劉源，倪漸鳳，李芳芳，尹先哲#

1南陽市第二人民醫(yī)院腫瘤科，河南 南陽 473012

2南陽市第一人民醫(yī)院腫瘤科，河南 南陽 473012

原發(fā)性肝細(xì)胞癌（簡稱肝癌）是常見惡性腫瘤，主要來源于肝細(xì)胞和肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞，其中肝細(xì)胞肝癌占比超過90%[1-2]。原發(fā)性肝細(xì)胞癌惡性程度較高，由于肝細(xì)胞具有較強(qiáng)的代償功能，因此，80%的患者確診時(shí)已經(jīng)處于中晚期，全球每年超過60萬人死于肝癌，其中50%發(fā)生在中國，嚴(yán)重威脅中國居民的生命健康[3]。目前，手術(shù)切除是原發(fā)性肝細(xì)胞癌的首選治療方法，但超過60%的原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者術(shù)后出現(xiàn)了復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，5年生存率不超過5%，因此，原發(fā)性肝細(xì)胞癌術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移成為肝癌治療難點(diǎn)[4]。研究原發(fā)性肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，尋找有針對(duì)性的治療靶點(diǎn)，是目前肝癌防治的研究方向。靶向誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡是一種比較理想的治療方案，具有特異性強(qiáng)、效果好、不良反應(yīng)少等特點(diǎn)，對(duì)肝癌的治療具有很好的推廣前景。

通過Oncomine數(shù)據(jù)庫整合原發(fā)性肝細(xì)胞癌組織表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)，胰島素樣生長因子2 mRNA結(jié)合蛋白1（insulin like growth factor 2 mRNA binding protein 1，IGF2BP1）在原發(fā)性肝細(xì)胞癌中的表達(dá)明顯上調(diào)，表明IGF2BP1可能在原發(fā)性肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用[5-6]。抑制IGF2BP1的表達(dá)，可能抑制原發(fā)性肝細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力，為原發(fā)性肝細(xì)胞癌的治療提供了方向。研究表明，微小RNA（microRNA，miRNA）可以從多個(gè)層面調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)情況，參與機(jī)體各種生理生化的調(diào)控，與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[7]。本研究探討miRNA-196b靶向抑制IGF2BP1的表達(dá)對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖和凋亡的影響及可能機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器

肝癌HepG2細(xì)胞購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫，miRNA-196b模擬物（mimics）和陰性對(duì)照均購自上海吉瑪生物科技有限公司，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清均購自美國GIBCO公司，噻唑藍(lán)（methylthiazolyldiphenyl tetrazolium，MTT）購自美國Amresco公司，膜聯(lián)蛋白V（AnnexinⅤ）-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）凋亡檢測(cè)試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，Trizol提取試劑盒購自美國Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連TaKaRa公司，實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）試劑盒購自寶成生物工程（大連）有限公司，細(xì)胞蛋白抽提試劑購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，鼠抗人IGF2BP1、鼠抗人caspase 3抗體均購自美國Santa Cruz公司，辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的親和純化山羊抗小鼠免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）二抗、鼠抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）單克隆抗體均購自武漢艾美捷科技有限公司，NanoDrop 2000c型蛋白核酸檢測(cè)儀購自美國Thermo公司，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀、流式細(xì)胞儀均購自美國Bio-Rad公司，BIO-RAD垂直電泳儀購自美國BD公司，凝膠成像儀購自美國UVP公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染方法采用含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)肝癌HepG2細(xì)胞，37℃、5%CO2培養(yǎng)，隔天換液，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將miRNA-196b mimics和陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染至肝癌HepG2細(xì)胞，分別作為mimics-196b組和陰性對(duì)照組，未處理的細(xì)胞作為空白對(duì)照組，培養(yǎng)48 h收集細(xì)胞，進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。

