楊 陽　郎文凱　楊 茂　劉文英

[摘要]隨著時(shí)代發(fā)展與社會(huì)進(jìn)步，細(xì)菌從被發(fā)現(xiàn)到現(xiàn)在已經(jīng)與人們的生活息息相關(guān)，怎樣抑制一些細(xì)菌的生長(zhǎng)成為人們關(guān)注的問題。本實(shí)驗(yàn)以沙棘葉為原料，通過乙醇提取，再經(jīng)過多級(jí)萃取，然后使用平板涂布菌種的方法探究沙棘葉正丁醇萃取物對(duì)三種細(xì)菌的抑菌效果。結(jié)果表明，沙棘葉正丁醇萃取物對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌三種細(xì)菌的確具有抑制效果。

[關(guān)鍵詞]沙棘葉;正丁醇;抑菌活性

中圖分類號(hào)：Q946.91 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.201912

沙棘（Hippophae rhamnoides Linn.）又名醋柳、酸刺，胡頹子科沙棘屬，是西藏本地醫(yī)生、蒙古本地醫(yī)生習(xí)用藥材。沙棘可以在許多惡劣的條件下生存，是防風(fēng)暴、固定沙土、防止水土流失、保護(hù)生態(tài)環(huán)境價(jià)值最高的樹種[1]。

有研究表明，沙棘葉黃銅提取物對(duì)人體的皮下組織具有抗炎作用[2]，對(duì)于促進(jìn)傷口的愈合，治療炎癥與燙傷等有很好的效果[3]。沙棘果實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富，據(jù)測(cè)定，其果實(shí)中含有多種維生素、脂肪酸、微量元素、亞油素、沙棘黃酮等活性物質(zhì)和人體所需的各種氨基酸[4]。近年研究還表明沙棘黃酮具有抗氧化、抗?jié)?、抗腫瘤、抗心律失常、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、提高耐缺氧能力等藥理功效[5-6]，且沙棘果多糖具有明顯的抗氧化活性，抗氧化作用隨濃度增加而加大[7]。

本文開展了沙棘葉抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)研究，對(duì)進(jìn)一步了解沙棘葉的抑菌機(jī)理以及今后開發(fā)利用沙棘以及沙棘葉等沙棘相關(guān)產(chǎn)品提供了理論依據(jù)。

1 試驗(yàn)概述

1.1 主要儀器和設(shè)備

恒溫培養(yǎng)箱：北京恒奧德科技有限公司;電子秤：廈門雄發(fā)儀器儀表有限公司;高壓蒸汽滅菌鍋：山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司;超凈工作臺(tái)：南京貝登電子商務(wù)有限公司;恒溫水浴鍋：蘇州江東精密儀器有限公司;分液漏斗、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上?？婆d儀器有限公司;電磁爐：美的集團(tuán)有限公司。

1.2 菌種

大同大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供的菌種為金黃色葡萄球菌（Staphylococcus arueus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subfilis）。

1.3 主要藥品

95% 乙醇、瓊脂、牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、正丁醇、石油醚、乙酸乙酯。

1.4 培養(yǎng)基

1.4.1 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基

牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，瓊脂15～25g，加水1 000mL，調(diào)pH到7.4～7.6。

1.4.2 液體培養(yǎng)基

牛肉膏0.5g，蛋白胨1.0g，氯化鈉0.5g，蒸餾水100mL，調(diào)pH到7.2～7.5。

1.5 沙棘材料

沙棘采用的是中國(guó)沙棘（Hippophae rhamnoides Linn.），沙棘葉購(gòu)買于山西五臺(tái)山沙棘制品有限公司，為確保數(shù)量可以完成實(shí)驗(yàn)，購(gòu)買500g。

