陳麗葉 宋洪波 安鳳平* 王藝偉 黃 群 滕 慧

（1福建農林大學食品科學學院 福州 350002

2福建省產品質量檢驗研究院 福州 350002）

乳糖不耐癥（lactose intolerance，LI）是世界性問題，影響著世界三分之二的人口，其中亞洲患病率高達95%，尤其是青少年[1]。隨著人類的生長發(fā)育，會出現體內乳糖酶活性不斷減弱的現象[2]。乳糖不耐癥還會引起一系列的健康問題，包括腸胃不適、腹脹、腹瀉、腹絞痛、惡心、嘔吐等不良癥狀[3]。針對這一人群可在食用乳制品前服用含乳糖酶膠囊、乳糖酶片等促進乳糖在胃、腸道內水解來彌補乳糖不耐癥所帶來的問題。然而，乳糖酶很容易受到胃液的影響而失活，在腸道難以很好地發(fā)揮作用。

凝膠微球因對活性成分的包埋、保護作用而被廣泛應用在食品、醫(yī)藥和個人護理用品等行業(yè)，主要制備方法有注射凝膠法、復凝聚法和熱力學不相容法等[4-5]。李妍昕等[6]以海藻酸鈉和殼聚糖作為載體，制備乳糖酶腸溶微膠囊具有很好的過胃保護作用，酶存活率達81.9%。Briones等[7]以殼聚糖和卡拉膠作為載體材料，研究葡萄糖氧化酶控釋傳遞，在胃蛋白酶溶液環(huán)境中可以保留酶活性66.4%。然而，殼聚糖需要在酸性條件下才能完全溶解，在制備過程中造成活性成分的損失；而且隨著殼聚糖濃度的增加，會明顯增大硬化劑黏度，降低對活性成分的包埋率[8-9]。

本研究以海藻酸鈉和κ-卡拉膠為包埋劑，氯化鈣和ε-聚賴氨酸為硬化劑，以離子交聯法與復凝聚法相結合制備載乳糖酶凝膠微球，使乳糖酶在胃液中少被破壞，為進一步研究其在腸環(huán)境中的釋放以及針對乳糖不耐癥人群的食品開發(fā)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳糖酶（β-半乳糖苷酶），食品級，廣西南寧龐博生物工程有限公司；ε-聚賴氨酸，食品級，鄭州拜納生物工程股份有限公司；κ-卡拉膠 （純度≥99.5%）、海藻酸鈉（純度≥99.5%）、鄰硝基苯酚-β-D-半乳糖苷（ONPG）（超純級）、考馬斯亮藍（G-250）（超純級），北京索萊寶科技有限公司；其它試劑均為分析純級，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Sartorius普及型pH計，合肥橋斯儀器設備有限公司；UV-1100紫外-可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；Sartorius BSA124S電子天平，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；5 mL注射器（配針規(guī)格：0.7 mm×31 mm TWLB），湖南平安醫(yī)械科技有限公司；RH digital磁力攪拌器，德國IKA公司；KQ5200DE數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；NSKY200B恒溫振蕩器，上海蘇坤實業(yè)有限公司；Allegra X-30R冷凍離心機，美國貝克曼庫爾特有限公司；SHZ-III循環(huán)水真空泵，上海亞榮生化儀器廠；HH-4數顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 復配膠液的制備 稱取一定量的κ-卡拉膠、海藻酸鈉（精確到0.001 g）分散到蒸餾水中，80℃水浴30 min，使其完全溶解；室溫下采用磁力攪拌器以1 000 r/min攪拌30 min使之混合均勻；超聲脫氣15 min，制得復配膠液；將質量分數為4%乳糖酶液按復配膠液∶酶液體積比為3∶1制得載酶復配膠液，備用。

