譚顯東，時(shí)金棟，黃 凡，盧上飛，羊依金，郭旭晶

（成都信息工程大學(xué) 資源環(huán)境學(xué)院，四川 成都 610225）

紅曲色素是一種由紅曲菌發(fā)酵而成的優(yōu)質(zhì)天然食用色素，是紅曲霉的次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有良好的安全性以及耐光、耐熱、耐化學(xué)性[1]，因而被廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)、紡織[2]。此外，紅曲色素還具有抗菌、防腐、抗癌、抗炎、調(diào)節(jié)膽固醇以及預(yù)防和治療糖尿病等功效[1，3-6]，李泳寧等[7]的研究結(jié)果表明，富含紅曲色素的微生物發(fā)酵飼料是一種較為理想的蛋雞微生態(tài)制劑。

三七（Panax notoginseng）是一種傳統(tǒng)的藥食兩用植物，提取有效成分后的三七渣含有豐富的淀粉、蛋白質(zhì)、氨基酸、多種微量成分等營養(yǎng)物質(zhì)。目前，三七渣的處理仍主要采用焚燒、填埋和堆放等傳統(tǒng)方法，既污染環(huán)境又浪費(fèi)資源。鑒于此，部分學(xué)者開展了三七渣資源化的研究工作，如林曉等[8]采用超聲波輔助提取三七渣中總黃酮，譚顯東等[9-10]以三七渣為原料發(fā)酵生產(chǎn)靈芝菌質(zhì)和蛋白飼料。利用三七渣替代糧食作物作為發(fā)酵基質(zhì)生產(chǎn)紅曲色素，不僅可以降低生產(chǎn)成本，節(jié)約糧食，還能實(shí)現(xiàn)固體廢棄物的資源化，有助于中成藥生產(chǎn)企業(yè)實(shí)現(xiàn)清潔生產(chǎn)[11]。紅曲色素是多種色素的混合物，主要有紅色系和黃色系兩大類。本研究對(duì)固態(tài)發(fā)酵三七渣生產(chǎn)紅曲紅色素的工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，旨在提高曲紅色素的產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫色紅曲霉（Monascus purpureus）：四川省微生物資源平臺(tái)菌種保藏中心；三七渣：四川省某中成藥廠；葡萄糖、磷酸二氫鉀（均為分析純）、蛋白胨、瓊脂粉（均為生化試劑）：成都市科龍化工試劑廠。

種子液培養(yǎng)基：葡萄糖6%，蛋白胨2%，NaNO31%，MgSO4·7H2O 0.5%、KH2PO41%，pH自然。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextroseagar，PDA）培養(yǎng)基：土豆20 g，葡萄糖2.0 g，瓊脂粉2.0 g，蒸餾水100m L。

三七渣固態(tài)培養(yǎng)基：過60目篩三七渣10g，蛋白胨0.3g，磷酸二氫鉀1%，培養(yǎng)基初始含水量60%，pH自然。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2550紫外可見分光光度計(jì)：日本SHIMADZU公司；PYX-280H-C恒溫恒濕生化培養(yǎng)箱：廣東韶關(guān)科力實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；LDZX-50KB高壓滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；SF-130中藥分析研磨機(jī)：長沙中南制藥機(jī)械廠；VT1300L-U超凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 三七渣固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)紅曲色素工藝流程及操作要點(diǎn)

三七渣→過篩→預(yù)處理→接入種子液→發(fā)酵→烘干→研磨→成品

過篩：將三七渣過60目篩，篩下物料用于后續(xù)發(fā)酵。

預(yù)處理：在高壓滅菌鍋內(nèi)采用121℃高溫蒸汽對(duì)發(fā)酵基質(zhì)進(jìn)行預(yù)處理。

接入種子液：將斜面紫色紅曲霉菌種接入PDA培養(yǎng)基中，于30℃條件下恒溫培養(yǎng)5～6 d。將在PDA平板培養(yǎng)基上打孔得到的紅曲霉菌接種于種子液培養(yǎng)基中，在150 r/m in、30℃條件下培養(yǎng)5 d。將一定量的種子液接種到三七渣發(fā)酵培養(yǎng)基上。

發(fā)酵：在微生物培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行發(fā)酵。

烘干：發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵培養(yǎng)物于60℃烘干至質(zhì)量恒定。