1.2.2 RT-PCR法檢測(cè)miRNA-196b和IGF2BP1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量取3組細(xì)胞胰蛋白酶消化后，根據(jù)RNA提取試劑盒操作說明書提取總RNA，測(cè)定mRNA濃度和純度，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成互補(bǔ)DNA（complementary DNA，cDNA），根據(jù)熒光定量RT-PCR試劑盒說明進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s、95℃變性5 s、60℃退火44 s共40個(gè)循環(huán)，以GAPDH作為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算miRNA-196b和IGF2BP1mRNA的相對(duì)表達(dá)量。miRNA-196b上游引物為5'-GCAGCACGCTAGGTAGTTTCC-3'，下游引物為5'-TATCGTTGTTCTCCACTCCTTGAC-3'；IGF2BP1上游引物為5'-CCTGCTGGCTCAGTATGGT-3'，下游引物為5'-GACATTCACCACTGCCGTCTC-3'；GAPDH上 游引物為5'-TCCCATCACCATCTTCCAG-3'，下游引物為5'-GGTATCCATCGCCATGCTC-3'。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測(cè)IGF2BP1和caspase3蛋白的相對(duì)表達(dá)量取3組細(xì)胞胰蛋白酶消化后，采用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌2次，加入蛋白抽提試劑冰浴2 h；離心后提取上清液，BCA法對(duì)蛋白濃度進(jìn)行檢測(cè)，調(diào)整蛋白濃度。每組加入1/5體積的5×結(jié)合緩沖液（binding buffer）進(jìn)行變性，-80℃保存?zhèn)溆?。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離蛋白，將凝膠蛋白低溫下轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜。加入一抗[鼠抗人IGF2BP1抗體（稀釋濃度為1∶1000）、鼠抗人 caspase 3 抗體（稀釋濃度為 1∶1500）]，4℃孵育過夜，加入HRP標(biāo)記的二抗（稀釋濃度為1∶1500）4℃孵育2 h，進(jìn)行顯色，用凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，以GAPDH作為內(nèi)參，以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值比值表示IGF2BP1和caspase 3蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力取3組細(xì)胞胰蛋白酶消化后，以5×103/孔的濃度接種于96孔板，每孔 200 μl，待細(xì)胞融合后每孔加入 50 μl的 MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄掉上清液，每孔加入200 μl的二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），振蕩搖勻，測(cè)定光密度（optical density，OD）值，計(jì)算細(xì)胞增殖率，細(xì)胞增殖率=（mimics-196b組OD值-陰性對(duì)照組OD值）（/空白對(duì)照組OD值-陰性對(duì)照組OD值）。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況取3組細(xì)胞胰蛋白酶消化后，轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，離心棄上清，采用1×binding buffer調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml，根據(jù)細(xì)胞凋亡AnnexinⅤ-FITC/PI檢測(cè)試劑盒說明書步驟，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miRNA-196b和IGF2BP1mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

3組細(xì)胞miRNA-196b和IGF2BP1mRNA相對(duì)表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。mimics-196b組細(xì)胞miRNA-196b相對(duì)表達(dá)量均高于陰性對(duì)照組細(xì)胞和空白對(duì)照組細(xì)胞，IGF2BP1mRNA相對(duì)表達(dá)量均低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組細(xì)胞miRNA-196b和IGF2BP1mRNA相對(duì)表達(dá)量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表1）

表1 3組細(xì)胞miRNA-196b和IGF2BP1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表1 3組細(xì)胞miRNA-196b和IGF2BP1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

注：a與陰性對(duì)照組比較，P<0.05；b與空白對(duì)照組比較，P<0.05

組別miRNA-196bIGF2BP1 mRNA空白對(duì)照組1.00±0.031.00±0.07陰性對(duì)照組0.96±0.120.94±0.10 mimics-196b組2.77±0.15a b0.66±0.04a b F值254.38917.964 P值0.0000.003

2.2 IGF2BP1和caspase3蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

3組細(xì)胞IGF2BP1和caspase 3蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。mimics-196b組細(xì)胞IGF2BP1蛋白的相對(duì)表達(dá)量均低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組細(xì)胞，caspase 3蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）?？瞻讓?duì)照組和陰性對(duì)照組細(xì)胞IGF2BP1和caspase 3蛋白的相對(duì)表達(dá)量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表2）

2.3 細(xì)胞增殖和凋亡情況比較

3組細(xì)胞OD值和細(xì)胞凋亡率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。mimics-196b組細(xì)胞OD值均低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組細(xì)胞，細(xì)胞凋亡率均高于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組細(xì)胞OD值和凋亡率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表3）

表2 3組細(xì)胞IGF2BP1和caspase 3蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表2 3組細(xì)胞IGF2BP1和caspase 3蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

注：a與陰性對(duì)照組比較，P<0.05；b與空白對(duì)照組比較，P<0.05

組別空白對(duì)照組陰性對(duì)照組mimics-196b組F值P值IGF2BP1 0.89±0.13 0.86±0.07 0.29±0.03a b 45.317 0.000 caspase 3 0.82±0.11 0.80±0.06 1.34±0.13a b 25.877 0.001

