB 坐標(biāo)系，計(jì)算各樣品的L*、a*、b*和ΔE*ab值。

1.3.3 輔色化率等的測定 采用Boulton[4]方法測定輔色化（CA%）、游離化（FA%）和聚合化（PA%）花色苷比率：樣品pH 值調(diào)至3.6，取2 mL 酒樣加20 μL 10%乙醛溶液，反應(yīng)45 min；模擬酒溶液（12%的酒精，5 g/L 酒石酸，0.2 mol/L 氯化鈉，pH 3.6） 稀釋0.2 mL 酒樣20 倍；另取2 mL 酒樣，加160 μL 5%SO2反應(yīng)后，分別測定波長520 nm 下吸光度Aacet、A20、ASO2。樣品中各比率計(jì)算如下：

1.3.4 花色苷酚的檢測 采用Agilent 1100 HPLC/MSD Trap-VL 儀分析樣品中的花色苷[15]。樣品定性依據(jù)本實(shí)驗(yàn)室建立的花色苷譜庫中質(zhì)譜、光譜和保留時(shí)間信息。定量以二甲花色素-3-O-葡萄糖苷為標(biāo)準(zhǔn)物外標(biāo)法定量，所有花色苷均以相當(dāng)于二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷的含量計(jì)。

1.3.5 非花色苷的檢測 采用Agilent 1200 HPLC-VWD-MS 儀，分析酒樣中的非花色苷酚[16]。樣品定性依據(jù)本實(shí)驗(yàn)室建立的非花色苷酚譜庫中質(zhì)譜、光譜和保留時(shí)間信息。定量方法采用各非花色苷酚為標(biāo)準(zhǔn)物外標(biāo)法定量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 20.0（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）軟件進(jìn)行ANOVA 分析和LSD 多重比較，顯著性分析基于P<0.05 顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 基本理化參數(shù)分析

陳釀前對試驗(yàn)用“赤霞珠”干紅葡萄酒理化指標(biāo)進(jìn)行測定。試驗(yàn)用酒在陳釀前各理化指標(biāo)符合國標(biāo)GB/T 15038-2006 對干紅葡萄酒的要求。

表1 葡萄酒理化指標(biāo)Table 1 Conventional enological parameters of wine

2.2 陳釀過程中顏色的變化

陳釀過程中顏色變化的CIELAB 參數(shù)如表2，酒體L*值隨陳釀時(shí)間延長逐漸升高，表現(xiàn)為顏色由較深向較淺狀態(tài)轉(zhuǎn)變。與對照相比，添加咖啡酸組在陳釀過程中可減緩酒體顏色淺化速度，且減緩淺化能力與添加濃度呈正相關(guān)。陳釀4 個(gè)月時(shí)輔色作用明顯，添加組的L*值相比于陳釀起始時(shí)出現(xiàn)下降趨勢，且添加組的L*值是對照組的86%（100 mg/L），85%（200 mg/L），82%（400 mg/L），分析是由于咖啡酸增加了酒中花色苷的輔色化程度而改變酒體的顏色。有研究發(fā)現(xiàn)陳釀4～8 個(gè)月后，酒體L*值只與酒中的非花色苷酚有關(guān)，酚類物質(zhì)越多酒體亮度越暗[17]。Gao 等[18]也有類似的研究結(jié)果，因此陳釀階段的輔色素對酒體明亮程度起著十分重要的作用。

酒體a*值隨著陳釀時(shí)間的延長逐漸下降，表現(xiàn)為紅色色調(diào)減弱，經(jīng)添加的酒樣不僅減緩a*值的下降速度，而且在陳釀4，8 個(gè)月時(shí)，a*值均高于陳釀起始時(shí)。陳釀12 個(gè)月時(shí)，咖啡酸100，200，400 mg/L 處理樣品的a*值分別是對照的123%，130%，133%。瓶儲12 個(gè)月時(shí)，添加組樣品對a*值下降的減緩仍有明顯作用，且減緩作用均與添加濃度呈正相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，不同階段酚類物質(zhì)對a*值影響有所不同，陳釀4～8 個(gè)月后，游離花色苷對a*值影響變小，只有部分乙酰化的花色苷和幾類非花色苷酚與a*值呈顯著正相關(guān)[17]。