研磨：采用分析研磨機(jī)將烘干后的發(fā)酵培養(yǎng)物粉碎至可以通過60目篩，收集成品裝袋備用。

1.3.2 三七渣固態(tài)發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

影響紅曲紅色素產(chǎn)量的主要因素有裝樣量、接種量、培養(yǎng)溫度、預(yù)處理時(shí)間、培養(yǎng)時(shí)間。因此，先進(jìn)行裝樣量（5g、7.5g、10 g、12.5 g、15 g、17.5g）、接種量（1%、5%、10%、15%、20%、25%）、培養(yǎng)溫度（26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、36℃）、預(yù)處理時(shí)間（20min、40min、60m in、80m in、100m in、120m in）、培養(yǎng)時(shí)間（6 d、7 d、8 d、9 d、10 d、11 d、12 d）單因素試驗(yàn)，對(duì)發(fā)酵工藝條件進(jìn)行初步篩選。初始發(fā)酵工藝條件為接種量10%、培養(yǎng)溫度30℃，預(yù)處理時(shí)間40m in、培養(yǎng)時(shí)間10 d。

1.3.3 三七渣固態(tài)發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以接種量（A）、裝樣量（B）、培養(yǎng)溫度（C）為影響因素，以紅曲紅色素色價(jià)為考察指標(biāo)，對(duì)固態(tài)發(fā)酵三七渣的工藝條件進(jìn)行L（933）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 固態(tài)發(fā)酵三七渣工藝條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonalexperiments for technological condition optim ization of Panax notoginseng residue by solid-state fermentation

1.3.4 紅色素色價(jià)測定方法

準(zhǔn)確稱取1.00 g發(fā)酵培養(yǎng)物（成品）置于250m L帶塞錐形瓶中，加入50m L體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶液在60℃條件下水浴提取60min，于波長500 nm處測定OD500nm值[12]。紅色素色價(jià)參照下式計(jì)算：

式中：50為乙醇提取液體積，m L。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 裝樣量對(duì)紅色素色價(jià)的影響

裝樣量對(duì)紅色素色價(jià)的影響如圖1所示。

圖1 裝樣量對(duì)紅色素色價(jià)的影響Fig.1 Effect of loading volume on color value of red pigment

由圖1可知，在裝樣量≤10g之前，隨著裝樣量的增加，紅色素色價(jià)增大；在裝樣量為10g時(shí)，色價(jià)達(dá)到最大值16.6U/g，繼續(xù)增大裝樣量對(duì)紅色素的生產(chǎn)反而有抑制作用；彭真等[13]以大米為底物發(fā)酵生產(chǎn)紅曲色素時(shí)，也發(fā)現(xiàn)存在類似規(guī)律。發(fā)酵過程中微生物的新陳代謝活動(dòng)會(huì)導(dǎo)致水分的釋放和基質(zhì)的分解，使得物料黏度變大，通透性降低，散熱困難，造成物料溫度升高，進(jìn)而影響微生物的新陳代謝[14]。因此選擇最佳裝樣量為10 g。

2.1.2 接種量對(duì)紅色素色價(jià)的影響

接種量對(duì)紅色素色價(jià)的影響如圖2所示。

圖2 接種量對(duì)紅色素色價(jià)的影響Fig.2 Effect of inoculum on color value of red pigment

由圖2可知，在接種量≤15%之前，隨著接種量的增加，紅色素色價(jià)增大；在接種量為15%時(shí)，色價(jià)達(dá)到最大值19.2U/g，繼續(xù)增大接種量對(duì)紅色素的生產(chǎn)反而有抑制作用，這與彭真等[13，15-16]的研究結(jié)果相似。原因可能是采用較大的接種量有利于生產(chǎn)出更多的菌體蛋白和代謝產(chǎn)物。但是另一方面，采用過高的接種量也會(huì)帶來負(fù)面影響，如由于菌體過快增殖而積累的大量代謝產(chǎn)物對(duì)發(fā)酵過程會(huì)產(chǎn)生反饋抑制作用；同時(shí)，這些代謝產(chǎn)物還會(huì)使發(fā)酵基質(zhì)的黏度增加，從而妨礙傳質(zhì)過程，最終影響菌體生長和代謝產(chǎn)物的生成。因此選擇最佳接種量為15%。

2.1.3 培養(yǎng)溫度對(duì)紅色素色價(jià)的影響

培養(yǎng)溫度對(duì)紅色素色價(jià)的影響如圖3所示。

圖3 培養(yǎng)溫度對(duì)紅色素色價(jià)的影響Fig.3 Effect of culture temperature on color value of red pigment

由圖3可知，在培養(yǎng)溫度低于30℃之前，隨著培養(yǎng)溫度的升高，紅色素色價(jià)增大；在培養(yǎng)溫度為30℃時(shí)，色價(jià)達(dá)到最大值17.4U/g，繼續(xù)升高培養(yǎng)溫度紅色素色價(jià)反而下降，這與采用玉米芯為原料的試驗(yàn)結(jié)果[17]相似。而蔣冬花等[18]采用大米為原料，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)溫度為32℃時(shí)紅色素色價(jià)最高。溫度過高或過低均會(huì)造成微生物新陳代謝速度減慢、酶活性減弱，最終導(dǎo)致紅色素的產(chǎn)量下降。考慮到節(jié)能，因此選擇最佳培養(yǎng)溫度為30℃。