1.6 沙棘葉正丁醇萃取物的制備

沙棘葉正丁醇萃取流程圖，見圖1。

1.6.1 沙棘葉粉碎

沙棘葉放入粉碎機(jī)中粉碎后取出篩選，將體積大的葉片加入粉碎機(jī)進(jìn)行二次粉碎，將兩次結(jié)果合并，干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2 沙棘葉粉末乙醇浸提

取100g沙棘葉粉末分別加入1L燒杯中，共4個(gè)燒杯，再分別加入1L 95%乙醇，拿玻璃棒輕微攪拌后放入4℃冰箱5h，取出后經(jīng)過濾得到濾液，保存?zhèn)溆谩Ｔ偃V渣分別放入4個(gè)1L燒杯中，重復(fù)上述步驟，棄去濾渣，將所有濾液合并。

1.6.3 減壓濃縮

啟動(dòng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀的冷凝裝置，打開水浴鍋，調(diào)節(jié)溫度為45℃，安裝回收溶劑瓶，然后打開真空泵里邊的循環(huán)水，再打開開關(guān)，將旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀的放氣活塞關(guān)閉并將沙棘葉乙醇提取液加入旋轉(zhuǎn)瓶。當(dāng)整個(gè)系統(tǒng)達(dá)到一定的真空度時(shí)，打開旋轉(zhuǎn)按鈕并調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速。等旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)結(jié)束后，得到浸膏，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.4 石油醚萃取

將上一步得到的浸膏放入燒杯中，加入部分蒸餾水?dāng)嚢枋蛊渫耆芙?。再加?倍上步蒸餾水體積的石油醚，一起加入已經(jīng)經(jīng)過檢漏的分液漏斗中，將其搖晃充分后，將分液漏斗固定并等待其中的液體靜止分層，之后將水層和石油醚萃取液分離。按照上述過程操作3次，合并本步驟所有的萃取液，將其室溫條件密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.5 乙酸乙酯萃取

將上一步得到的蒸餾水溶液再加入分液漏斗中，用3倍體積乙酸乙酯來與其混合，然后用上一步的萃取操作重復(fù)3次萃取，之后合并所有乙酸乙酯的萃取液。

1.6.6 正丁醇萃取

將上一步蒸餾水溶液加入分液漏斗，同樣加入3倍正丁醇和蒸餾水層充分混合，再用上一步萃取的操作重復(fù)3次萃取，最后合并所有的萃取液，將其保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.7 減壓濃縮

將石油醚萃取液放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，通過操作成為浸膏。然后將乙酸乙酯萃取液和正丁醇萃取液用同樣的操作達(dá)到浸膏，再放入冰箱冷凍干燥，于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 抑菌實(shí)驗(yàn)

1.7.1 菌株活化

在超凈工作臺(tái)內(nèi)用無菌接種環(huán)將試驗(yàn)菌種接到做好標(biāo)簽標(biāo)記的斜面培養(yǎng)基上，然后把細(xì)菌置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，溫度設(shè)置為36℃，時(shí)間為22h，最后放入0℃～4℃冰箱冷藏，準(zhǔn)備接下來步驟使用。

1.7.2 培養(yǎng)基平板的配制

將配置好的培養(yǎng)基倒入錐形瓶中，使用高壓蒸汽滅菌鍋濕熱滅菌后取出，放進(jìn)超凈工作臺(tái)。放好之后等待培養(yǎng)基凝固，為防止污染，需將平板倒置。最后將所有平板擺放整齊，在無菌條件下保存。

1.7.3 菌懸液的配制

在無菌的操作條件下，取出活化培養(yǎng)好的菌，用接種環(huán)分別挑取三種菌，分別接入經(jīng)過高壓蒸汽滅菌的無菌水中，輕微震蕩使其均勻。然后用麥?zhǔn)媳葷岱y(cè)菌懸液濃度，通過加入無菌水等方法控制菌懸液中的細(xì)菌數(shù)為1×108～2×108個(gè)/mL。