適當(dāng)?shù)腷*值可使酒體顏色更鮮艷飽滿[19]。b*值的高低與酒體的黃、藍(lán)色調(diào)相關(guān)。隨著陳釀時(shí)間的延長b*值上升，酒體黃色色調(diào)加深。咖啡酸處理后的酒樣不僅減緩陳釀過程中b*值上升速度，且陳釀4，8 個(gè)月時(shí)表現(xiàn)出b*值低于陳釀起始時(shí)。瓶儲12 個(gè)月添加組樣品對減緩b*值上升仍有明顯作用，且減緩作用與添加濃度基本呈正相關(guān)。有研究表明，陳釀第8 個(gè)月時(shí)，咖啡酸與b*值呈極顯著負(fù)相關(guān)，說明咖啡酸含量越多，酒體黃色調(diào)越少[17]。

ΔE*ab由樣品的L*、a*、b*值計(jì)算出表示樣品間顏色差異的指標(biāo)，ΔE*ab＞3 酒樣之間的顏色具有肉眼可辨識差異[20]。由表2知，不同時(shí)期添加組的全部酒樣顏色與對照相比均有肉眼可辨識差別（ΔE*ab=6.13～13.26 a.u.），各時(shí)期ΔE*ab值大小與咖啡酸添加濃度呈正相關(guān)。

表2 陳釀過程中CIELAB 參數(shù)（a.u.，±SD）Table 2 The CIELAB indexes during the aging （a.u.，±SD）

表2 陳釀過程中CIELAB 參數(shù)（a.u.，±SD）Table 2 The CIELAB indexes during the aging （a.u.，±SD）

注：CK：對照；C-1：咖啡酸100 mg/L；C-2：咖啡酸200 mg/L；C-3：咖啡酸400 mg/L；T0：木桶陳釀第0 個(gè)月；T4：木桶陳釀第4 個(gè)月；T8：木桶陳釀第8 個(gè)月；T12：木桶陳釀第12 個(gè)月；P6：瓶儲第6 個(gè)月；P12：瓶儲第12 個(gè)月。樣品間的不同字母表示存在有顯著性差異（LSD，P＜0.05）。

指標(biāo) 樣品時(shí)期T0 T4 T8 T12 P6 P12

2.3 陳釀過程中輔色化率等的變化

酒中花色苷以輔色、聚合、游離形式存在，酚類物質(zhì)可與花色苷進(jìn)行輔色作用而使酒體色澤增強(qiáng)[4]，酒中輔色化率隨陳釀時(shí)間延長逐漸下降。由表3知，添加咖啡處理使酒樣的輔色化率下降程度得到緩解，在陳釀初期甚至還出現(xiàn)了提升。José等[21]也有相類似研究結(jié)果。陳釀4 個(gè)月時(shí)輔色化率達(dá)到峰值，添加組比陳釀起始時(shí)分別增加2%（100 mg/L），11%（200 mg/L），12%（400 mg/L），而對照減少了11%。瓶儲12 個(gè)月添加組樣品輔色化率仍高于對照組（P<0.05）。分析是咖啡酸在陳釀過程中通過脫羧形成乙基或乙烯基酚類化合物，參與酒中部分吡喃型花色苷或更大分子質(zhì)量花色苷衍生物的生成[22-23]。