1.3.2 乳糖酶膠球的制備 采用注射凝膠法（injection/gelation methods）制備凝膠微球[10-11]。 使用注射器取5 mL上述載酶復配膠液，保持注射器下端邊緣與硬化劑溶液液面間的距離為15 cm，以每2s 1滴的速度滴入10 mL硬化劑（氯化鈣-ε-聚賴氨酸）溶液中，持續(xù)攪拌 30 min，真空抽濾后，用蒸餾水清洗微球3遍，洗去表面的硬化劑，真空抽濾。將微球依次倒入一定濃度的κ-卡拉膠膠液和ε-聚賴氨酸溶液中，分別浸泡15 min，涂液后用蒸餾水沖洗3遍，真空抽濾10 min，制得乳糖酶凝膠微球。

1.3.3 乳糖酶包埋率的測定 參照文獻[7]、[12]方法，將0.1 g凝膠微球浸泡在20 mL蒸餾水中，37℃處理12 h，然后將其研磨碎；將溶液加熱到40℃，水浴保持3 h，使乳糖酶完全從聚合物網絡中釋放出來；用高速離心機以10 000 r/min室溫（20℃）離心10 min。取上清液，按照考馬斯亮藍法（Bradford method）[13]測定蛋白質含量。以牛血清蛋白為標準蛋白，通過試驗得到標準曲線：y1=7.7481x1+0.0379【式中y1和x1分別代表波長595 nm處的吸光度值和牛血清蛋白質量濃度（mg/mL）】，相關系數R2=0.9924，線性范圍為0～0.1 mg/mL。所有試驗均重復3遍。乳糖酶包埋率計算公式：

式中：EE——包埋率，%；C0——理論蛋白質含量，即直接測定載乳糖酶膠液的蛋白質含量，mg；Cr——實際蛋白質含量，即載酶凝膠微球中蛋白質含量—未載酶凝膠微球中蛋白質含量，mg。

1.3.4 乳糖酶存活率的測定

1）將0.1 g凝膠微球轉移到20 mL人工模擬胃液[14]（pH3 鹽酸緩沖液）中，37℃處理 2 h，過濾后清洗3次；2）轉移到20 mL蒸餾水中，37℃處理12 h；3）使用研缽將其研磨碎，將溶液加熱到40℃水浴保持3 h，使乳糖酶完全從聚合物網絡中釋放出來；4）使用高速離心機以10 000 r/min室溫（20℃）離心10 min。取上清液，按Talbert的方法[15]測定酶活性OD1，U/g；另取相同質量的微球直接置于蒸餾水中，同步驟 2）～4）處理后，取上清液，測定乳糖酶活性OD2，U/g，其結果作為初始酶活性100%。參照文獻[16]方法，通過試驗得到鄰硝基苯酚（ONP）標準曲線：y2=4.6943x2+0.0033【式中 y2和x2分別代表波長420 nm處吸光度值和ONP濃度（mmol/L）】，相關系數 R2=0.9999，線性范圍 0～0.15 mmol/L。所有試驗均重復3遍。乳糖酶存活率計算公式：

1.3.5 單因素試驗 采用復配膠的比例為海藻酸鈉∶卡拉膠=8∶2[17]、0.2% ε-聚賴氨酸和 0.15 mol/L CaCl2的混合溶液為硬化劑，以1.5% κ-卡拉膠溶液和0.2% ε-聚賴氨酸依次涂液2次為 “基本操作”，分別考察 1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%復配膠總質量分數對乳糖酶包埋率和存活率的影響。采用2.5%復配膠，其余條件與“基本操作”中相同，分別考察 0%，0.1%，0.2%，0.5%，0.8%和 1.0%ε-聚賴氨酸對乳糖酶包埋率和存活率的影響。采用0.8% ε-聚賴氨酸、2.5%復配膠，其余條件與“基本操作”中相同，分別考察 0.05，0.1，0.15，0.2，0.3 mol/L和0.4 mol/L CaCl2對制備載酶凝膠微球效果的影響。采用0.8% ε-聚賴氨酸、2.5%復配膠，其余條件與“基本操作”中相同，分別考察0.1%，0.5%，1%，1.5%，2.0%和 2.5% κ-卡拉膠涂液對制備載酶凝膠微球的影響。