2.1.4 預(yù)處理時(shí)間對(duì)紅色素色價(jià)的影響

三七渣中含有大量的天然高分子聚合物，為了便于微生物對(duì)其進(jìn)行利用，可以對(duì)三七渣進(jìn)行高溫蒸汽預(yù)處理，預(yù)處理時(shí)間對(duì)紅色素色價(jià)的影響如圖4所示。

圖4 預(yù)處理時(shí)間對(duì)紅色素色價(jià)的影響Fig.4 Effect of pre-treatment time on color value of red pigment

由圖4可知，在預(yù)處理時(shí)間＜40min之前，隨著預(yù)處理時(shí)間的延長，紅色素色價(jià)增大；在預(yù)處理時(shí)間為40m in時(shí)，色價(jià)達(dá)到最大值17.9U/g，繼續(xù)延長預(yù)處理時(shí)間紅色素色價(jià)反而下降。預(yù)處理時(shí)間過長和過短都不利于紅色素的合成。原因可能是高溫蒸汽預(yù)處理可以破壞發(fā)酵基質(zhì)中高分子聚合物的物質(zhì)結(jié)構(gòu)[19]，有助于糖化過程，但預(yù)處理時(shí)間太長，高分子聚合物水解速率越快，發(fā)酵體系中葡萄糖的生成速率就會(huì)高于消耗速率，導(dǎo)致系統(tǒng)中葡萄糖濃度過高而產(chǎn)生反饋?zhàn)瓒粜?yīng)，進(jìn)而影響相關(guān)色素合成酶的活動(dòng)，使得色素色價(jià)降低。因此，選擇最佳預(yù)處理時(shí)間為40m in。

2.1.5 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)紅色素色價(jià)的影響

培養(yǎng)時(shí)間對(duì)紅色素色價(jià)的影響如圖5所示。

圖5 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)紅曲色素色價(jià)的影響Fig.5 Effect of culture time on color value of red pigment

由圖5可知，在培養(yǎng)時(shí)間＜11 d之前，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，紅色素色價(jià)總體變化趨勢是逐漸增大，但在發(fā)酵第7～10天時(shí)紅色素色價(jià)基本維持不變，發(fā)酵第11天時(shí)，紅色素色價(jià)急劇增加，在培養(yǎng)時(shí)間為12 d時(shí)，色價(jià)達(dá)到最大值15.8U/g。培養(yǎng)時(shí)間直接影響到發(fā)酵產(chǎn)品的質(zhì)量、收率和生產(chǎn)成本，在不同的培養(yǎng)時(shí)間區(qū)段內(nèi)，紅色素色價(jià)的變化趨勢有較大的差異：這與程哲灝等[16，20]的研究結(jié)果相似。以大米和玉米粒為原料固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)紅色素時(shí)，在發(fā)酵第13天時(shí)色價(jià)達(dá)到最大值[16]；賈氏臣等[21]以大米為原料固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)紅色素時(shí)，在發(fā)酵第6天時(shí)色價(jià)達(dá)到最大值。因此，選擇最佳培養(yǎng)時(shí)間為12 d。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

為確定最優(yōu)發(fā)酵工藝條件，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，研究接種量、裝樣量、培養(yǎng)溫度對(duì)固態(tài)發(fā)酵三七渣產(chǎn)紅色素的影響，以紅色素色價(jià)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行L9（33）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，正交試驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析見表3。

由表2、表3可知，接種量、裝樣量、培養(yǎng)溫度3個(gè)因素對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響都極顯著（P＜0.01），影響程度的排序?yàn)榕囵B(yǎng)溫度＞裝樣量＞接種量。最佳發(fā)酵工藝條件為接種量15%，裝樣量12.5 g，培養(yǎng)溫度34℃，在此優(yōu)化條件下，發(fā)酵培養(yǎng)物中紅色素色價(jià)可達(dá)14.53U/g。

表2 固態(tài)發(fā)酵三七渣工藝條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonalexperiments for technologicalcondition optim ization of Panax notoginseng residue by solid-state fermentation

表3 正交試驗(yàn)方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonalexperiments

3 結(jié)論

通過本研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵工藝條件對(duì)三七渣固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)紅色素的影響較大，接種量、裝樣量、培養(yǎng)溫度對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響極顯著（P＜0.01），這3個(gè)因素對(duì)發(fā)酵結(jié)果影響程度的排序?yàn)榕囵B(yǎng)溫度＞裝樣量＞接種量。最佳發(fā)酵工藝條件為接種量15%，裝樣量12.5 g，培養(yǎng)溫度34℃，預(yù)處理時(shí)間40min，培養(yǎng)時(shí)間12 d。在此條件下，發(fā)酵培養(yǎng)物中紅色素色價(jià)可達(dá)14.53U/g。