聚合色素由酒中游離和輔色化花色苷轉(zhuǎn)變生成，相同條件下比游離花色苷具有更強(qiáng)的抗水化和抗SO2漂白的能力，有較強(qiáng)的顏色穩(wěn)定性[24]。聚合色素比率在陳釀期間逐漸上升，陳釀起始時(shí)4組試樣平均聚合色素比率為21%，瓶儲12 個(gè)月時(shí)為68%，說明陳釀過程為酒中聚合色素的產(chǎn)生提供了時(shí)間基礎(chǔ)。結(jié)合陳釀過程中輔色化率變化規(guī)律，分析是輔色反應(yīng)形成較穩(wěn)定的復(fù)合物在陳釀過程中逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樾再|(zhì)更穩(wěn)定的聚合色素。

陳釀過程游離花色苷不穩(wěn)定，因氧化、降解或轉(zhuǎn)化而減少[25]。陳釀起始時(shí)，游離色素比率平均為40%，陳釀12 個(gè)月時(shí)，對照組游離色素比率為28%，添加組分別為15%（100 mg/L），14%（200 mg/L），13%（400 mg/L），添加組的游離色素比率下降比對照更加迅速，且添加濃度與其下降程度呈正相關(guān)。瓶儲12 個(gè)月游離色素比率進(jìn)一步降低，預(yù)測游離色素在之后的貯藏過程中仍持續(xù)降低直到消失。

由表3可知，咖啡酸處理可提升酒體在陳釀期間的輔色化水平，分析原因咖啡酸一方面具有抗氧化性，可防止花色苷氧化，也能促進(jìn)酒中其它酚類物質(zhì)的穩(wěn)定，進(jìn)而更好的保護(hù)顏色；另一方面，酚類與花色苷形成π-π 復(fù)合物，增加吸光值和最大吸收波長[26]，形成的復(fù)合物隨陳釀時(shí)間推進(jìn)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樾再|(zhì)更穩(wěn)定的物質(zhì)[27]，對酒體顏色的穩(wěn)定做出貢獻(xiàn)。

表3 陳釀過程中輔色化率、聚合色素比例、游離花色苷比率的變化 （%，±SD）Table 3 The CA，PA and FA rate of change during the aging （%，±SD）

表3 陳釀過程中輔色化率、聚合色素比例、游離花色苷比率的變化 （%，±SD）Table 3 The CA，PA and FA rate of change during the aging （%，±SD）

注：CK：對照；C-1：咖啡酸100 mg/L；C-2：咖啡酸200 mg/L；C-3：咖啡酸400 mg/L；T0：木桶陳釀第0 個(gè)月；T4：木桶陳釀第4 個(gè)月；T8：木桶陳釀第8 個(gè)月；T12：木桶陳釀第12 個(gè)月；P6：瓶儲第6 個(gè)月；P12：瓶儲第12 個(gè)月。樣品間的不同字母表示存在有顯著性差異（LSD，P<0.05）。

指標(biāo) 樣品時(shí)期T0 T4 T8 T12 P6 P12

2.4 陳釀過程中花色苷酚的變化

利用HPLC-MS 在陳釀起始時(shí)酒樣中均檢測到4 種單糖苷花色苷，8 種酰化花色苷，7 種吡喃花色苷。陳釀期間酒體的單寧可以與花色苷形成聚合物，進(jìn)而穩(wěn)定酒體顏色。此外酒中大量的單體花色苷隨陳釀時(shí)間的延長逐漸減少直至消失，取而代之的是一些吡喃花色苷和聚合花色苷等[28]，與本試驗(yàn)結(jié)果相似。