1.3.6 Box-Benhnken中心組合試驗設計 為了評估各項因素對膠球保護乳糖酶性能的效果，在單因素試驗的基礎上，采用三因素三水平的響應面試驗設計，以乳糖酶存活率為響應值，各因素及水平設計見表1。

表1 因素與水平Table1 Factors and levels

1.3.7 數據處理 單因素方差分析采用SPSS19.0軟件，單因素各處理間的差異分析比較采用Duncan新復極差法，繪圖使用Origin9.0軟件，響應面的方差分析采用Design-Expert 8.0.6軟件。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 復配膠總質量分數對乳糖酶包埋率和存活率的影響 由圖1可知，在復配膠總質量分數為1.0%～2.5%范圍，隨著復配膠總質量分數的增加，乳糖酶包埋率和存活率均呈明顯增加；繼續(xù)增加復配膠總質量分數，包埋率下降，而乳糖酶存活率變化不大。這是因為復配膠總質量分數對凝膠微球的成型影響很大，復配膠濃度較低時，凝膠微球中分子之間間距比較大，所形成的凝膠微球較為松弛，機械強度較差，在洗球過程中容易造成乳糖酶的流失，使得包埋率較低[17]。隨著復配膠總質量分數的增加，形成的凝膠微球變得結實，能較好地保護乳糖酶，使人工模擬胃液處理過的凝膠微球中乳糖酶存活率增大；之后隨著復配膠總質量分數的繼續(xù)增加（至3.0%），保護作用達到極限，然而膠液黏度過大，造成下滴速度慢，所形成的凝膠微球變小，造成包埋率的略微減小[18]，乳糖酶存活率也有所減小。最終選擇復配膠總質量分數范圍2.0%～3.0%。

2.1.2 ε-聚賴氨酸質量分數對乳糖酶包埋率和存活率的影響 由圖2可知，隨著ε-聚賴氨酸質量分數的增加，乳糖酶包埋率和存活率均呈上升的趨勢。在ε-聚賴氨酸質量分數大于0.2%時，包埋率基本不變；在ε-聚賴氨酸質量分數大于0.8%時，乳糖酶存活率基本不變。這是因為ε-聚賴氨酸的用量影響乳糖酶凝膠微球的形態(tài)及機械強度。ε-聚賴氨酸是一種天然的陽離子聚合物，能與陰離子線性多糖海藻酸鈉和卡拉膠發(fā)生很強作用，在凝膠微球表面形成一層膜，從而提高了其包埋效率，同時這層膜也保護了包埋的乳糖酶免受酸的破壞，使乳糖酶存活率增加[19]。當ε-聚賴氨酸濃度達到一定值時，與陰離子多糖電荷中和，使兩者間相互作用達到飽和[20]。當ε-聚賴氨酸濃度增大到一定值后，乳糖酶包埋率和存活率變化不大。在后續(xù)的工藝優(yōu)化中，選擇ε-聚賴氨酸質量分數范圍為0.2%～0.8%。

2.1.3 CaCl2濃度對乳糖酶包埋率和存活率的影響 由圖3可知，一方面，CaCl2濃度在0.05～0.3 mol/L范圍對乳糖酶存活率的影響不大，繼續(xù)增大CaCl2濃度，乳糖酶存活率下降，這是因為高濃度的CaCl2與海藻酸鈉和卡拉膠快速交聯，使凝膠微球表面變脆、易破裂，導致人工模擬胃液滲入，破壞乳糖酶活性[21-22]。另一方面，隨著CaCl2濃度的增大，包埋率顯著提高；當CaCl2濃度達到0.15 mol/L時包埋率達到最大值；進一步增大CaCl2濃度，包埋率呈下降的趨勢。這是因為增大CaCl2濃度，使聚合物的骨架縫隙增多，有利于包埋乳糖酶；CaCl2濃度過大時，由于鈣離子與陰離子多糖快速交聯，僅在凝膠微球表面形成質地堅硬、脆的表層，阻止了鈣離子進一步向內部擴散，使凝膠微球內部結構不均勻，從而無法充分包埋乳糖酶，使包埋率下降[23]。由于CaCl2濃度對乳糖酶存活率影響較小，且當CaCl2濃度為0.15 mol/L時包埋率很大，因此后續(xù)的工藝優(yōu)化中固定CaCl2濃度為0.15 mol/L。