1.7.4 沙棘葉正丁醇提取液的配制

將沙棘葉正丁醇萃取物用電子秤稱量0.5g、1.0g、1.5g、2.0g，將其分別放入小試管后再分別加入1mL正丁醇，攪拌搖晃使其溶解。

1.7.5 用濾紙片法測(cè)定沙棘葉正丁醇萃取物的抑菌效果

首先在濾紙上畫好半徑3mm的圈，再用剪刀把濾紙剪成直徑為6mm的小圓片，分別放置于小試管內(nèi)，用報(bào)紙包裹，并將其扎緊。準(zhǔn)備好后，進(jìn)行滅菌。將滅菌后的濾紙片放在超凈工作臺(tái)中，分別放入之前準(zhǔn)備好的無菌水與提取液中，浸泡放置，以備后用。然后使用移液槍分別取300μL三種菌懸液。用無菌涂布器均勻涂布，用無菌的鑷子，分別鑷取不同濃度濾紙片，輕輕地貼在前幾步制好的平板。同時(shí)把對(duì)照組的紙片也貼在平板上。每個(gè)含菌平板上間隔一定距離貼5片，具體紙片間距大于20mm，紙片與培養(yǎng)皿壁間距超過12mm。通過培養(yǎng)后測(cè)抑菌圈直徑。

1.8 數(shù)據(jù)分析

所有的實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，之后利用Excel 2003進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 沙棘葉正丁醇萃取結(jié)果

沙棘葉萃取結(jié)果，見圖2。

2.2 沙棘葉正丁醇萃取物的抑菌作用

2.2.1 沙棘葉正丁醇萃取物對(duì)大腸桿菌的抑制效果

通過觀察培養(yǎng)基，可以看出陰性對(duì)照組的抑菌圈幾乎沒有，而其余經(jīng)過沙棘葉正丁醇萃取物浸泡后的紙片，均出現(xiàn)了抑菌圈，其中萃取液濃度為0.5g/mL和1.0g/mL的紙片抑菌圈小一點(diǎn)，2g/mL的紙片抑菌效果最好（見表1），抑菌圈周圍出現(xiàn)不同程度向周圍擴(kuò)散的無菌區(qū)域，由此可知，沙棘葉正丁醇萃取物可以抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)且抑菌效果較為明顯。

2.2.2 沙棘葉正丁醇萃取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果

觀察培養(yǎng)基，可以看到經(jīng)過沙棘葉正丁醇萃取物浸泡后的紙片均出現(xiàn)了抑菌圈，其中萃取液濃度為1.0g/mL的紙片抑菌圈小一點(diǎn)，達(dá)到了9mm，萃取液濃度是2g/mL的紙片抑菌效果較好，達(dá)到了11mm（見表2）。

其中抑菌圈周圍出現(xiàn)不同程度向周圍擴(kuò)散的無菌區(qū)域，而相對(duì)于沒有萃取物浸泡的紙片，并不存在抑制效果。因此，沙棘葉正丁醇萃取物對(duì)金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)確實(shí)存在抑制效果。并且由于抑菌圈較大，因此可以認(rèn)為效果較好。

2.2.3 沙棘葉正丁醇萃取物對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制效果

觀察培養(yǎng)基，可以看出陰性對(duì)照組抑菌圈沒有，而其余幾組經(jīng)過沙棘葉正丁醇萃取物浸泡后的紙片，在培養(yǎng)基上均出現(xiàn)了抑菌圈，其中萃取液濃度為0.5g/mL的抑菌圈為8mm，萃取液濃度為1.0g/mL的紙片抑菌圈為9mm，萃取液濃度為2g/mL的紙片抑菌效果最好，達(dá)到了12mm（見表3），其中抑菌圈周圍出現(xiàn)不同程度的向周圍擴(kuò)散的無菌區(qū)域，沙棘葉正丁醇萃取物對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)確實(shí)存在抑制效果，并且由于萃取物成分復(fù)雜，且一定范圍內(nèi)，抑菌效果隨萃取物的濃度變化而變化，因此濃度越高抑菌效果就越好。