圖1 陳釀過程中酚類物質(zhì)變化Fig.1 Evolution of phenolic compounds during aging

由圖1可知，花色苷總量隨陳釀時(shí)間延長而逐漸降低，陳釀過程添加組樣品的花色苷總量高于對照。陳釀12 個(gè)月時(shí)比陳釀起始時(shí)花色苷含量平均下降56%，添加組分別比對照組高44%（100 mg/L），49%（200 mg/L），56%（400 mg/L），說明添加咖啡酸對陳釀過程中花色苷有保護(hù)和穩(wěn)定作用。游離花色苷在陳釀時(shí)會(huì)自身降解、聚合、沉淀或與其它物質(zhì)反應(yīng)導(dǎo)致其含量下降，這與Alcalde-Eon等[29]的研究結(jié)果類似。?；ㄉ兆兓厔莺蛦误w花色苷相似，瓶儲6 個(gè)月比陳釀起始時(shí)減少87%，之后含量變化幅度逐漸變小。吡喃花色苷含量也逐漸減少，陳釀過程中，咖啡酸能夠減緩吡喃花色苷的減少速度，在陳釀后期，處理樣品中吡喃花色苷含量要高于對照，分析是由于咖啡酸參與了其合成的緣故。Romero 等[30]發(fā)現(xiàn)酒中vitisins 類吡喃花色苷要比其合成前體二甲花翠素有更深的顏色，并且由于花色苷C4 位處的環(huán)化作用，使花色苷具有更強(qiáng)的顏色穩(wěn)定性。

2.5 陳釀過程中非花色苷酚的變化

利用HPLC-MS 從樣品中鑒定出黃酮醇類10種，黃烷醇類5 種，羥基苯甲酸類3 種，羥基肉桂酸類2 種。圖1表明非花色苷酚類物質(zhì)總量隨陳釀時(shí)間的推移呈下降趨勢，特別是在瓶儲第6 個(gè)月時(shí)下降迅速，之后變化平緩。

黃酮醇總量隨陳釀時(shí)間延長逐漸下降，陳釀12 個(gè)月時(shí)比陳釀起始時(shí)，對照減少71%，而咖啡酸處理減少了63%（100 mg/L），59%（200 mg/L），58%（400 mg/L），減少的比率隨添加濃度的增加而降低。黃烷醇總量隨陳釀時(shí)間延長逐漸下降，陳釀12 個(gè)月時(shí)與陳釀起始時(shí)相比，對照減少66%，而咖啡酸處理減少57%（100 mg/L），53%（200 mg/L），50%（400 mg/L），瓶儲6 個(gè)月各組酒樣中黃烷醇類物質(zhì)含量下降劇烈，減少的比率隨添加濃度的增加而降低，酒中其它物質(zhì)，如乙醛、糠醛也可參與黃烷醇的聚合反應(yīng)使其含量降低[31]。酚酸類物質(zhì)變化規(guī)律符合非花色苷酚類物質(zhì)總體規(guī)律（考慮到添加處理影響有關(guān)物質(zhì)的含量，這里將樣品中的咖啡酸含量去除進(jìn)行分析討論），陳釀起始時(shí)酚酸類含量較高，瓶儲第6 個(gè)月各組酒樣中酚酸類物質(zhì)含量下降劇烈，平均比陳釀起始時(shí)減少了89%。

3 結(jié)論

試驗(yàn)選擇橡木輔色素咖啡酸作為輔色物質(zhì)，在葡萄酒陳釀前進(jìn)行添加，通過觀察木桶陳釀和瓶儲過程中紅葡萄酒CIELAB 參數(shù)、輔色化率及酚類物質(zhì)變化情況，以研究其對干紅葡萄酒顏色品質(zhì)及其多酚的影響。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，陳釀前添加咖啡酸，將有效延緩紅葡萄酒在陳釀過程中顏色亮度（L*）的升高和紅色色調(diào)（a*）的下降，增大與對照酒樣的顏色差異（△E*ab），其產(chǎn)生效果與添加咖啡酸濃度呈正相關(guān)。另外，添加咖啡酸處理可延緩陳釀階段紅葡萄酒中花色苷輔色化程度的降低，促進(jìn)酒中聚合花色苷比率的升高，并有助于葡萄酒中單體、酰化、吡喃型花色苷含量的維持和穩(wěn)定，同時(shí)對黃酮醇、黃烷醇、酚酸這類非花色苷酚含量的下降也有延緩作用。