圖1 復配膠總質量分數對乳糖酶包埋率和存活率的影響Fig.1 Effect of complex gel mass fraction on the entrapment efficiency and survival rate for lactase

圖3 CaCl2濃度對乳糖酶包埋率和存活率的影響Fig.3 Effect of CaCl2concentration on the entrapment efficiency and survival rate for lactase

2.1.4 κ-卡拉膠涂液質量分數對乳糖酶包埋率和存活率的影響 由圖4可知，在0%～0.5%涂液質量分數范圍，包埋率隨涂液質量分數的增大而增大；繼續(xù)增大涂液質量分數至2.0%時，包埋率變化不大；當涂液質量分數大于2.0%時，包埋率明顯下降。這是因為當涂液質量分數大于2.0%時，許多凝膠微球粘在一起且球的表面不能形成均勻的膜，在后續(xù)清洗過程中，凝膠微球分離，表面進一步被破壞，導致包埋率顯著下降。另外，隨著涂液濃度的增大，乳糖酶存活率提高，當涂液質量分數為1.5%時乳糖酶存活率達到最大值，繼續(xù)增大涂液質量分數，乳糖酶存活率下降。這是因為κ-卡拉膠濃度較低時，所形成的涂液膜厚度小，保護乳糖酶活性能力較差；而κ-卡拉膠濃度過大時，由于其膠液呈弱堿性，對乳糖酶活性造成一定的影響，從而使乳糖酶存活率降低[22]。涂液除了具有保護酶活之外，還起到一定的緩釋作用[24]。經綜合考慮，選1.0%～2.0%κ-卡拉膠溶液為后續(xù)工藝的涂液質量分數范圍。

圖2 ε-聚賴氨酸質量分數對乳糖酶包埋率和存活率的影響Fig.2 Effect of ε-polylysine mass fraction on the entrapment efficiency and survival rate for lactase

圖4 κ-卡拉膠涂液質量分數對乳糖酶包埋率和存活率的影響Fig.4 Effect of κ-carrageenan coating mass fraction on the entrapment efficiency and survival rate for lactase

2.2 響應面試驗結果

2.2.1 響應面試驗設計及結果 本優(yōu)化的目是獲得凝膠微球經模擬胃液處理后乳糖酶存活率最高的工藝條件。從單因素試驗結果可知，因素A（復配膠總質量分數）和B（ε-聚賴氨酸質量分數）對乳糖酶存活率和包埋率的影響趨勢類似，因素C（κ-卡拉膠涂液質量分數）在1.0%～2.0%范圍對包埋率影響不大且可保持高的包埋率。以乳糖酶存活率為考察指標。采用Box-Behnken設計方法優(yōu)化載乳糖酶凝膠微球的制備條件，試驗設計方案及結果見表2。

表2 Box-Behnken試驗設計及結果Table2 Box-Behnken experimental design and results

2.2.2 二次回歸模型的建立及分析 利用Design-Expert 8.0.6對表2的結果進行統(tǒng)計分析，建立載乳糖酶凝膠微球的乳糖酶存活率與3個變量的二次多項回歸模型：

對回歸模型進行方差分析，結果見表3。

表3 回歸模型方差分析表Table3 Variance analysis for the fitted regression model

由表3可知，模型P值<0.0001，表明該模型差異極顯著；失擬項P值為0.0884，大于0.05，表明失擬項不顯著。模型的決定系數R2=0.9961，說明模型響應值變化的99.61%來源于所選變量，試驗所產生的誤差較小；模型的噪音比為42.367，大于4，表明此回歸模型與試驗數據擬合程度和可信度較高。該模型可用來預測載乳糖酶凝膠微球經過人工模擬胃液處理后乳糖酶存活率的變化情況。

