方潔，朱建坡，張虎，呂志峰#，張淑香

河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院1麻醉科，2血液腫瘤科，鄭州 450000

膀胱癌是常見的泌尿系統(tǒng)腫瘤之一，發(fā)病率逐 年上升[1]。惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展與抑癌基因失活、原癌基因激活等密切相關(guān)，如何激活已經(jīng)失活的抑癌基因，使其重新獲得活性已成為抗腫瘤基因治療的熱點(diǎn)。肌成束蛋白1（fascin 1，F(xiàn)SCN1）最早于海膽的卵母細(xì)胞質(zhì)中被發(fā)現(xiàn)，屬于肌動蛋白結(jié)合蛋白家族成員，在人體正常組織中的表達(dá)水平相對較少，而在多種惡性腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)[2-3]。研究顯示，抑制FSCN1的表達(dá)可降低乳腺癌細(xì)胞的增殖能力[4]，miRNA-145可靶向抑制FSCN1的表達(dá)，從而抑制前列腺癌和胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移能力[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)，抑制FSCN1的表達(dá)可抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖能力[7]，但FSCN1對膀胱癌細(xì)胞凋亡的影響及具體的作用機(jī)制尚未明確。普魯卡因是一種較為安全的局部麻醉藥物，研究表明，普魯卡因可抑制膀胱癌、鼻咽癌等腫瘤細(xì)胞的生長[8-9]。若FSCN1基因可增加普魯卡因?qū)Π螂装┘?xì)胞的生長抑制作用，這將明顯有助于膀胱癌的治療。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transduction and activator of transcription 3，STAT3）可參與細(xì)胞增殖、分化和凋亡等多種生物學(xué)過程，并在多種腫瘤細(xì)胞中異常激活，磷酸化STAT3（phospho-STAT3，p-STAT3）也與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲密切相關(guān)[10]。細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1）是調(diào)控細(xì)胞周期G1期的關(guān)鍵蛋白，在膀胱癌中過表達(dá)，參與膀胱癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程[11]。Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2-associated X protein，BAX）是促凋亡因子，其表達(dá)情況可間接反映細(xì)胞的凋亡情況。本研究通過干擾小RNA（small interfering RNA，siRNA）抑制膀胱癌細(xì)胞FSCN1基因的表達(dá)，探討FSCN1siRNA聯(lián)合普魯卡因?qū)Π螂装┘?xì)胞增殖、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響及作用機(jī)制，以期為膀胱癌的治療提供理論基礎(chǔ)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器

人膀胱癌T24細(xì)胞購自美國模式菌種收集中心（American Type Culture Collection，ATCC）細(xì)胞庫。RPMI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清均購自美國GIBCO公司，噻唑藍(lán)（methylthiazolyldiphenyl tetrazolium，MTT）溶液購自美國Sigma公司，膜聯(lián)蛋白V（AnnexinⅤ）-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）凋亡檢測試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，F(xiàn)SCN1、STAT3、p-STAT3、cyclin D1、BAX和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體均購自美國CST公司，辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的二抗購自美國Thermo Scientific公司，酶標(biāo)儀購自美國BIO-RAD公司，流式細(xì)胞儀購自美國Beckman公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染采用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)人膀胱癌T24細(xì)胞，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細(xì)胞，以5×105/ml的濃度接種于6孔板。當(dāng)細(xì)胞融合度為70%時(shí)，將陰性對照的siRNA和FSCN1siRNA分別轉(zhuǎn)染至人膀胱癌T24細(xì)胞，分別作為NC組和si-FSCN1組，將僅加入LipofectamineTM2000的T24細(xì)胞作為對照組，補(bǔ)加培養(yǎng)液至2 ml，轉(zhuǎn)染體積為100 pmol，轉(zhuǎn)染5～6 h，更換為含血清及青霉素和鏈霉素的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.2 細(xì)胞處理及分組取轉(zhuǎn)染后的NC組、si-FSCN1組T24細(xì)胞，分別向其中加入4 mmol/L的普魯卡因處理48 h，分別作為普魯卡因組和普魯卡因+si-FSCN1組；未加入普魯卡因的對照組T24細(xì)胞不進(jìn)行特殊處理。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布情況取對照組、si-FSCN1組、普魯卡因組和普魯卡因+si-FSCN1組細(xì)胞，預(yù)冷后磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）沖洗，400 μl的1×結(jié)合緩沖液（binding buffer）重懸細(xì)胞（約含有 1×106個細(xì)胞），緩慢加入1 ml的70%預(yù)冷乙醇，于4℃冰箱中固定過夜，PBS沖洗，加入含有100 μg/ml的PI染色液，避光反應(yīng)30 min，流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的周期分布情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 MTT 法檢測細(xì)胞增殖能力取對照組、si-FSCN1組、普魯卡因組和普魯卡因+si-FSCN1組T24細(xì)胞，以每孔4×103/ml的濃度接種于96孔板，每孔 100 μl，常規(guī)培養(yǎng) 24 h，每孔加入 5 mg/ml的MTT溶液20 μl，培養(yǎng)4 h后加入二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）100 μl，振蕩混勻 10 min，酶標(biāo)儀測定570 nm處的吸光度（A）值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況取對照組、si-FSCN1組、普魯卡因組和普魯卡因+si-FSCN1組細(xì)胞，預(yù)冷后 PBS 洗滌細(xì)胞，400 μl的 1×binding buffer重懸細(xì)胞（約含有1×106個細(xì)胞），分別加入5 μl和 10 μl的 Annexin V-FITC/PI溶液，避光孵育 15～20 min，1 h內(nèi)采用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的凋亡情況，檢測前加入 1×binding buffer溶液 300 μl。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測FSCN1、STAT3、p-STAT3、cyclin D1和BAX 蛋白的相對表達(dá)量裂解液提取對照組、NC組、si-FSCN1組、普魯卡因組和普魯卡因+si-FSCN1組細(xì)胞的總蛋白，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法測定蛋白濃度。取30 μg的變性蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate-poly-acrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，洗膜后采用5%的脫脂奶粉室溫封閉，4℃搖床孵 育 一 抗（1∶1000稀 釋 的 FSCN1、STAT3、p-STAT3、cyclin D1、BAX 及內(nèi)參 GAPDH 抗體）過夜，洗膜，加入HRP標(biāo)記的二抗（1∶2000），37℃孵育 1.5 h，電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）液顯色、定影。Quantity軟件分析各蛋白條帶灰度值，以目的蛋白與GAPDH蛋白灰度值比值作為各蛋白的相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FSCN1蛋白相對表達(dá)量的比較