表3 3組細(xì)胞增殖和凋亡情況的比較（±s）

表3 3組細(xì)胞增殖和凋亡情況的比較（±s）

注：a與陰性對(duì)照組比較，P<0.05；b與空白對(duì)照組比較，P<0.05

OD值102.16±14.85 97.43±9.60 78.33±6.13a b 15.090 0.000細(xì)胞凋亡率（%）2.34±1.10 2.68±0.83 4.71±0.81a b 5.785 0.040組別空白對(duì)照組陰性對(duì)照組mimics-196b組F值P值

3 討論

術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致肝癌患者預(yù)后差、生存時(shí)間短的主要原因[8]，研究顯示，多種因素可導(dǎo)致肝癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[9]。miRNA廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)，長度為22～23個(gè)核苷酸，具有高度保守性，參與細(xì)胞增殖、分化和凋亡過程，在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[10]。miRNA僅占基因總量的1%～3%，卻可對(duì)超過30%的基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，約50%的腫瘤組織內(nèi)可檢測(cè)到miRNA的表達(dá)，且結(jié)果具有可重復(fù)性，表明miRNA可能與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[11-12]。不同腫瘤的miRNA在腫瘤組織中的表達(dá)情況不同，如腫瘤組織中miRNA-10b和miRNA-21等的表達(dá)上調(diào)，而miRNA-518b、miRNA-17p和miRNA-205等的表達(dá)下調(diào)，且miRNA的表達(dá)具有組織特異性，可以據(jù)此追蹤腫瘤的起源[13]。通過miRNA靶向調(diào)控mRNA表達(dá)水平，是一種新型分子靶向治療方法。miRNA與mRNA的結(jié)合具有互補(bǔ)的特點(diǎn)，但也不是完全互補(bǔ)匹配。通過相關(guān)軟件預(yù)測(cè)miRNA與mRNA是否結(jié)合，可以尋找抗腫瘤治療的特異性靶點(diǎn)，多種預(yù)測(cè)價(jià)值較高的軟件同時(shí)進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析，結(jié)果較為可靠。miRNA-196b位于第7號(hào)常染色體，在乳腺癌、淋巴瘤、白血病等腫瘤組織中低表達(dá)，其表達(dá)情況與腫瘤患者的預(yù)后密切相關(guān)[14-15]。本研究結(jié)果顯示，miRNA-196b mimics轉(zhuǎn)染后，肝癌HepG2細(xì)胞中miRNA-196b的相對(duì)表達(dá)量升高。

研究顯示，IGF2BP1與miRNA-196b結(jié)合的穩(wěn)定性最高，特異度和保守性也較好。IGF2BP1是胰島素樣生長因子RNA結(jié)合蛋白家族中的重要成員，胰島素樣生長因子2 mRNA結(jié)合蛋白（insulin like growth factor 2 mRNA binding protein，IGF2BP）可以高度特異性地與miRNA結(jié)合，并參與細(xì)胞的增殖、分化、代謝等過程[16]。IGF2BP主要表達(dá)于腫瘤組織，在正常組織中低表達(dá)甚至不表達(dá)。研究顯示，IGF2BP1在肝癌、胃癌等組織中的表達(dá)水平較高，但具體的機(jī)制尚不清楚[17]。因IGF2BP1在正常組織中基本不表達(dá)，而在多種腫瘤和（或）腫瘤來源細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，可以將IGF2BP1確定為“癌胚”。研究顯示，通過miRNA抑制IGF2BP1的表達(dá)后，腫瘤細(xì)胞的增殖能力受到抑制，而凋亡率增加[18]。因此，IGF2BP1可能作為診斷惡性腫瘤的特異性生物標(biāo)志物。caspase家族是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者，caspase 2、caspase 9等凋亡啟動(dòng)因子激活時(shí)，可導(dǎo)致caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激活下游caspase 3、caspase 6、caspase 7等凋亡執(zhí)行因子，一旦激活caspase 3，細(xì)胞凋亡將進(jìn)入不可逆階段[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，mimics-196b組細(xì)胞IGF2BP1mRNA和IGF2BP1蛋白的相對(duì)表達(dá)量均降低，caspase 3蛋白的相對(duì)表達(dá)量均增加，OD值降低且細(xì)胞凋亡率升高，表明miRNA-196b可能通過靶向抑制IGF2BP1的表達(dá)，抑制肝癌HepG2細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡。

綜上所述，通過轉(zhuǎn)染miRNA-196b mimics可以提高miRNA-196b的相對(duì)表達(dá)量，抑制IGF2BP1的表達(dá)，抑制肝癌HepG2細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡，其可能機(jī)制與miRNA-196b靶向調(diào)控IGF2BP1有關(guān)，為肝癌的靶向治療提供一定的理論依據(jù)。