由方差分析結果可知，各因素對乳糖酶存活率的影響順序為：B（ε-聚賴氨酸質量分數）＞C（κ-卡拉膠涂液質量分數）＞A （復配膠總質量分數）；各因素的一次項和二次項均對乳糖酶存活率的影響極顯著，ε-聚賴氨酸質量分數和κ-卡拉膠涂液質量分數的交互作用對乳糖酶存活率的影響顯著。各因素對響應值的影響不是簡單的線性關系，可利用該回歸方程確定最佳工藝條件。

2.2.3 各因素交互作用對乳糖酶存活率的響應面分析 圖5是為κ-卡拉膠涂液質量分數固定為1.5%時，復配膠總質量分數和ε-聚賴氨酸質量分數對乳糖酶存活率影響的響應面圖和等高線圖。由圖5可得，乳糖酶存活率隨著ε-聚賴氨酸質量分數的增加而提高，當ε-聚賴氨酸質量分數增加到一定值后，乳糖酶存活率微有下降；在低ε-聚賴氨酸質量分數區(qū)，增大復配膠總質量分數對乳糖酶存活率的增大作用不顯著，當ε-聚賴氨酸質量分數大于0.5%時，增大復配膠總質量分數對提高乳糖酶存活率作用較為顯著。

圖6是在ε-聚賴氨酸質量分數固定為0.5%時，κ-卡拉膠涂液質量分數和復配膠總質量分數對乳糖酶存活率影響的響應面圖和等高線圖。隨著κ-卡拉膠涂液質量分數的增大，乳糖酶存活率提高，當κ-卡拉膠涂液質量分數達到一定區(qū)域時，乳糖酶存活率變化平緩，隨后降低；在低質量分數κ-卡拉膠涂液區(qū)，乳糖酶存活率隨著復配膠總質量分數的增加而增加，在高質量分數κ-卡拉膠涂液區(qū)，乳糖酶存活率也呈增大趨勢，變化較緩慢。

圖7是復配膠總質量分數固定為2.5%時，κ-卡拉膠涂液質量分數和ε-聚賴氨酸質量分數對乳糖酶存活率影響的響應面圖和等高線圖。ε-聚賴氨酸質量分數和κ-卡拉膠涂液質量分數具有較明顯的交互作用。在低ε-聚賴氨酸濃度區(qū)，隨著κ-卡拉膠涂液質量分數的增大，乳糖酶存活率提高；在高質量分數ε-聚賴氨酸區(qū)，隨著κ-卡拉膠涂液質量分數的增大，乳糖酶存活率提高較緩慢。在低或高質量分數卡拉膠涂液區(qū)，隨著ε-聚賴氨酸質量分數的增加，乳糖酶存活率先提高后逐漸降低；在中等質量分數κ-卡拉膠涂液區(qū)，乳糖酶存活率隨著ε-聚賴氨酸濃度的升高先迅速增大后趨于平緩。

圖5 因素A和B交互作用對膠球中乳糖酶存活率影響的響應面圖和等高線圖Fig.5 Respones surfaces and contour plots of the interactive effects of factor A and B on the lactase survival rate in gel beads

圖6 因素A和C交互作用對膠球中乳糖酶存活率影響的響應面圖和等高線圖Fig.6 Respones surfaces and contour plots of the interactive effects of factor A and C on the lactase survival rate in gel beads

圖7 因素B和C交互作用對膠球中乳糖酶存活率影響的響應面圖和等高線圖Fig.7 Respones surfaces and contour plots of the interactive effects of factor B and C on the lactase survival rate in gel beads