轉(zhuǎn)染后，si-FSCN1組T24細(xì)胞FSCN1蛋白的相對表達(dá)量為（0.09±0.01），明顯低于對照組的（0.36±0.04）和NC組的（0.37±0.04），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=10.671、10.633，P＜0.01）；且NC組和對照組細(xì)胞FSCN1蛋白的相對表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 細(xì)胞周期分布情況的比較

普魯卡因組、si-FSCN1組和普魯卡因+si-FSCN1組細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例均高于對照組細(xì)胞，G2/M期、S期細(xì)胞比例均低于對照組細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；且普魯卡因+si-FSCN1組細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例高于普魯卡因組和si-FSCN1組細(xì)胞，G2/M期及S期細(xì)胞比例均低于普魯卡因組和si-FSCN1組細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表1）

表1 4組細(xì)胞周期分布情況的比較（±s）

表1 4組細(xì)胞周期分布情況的比較（±s）

注：a與對照組比較，P<0.05；b與普魯卡因組比較，P<0.05；c與si-FSCN1組比較，P<0.05

組別G0/G1期G2/M期S期對照組55.06±1.6528.23±0.8516.71±0.42普魯卡因組67.49±1.78a22.33±0.77a10.18±0.35a si-FSCN1組65.35±1.51a23.45±0.81a11.20±0.38a普魯卡因+si-FSCN1組77.21±2.01a b c16.52±0.53a b c6.27±0.27a b c F值81.134123.343431.282 P值0.0000.0000.000

2.3 細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞凋亡率的比較

普魯卡因組、si-FSCN1組和普魯卡因+si-FSCN1組細(xì)胞A值均低于對照組細(xì)胞，細(xì)胞凋亡率均高于對照組細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；且普魯卡因+si-FSCN1組細(xì)胞A值低于普魯卡因組和si-FSCN1組細(xì)胞，細(xì)胞凋亡率高于普魯卡因組和si-FSCN1組細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表2）

表2 4組細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞凋亡率的比較（±s）

表2 4組細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞凋亡率的比較（±s）

注：a與對照組比較，P<0.05；b與普魯卡因組比較，P<0.05；c與si-FSCN1組比較，P<0.05

組別A值 凋亡率（%）對照組0.84±0.073.46±0.32普魯卡因組0.52±0.05a26.37±2.02a si-FSCN1組0.58±0.05a19.18±1.63a普魯卡因+si-FSCN1組0.31±0.03a b c38.81±3.16a b c F值54.228155.325 P值0.0000.000

2.4 STAT3、p-STAT3、cyclin D1和BAX蛋白的相對表達(dá)量的比較

Western blot檢測結(jié)果顯示，普魯卡因組、si-FSCN1組和普魯卡因+si-FSCN1組細(xì)胞p-STAT3、cyclin D1蛋白的相對表達(dá)量均低于對照組細(xì)胞，BAX蛋白的相對表達(dá)量均高于對照組細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；普魯卡因+si-FSCN1組細(xì)胞p-STAT3、cyclin D1蛋白的相對表達(dá)量均低于普魯卡因組和si-FSCN1組細(xì)胞，BAX蛋白的相對表達(dá)量均高于普魯卡因組和si-FSCN1組細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。4組細(xì)胞STAT3蛋白的相對表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表3）

