中華鱉胚胎組織原代細胞培養(yǎng)技術(shù)的研究

曹錚 林鋒 盧淑娟

摘要：基于當前市場上中華鱉商業(yè)化細胞缺乏，不利于開展其病害防控研究的現(xiàn)狀，以中華鱉胚胎為對象，采用組織塊原代培養(yǎng)技術(shù)，從孵育15～20 d的受精卵中獲得適宜的胚胎組織，經(jīng)抗生素、乙醇消毒，通過無菌條件下將組織塊均勻分散貼壁在細胞瓶中，然后于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)4 h后加入無血清M199培養(yǎng)基多次清洗，從而獲得了中華鱉胚胎組織原代細胞;在此基礎(chǔ)上分別對中華鱉胚胎細胞傳代培養(yǎng)條件、凍存與復(fù)蘇等進行系統(tǒng)性研究，初步確定中華鱉胚胎細胞培養(yǎng)溫度為26 ℃，M199或L-15培養(yǎng)基，血清濃度為15%（體積分數(shù)），通常7 d傳代1次;二甲亞砜凍存保藏后，細胞復(fù)蘇生長狀況正常。

關(guān)鍵詞：中華鱉;胚胎;原代細胞;培養(yǎng)

中華鱉是一種名貴的、經(jīng)濟價值很高的水生動物。在動物分類上，中華鱉屬脊索動物門、脊索動物亞門、爬行綱、無孔亞綱、龜鱉目、曲頸龜亞目、鱉科（Trionychidae）。鱉科現(xiàn)有7屬23種，我國僅有2屬3種，其中鱉屬有2個種，即中華鱉（Chinese soft-shelled turtle，Pelodiscus sinensis）和山瑞鱉（Palea steindachneri），其中以中華鱉最為常見。20世紀60年代日本開始進行中華鱉的人工養(yǎng)殖，我國的臺灣、泰國等地隨日本之后開始發(fā)展中華鱉的人工養(yǎng)殖，中國大陸大約于上世紀70年代中后期開始進行中華鱉工廠化人工養(yǎng)殖。隨著我國人民生活水平的日益提高，對鱉的市場需求穩(wěn)步增長，中華鱉養(yǎng)殖從20世紀90年代初期至中期進入了高速發(fā)展期。養(yǎng)殖技術(shù)也由集約化程度較低的池塘養(yǎng)殖轉(zhuǎn)化為集約化程度較高的室內(nèi)控溫溫室養(yǎng)殖，養(yǎng)殖密度大大提高。然而，隨著中華鱉規(guī)?；B(yǎng)殖的迅猛發(fā)展，品種退化、病害嚴重以及基礎(chǔ)研究薄弱等問題逐步影響著中華鱉健康養(yǎng)殖的可持續(xù)發(fā)展，特別是中華鱉各種病害大規(guī)模暴發(fā)，養(yǎng)鱉業(yè)損失慘重[1]。中華鱉病害防治成為中華鱉養(yǎng)殖過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，它直接關(guān)系到養(yǎng)殖者的經(jīng)濟效益。

近些年來，在廣大科研人員的努力下，中華鱉病害防控研究取得了一定成果，譬如張奇亞等首次從有典型癥狀、瀕于死亡的患病鱉樣品檢測到呈球形、大小直徑約為30 nm的病毒樣粒子[2];1999年，Chen等從患“紅脖子”病的中華鱉分離到了直徑120～160 nm的鱉虹彩病毒[3];2001年，范紅結(jié)等從患病的中華鱉中分離到雷氏普羅威登菌，可引起中華鱉的敗血癥，并造成肺臟、脾臟等內(nèi)臟廣泛形成干酪樣結(jié)節(jié)[4];2002年，孫紅祥等從從患穿孔病、腐皮病、溶血性腹水病等瀕死鱉的肝、心血和腹水中分離到20株細菌[5];2007年，沈錦玉等從患白底板病的中華鱉分離到嗜水氣單胞菌和遲緩愛德華氏菌[6];2008年，Li等從患白斑病的中華鱉中成功分離到淡紫擬青霉[7];2015年，劉莉等從患出血癥的中華鱉中分離到了直徑約100 nm的RNA病毒[8]。然而，由于缺少來源于中華鱉的細胞系，導(dǎo)致中華鱉生物學(xué)相關(guān)的基礎(chǔ)研究相對滯后，加上養(yǎng)殖環(huán)境的復(fù)雜性、病原的多樣性，導(dǎo)致無法對引起中華鱉發(fā)病的致病機制進行判定，進而也無法采取有效的措施來進行防治。因此，本研究采用組織原代培養(yǎng)技術(shù)，完成了中華鱉胚胎原代細胞培養(yǎng)，建立了可連續(xù)傳代的細胞系，將為中華鱉細胞生物學(xué)及其病害防控研究等提供有力支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗鱉卵 健康中華鱉卵（受精卵孵化期在15～25 d），來自浙江某中華鱉養(yǎng)殖場。