2.2.4 驗證試驗 以乳糖酶存活率最高為優(yōu)化目標，利用Design-Expert 8.0.6軟件對回歸模型（3）進行求解，得到優(yōu)化的制備工藝為：復配膠總質量分數2.85%、ε-聚賴氨酸質量分數0.64%、κ-卡拉膠涂液質量分數1.57%，在此條件下乳糖酶存活率理論預測值為86.32%。為了方便操作，將最佳工藝修訂為復配膠總質量分數2.8%、ε-聚賴氨酸質量分數0.6%、κ-卡拉膠涂液質量分數1.5%，3次重復試驗所得乳糖酶存活率平均值為（85.48±0.54）%，與理論預測值相差0.84%。在優(yōu)化條件下制備的載酶微球的乳糖酶包埋率為（90.61±2.58）%，說明優(yōu)化的條件合理、可靠。

2.3 在體外模擬胃液中的穩(wěn)定性評價

在正常情況下人胃的pH 1.0～4.0，空腹時胃腔環(huán)境的pH1.0-1.8，而飯后其pH一般為3.0～4.0[25-26]。依照類似文獻研究載益生菌凝膠微球在模擬胃液中2h內的益生菌存活率變化來設計試驗[27-28]。按照1.3.4節(jié)方法，采用優(yōu)化工藝制備的乳糖酶凝膠微球，在pH值分別為1.2，2.0，3.0和4.0的模擬胃液中處理2 h，乳糖酶存活率的變化情況如圖8所示。隨著處理時間的延長，乳糖酶活性降低；當pH值越小，乳糖酶失活越快，至2 h時乳糖酶存活率分別為 11.18%，48.27%，85.48%和94.59%，表明在空腹情況下乳糖酶存活率很低，乳糖酶存活率達 （85.48%±0.54）%，包埋率為（90.61±2.58）%。

圖8 優(yōu)化后的凝膠微球在模擬胃液中的穩(wěn)定性Fig.8 Stability of gel beads in simulated gastric environment after the process optimization

3）乳糖酶凝膠微球在體外模擬胃液中的存活率試驗表明，在空腹條件下僅能保留10%～50%的乳糖酶活性；而在飯后胃環(huán)境中，乳糖酶存活率達85%以上，具有良好的過胃保護作用。

3 結論

采用鈣離子與海藻酸鈉和κ-卡拉膠的離子交聯以及ε-聚賴氨酸的復凝聚作用形成凝膠微球，再利用κ-卡拉膠涂液和ε-聚賴氨酸涂液的復凝聚作用形成表層堅韌的壁膜，不僅有效包裹乳糖酶溶膠，而且能阻擋氫離子向凝膠微球內部擴散，減緩胃酸對乳糖酶的破壞，從而為研究凝膠微球在腸環(huán)境中釋放，發(fā)揮乳糖酶的生物學功能提供依據。

1）通過響應面分析法建立復配膠 （m海藻酸鈉∶m卡拉膠=8∶2）總質量分數、ε-聚賴氨酸質量分數和κ-卡拉膠涂液質量分數對制備凝膠微球中乳糖酶存活率關系的數學模型，相關系數R2=0.9961，失擬項不顯著，該模型能很好地預測乳糖酶存活率與各因素的關系。

2）ε-聚賴氨酸質量分數對載酶凝膠微球的乳糖酶存活率的影響最大，其次為κ-卡拉膠涂液質量分數的影響，復配膠總質量分數的影響最小。這3個因素的一次項和二次項均對乳糖酶存活率的影響極顯著，ε-聚賴氨酸質量分數和κ-卡拉膠涂液質量分數的交互作用對乳糖酶存活率的影響顯著。優(yōu)化的乳糖酶凝膠微球的最佳制備工藝為：復配膠總質量分數2.8%、ε-聚賴氨酸質量分數0.6%、κ-卡拉膠涂液質量分數1.5%，在此條件下在腸道難以充分發(fā)揮作用；而在飯后pH3～4時還能保持85%以上的乳糖酶活性，為在腸道中發(fā)揮作用奠定基礎。