表3 4組細(xì)胞STAT3、p-STAT3、cyclin D1和BAX蛋白相對表達(dá)量的比較（±s）

表3 4組細(xì)胞STAT3、p-STAT3、cyclin D1和BAX蛋白相對表達(dá)量的比較（±s）

注：a與對照組比較，P<0.05；b與普魯卡因組比較，P<0.05；c與si-FSCN1組比較，P<0.05

組別STAT3p-STAT3cyclin D1BAX對照組0.77±0.070.20±0.020.49±0.050.11±0.01普魯卡因組0.75±0.070.09±0.01a0.17±0.02a0.16±0.02a si-FSCN1組0.75±0.070.11±0.01a0.24±0.03a b0.16±0.02a普魯卡因+si-0.76±0.070.04±0.01a b c0.07±0.01a b c0.41±0.04a b c FSCN1組F值0.05690.36399.683109.741 P值0.9820.0000.0000.000

3 討論

FSCN1是一種細(xì)胞骨架蛋白，可與F肌動蛋白交聯(lián)從而調(diào)節(jié)細(xì)胞膜片狀偽足、絲狀偽足及微棘的形成，影響腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移[12]。研究顯示，除肺癌和肝癌外，F(xiàn)SCN1蛋白在大部分上皮腫瘤組織中表達(dá)水平較高，且明顯高于正常組織[13]，表明FSCN1在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。但也有研究表明，抑制FSCN1的表達(dá)可抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖能力[14]。研究顯示，F(xiàn)SCN1在膀胱癌患者膀胱組織中表達(dá)水平較高，且與腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[15]，抑制FSCN1的表達(dá)可抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖能力[7]。因此，本研究旨在探討抑制FSCN1的表達(dá)對膀胱癌細(xì)胞的影響。

RNA干擾是一種新的基因阻斷技術(shù)，可在轉(zhuǎn)錄后抑制相關(guān)基因的表達(dá)水平，因其對相關(guān)基因的抑制作用與基因敲除類似，且具有高特異性和高效性的優(yōu)勢，目前已廣泛地應(yīng)用于基因功能研究和腫瘤的治療中[16-17]。本研究結(jié)果顯示，si-FSCN1組細(xì)胞A值降低，凋亡率升高，且細(xì)胞被阻滯在G0/G1期。普魯卡因是一種常用的局部麻醉藥物，臨床主要用于支氣管哮喘和老年慢性病等的治療，研究發(fā)現(xiàn)，普魯卡因可用于抗腫瘤治療，可抑制包括膀胱癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤細(xì)胞的生長[8]。抑制FSCN1基因的表達(dá)聯(lián)合普魯卡因治療膀胱癌成為臨床研究的熱點(diǎn)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，普魯卡因聯(lián)合FSCN1siRNA抑制膀胱癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和阻滯細(xì)胞周期的作用比FSCN1siRNA或普魯卡因單獨(dú)使用的效果更加明顯，表明FSCN1siRNA聯(lián)合普魯卡因治療膀胱癌可產(chǎn)生協(xié)同作用。

STAT3是是一類重要的轉(zhuǎn)錄因子，在多種惡性腫瘤細(xì)胞和腫瘤組織中表達(dá)異常，與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移、免疫逃逸等行為密切相關(guān)，STAT3的持續(xù)激活可引起細(xì)胞的增殖異常和惡性轉(zhuǎn)化[18-20]。但STAT3并不直接作用于腫瘤細(xì)胞，而是通過對一些與腫瘤增殖、凋亡等相關(guān)因子表達(dá)的調(diào)控影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。cyclin D1是STAT3信號下游的靶基因，作為細(xì)胞周期核心因子，可使腫瘤細(xì)胞由G1期向S期轉(zhuǎn)變，在包括膀胱癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤中異常表達(dá)，具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的作用[21-22]。BAX是B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2家族成員，具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，可調(diào)控多種惡性腫瘤細(xì)胞的凋亡過程[23-24]。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)SCN1siRNA或普魯卡因均可抑制p-STAT3、cyclin D1蛋白的表達(dá)，上調(diào)BAX蛋白的表達(dá)，且二者聯(lián)合的調(diào)控作用更明顯，表明FSCN1siRNA和普魯卡因均可通過下調(diào)STAT3信號通路的表達(dá)抑制膀胱癌細(xì)胞的生長。

綜上所述，普魯卡因或FSCN1均可抑制膀胱癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，將腫瘤細(xì)胞阻滯于G0/G1期，且可能通過STAT3信號通路發(fā)揮協(xié)同作用。