2.3 抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，沙棘葉正丁醇萃取物對(duì)三種試驗(yàn)菌都存在不同程度的抑制作用，并且抑制效果非常明顯。在一定范圍內(nèi)，抑菌效果隨萃取物的濃度而變化，濃度越高抑菌效果就越好。

本文對(duì)沙棘葉進(jìn)行較為常規(guī)的提取萃取，從中提取部分有效成分，并對(duì)其抑菌活性做了研究。本次研究的初步成果可以作為食品保鮮防腐的技術(shù)參考，沙棘葉正丁醇萃取物可以有效抑制有害菌的生長(zhǎng)，也有利于沙棘葉資源的綜合利用。

關(guān)于萃取物抑菌效果，劉世旺等[8]將不同濃度虎耳草乙醇提取物對(duì)三種實(shí)驗(yàn)菌進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。其實(shí)驗(yàn)結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)對(duì)照比較來看，沙棘葉正丁醇萃取物與虎耳草乙醇提取物對(duì)三種菌的抑菌效果相差無幾，并且沙棘葉正丁醇萃取物對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌效果較虎耳草乙醇提取物強(qiáng)。

在萃取物應(yīng)用方面，因?yàn)槭称分谐３：斜敬螌?shí)驗(yàn)的三種試驗(yàn)菌，其均為對(duì)人體有害菌，很有可能會(huì)引起食物中毒，甚至可能會(huì)導(dǎo)致死亡。故而，沙棘葉正丁醇萃取物可以當(dāng)作一種很好的食品保鮮防腐劑。

就沙棘葉今后的發(fā)展來說，因?yàn)樯臣~中含有的多種活性成分，除了有抑菌作用，還有許多藥理作用。沙棘葉黃酮能有效地清除超氧陰離子和羥自由基，并且隨著黃酮提取液濃度的增大，清除率逐漸上升。不僅如此，沙棘葉還有許多的活性物質(zhì)并擁有不同的藥用價(jià)值。所以，沙棘葉中含有的活性成分是今后研究的內(nèi)容與方向。

實(shí)驗(yàn)還存在不足之處，沙棘葉正丁醇萃取物的抑菌作用原理復(fù)雜，本文只是初探抑菌效果，為了保證充分地利用沙棘葉資源，對(duì)其抑菌的特點(diǎn)以及機(jī)理還需要進(jìn)一步深入研究。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)以沙棘葉為原料，采用乙醇浸提，然后進(jìn)行多級(jí)萃取，得到沙棘葉正丁醇萃取液11.1g，分別以革蘭氏陽性菌中兩個(gè)較為常見的菌：金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌，以及革蘭氏陰性菌中較為常見的大腸桿菌為試驗(yàn)菌種，通過抑菌圈來評(píng)價(jià)沙棘葉正丁醇萃取物的抑菌效果。結(jié)果表明，萃取液對(duì)三種菌均出現(xiàn)不同程度的抑菌效果。沙棘葉正丁醇萃取物對(duì)革蘭氏陽性菌抑制明顯且對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌活性最好，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌相對(duì)來說較差，說明沙棘葉的正丁醇萃取物對(duì)革蘭氏陽性菌抑制十分明顯。經(jīng)過學(xué)者研究，原因很有可能是沙棘葉中有效的抗菌活性物質(zhì)含量比較高。并且沙棘葉正丁醇萃取物對(duì)大腸桿菌也出現(xiàn)了十分明顯的抑菌圈，由此可見，正丁醇萃取物對(duì)（下轉(zhuǎn)第頁）（上接第頁）三種試驗(yàn)菌均有抑制效果。

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收稿日期：2019-10-23

作者簡(jiǎn)介：楊陽，男，博士，講師，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物營(yíng)養(yǎng)與抗菌。