1.1.2 試劑與耗材 青霉素、鏈霉素、磷酸鹽緩沖液（PBS）、胰酶（Typsin）、二甲基亞砜（DMSO），均購自Sigma公司;培養(yǎng)基M199、L-15、胎牛血清（defined fetal bovine serum，DFBS），均為Gibco公司產(chǎn)品;細胞培養(yǎng)瓶、移液管、過濾器、移液輔助器等，均購自Axgen公司。

1.1.3 儀器 倒置顯微鏡（Olympus），Ⅱ級生物安全柜（Esco），低速冷凍離心機（Sigma），二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermol），恒溫培養(yǎng)箱（Sanyo），液氮罐（MVE）。

1.2 試驗方法

1.2.1 原代培養(yǎng) 胚胎的收集：選取已受精孵化15～25 d的受精卵，先將卵體表用70%～75%乙醇噴灑，然后用眼科剪剪破卵殼，用眼科彎頭鑷子將胚胎從卵黃中取出，移入1×PBS（pH值為7.4，500 U/mL青霉素，500 U/mL鏈霉素）中待用。

將分離出來的胚胎組織放在1×PBS（pH值為7.4，500 U/mL 青霉素，500 U/mL鏈霉素）中清洗2遍，然后置于70%～75%乙醇中浸泡10～15 s滅菌。重復(fù)1次“70%～75%乙醇浸泡”步驟。再將胚胎組織放入無血清的M199培養(yǎng)基中清洗2次，然后移到無血清的M199（含500 U/mL青霉素，500 U/mL鏈霉素）清洗2次。

組織塊的處理：將清洗干凈的組織塊移入完全培養(yǎng)基中，M199為基礎(chǔ)培養(yǎng)基加入100 U/mL青霉素，100 U/mL鏈霉素，20%胎牛血清，2 mmol/L谷氨酰氨。用眼科彎頭剪刀將組織塊剪成約1 mm3的塊狀。再用完全培養(yǎng)基清洗1次。然后用一次性細菌接種針將剪小的組織塊均勻地分散到細胞瓶壁上。

組織塊的原代培養(yǎng)：組織塊分散到細胞瓶上后，先將細胞瓶翻轉(zhuǎn)使有組織塊的這一面向上，完全培養(yǎng)基在下面先不跟組織塊接觸。3～4 h后將細胞瓶翻回來，讓完全培養(yǎng)基浸沒組織塊，置于24～31 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

原代細胞形態(tài)觀察：利用100×和400×的相差顯微鏡進行細胞外形觀察，以此確定細胞的生長狀態(tài)。其中，胚胎細胞形狀比較多，有圓形、多角形、纖維狀，甚至還有心肌細胞的產(chǎn)生（細胞可以有節(jié)奏地收縮），肺組織和腎組織多呈成纖維細胞和上皮樣細胞，以成纖維細胞居多。

1.2.2 細胞的傳代培養(yǎng) 中華鱉胚胎原代細胞進行傳代培養(yǎng)，首先對可能適宜的培養(yǎng)基（R1640、M199、L-15、MEME）進行篩選;針對傳代細胞培養(yǎng)所用培養(yǎng)基中的血清濃度，選擇體積分數(shù)20%、15%、10%等多種濃度梯度進行分析比較，分別在20、24、26、28、30 ℃等不同培養(yǎng)溫度下培養(yǎng)，以保證傳代培養(yǎng)的細胞能夠迅速增殖。

1.2.3 細胞的凍存與復(fù)蘇 配制含10%體積分數(shù)DMSO、15%胎牛血清的凍存用細胞培養(yǎng)基，挑選處于對數(shù)生長期的中華鱉可傳代細胞，利用適量的胰蛋白酶使細胞脫落下來，隨即將細胞與培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入凍存管中，然后2 000 r/min離心 2 min，去除培養(yǎng)基與胰蛋白酶，加入適量預(yù)先配制好的凍存用培養(yǎng)基，輕輕吹打混合均勻，顯微鏡觀察計數(shù)后，調(diào)節(jié)凍存培養(yǎng)基量，以細胞濃度達到106個/mL為宜。將待凍存細胞先置于4 ℃ 2～3 h后，轉(zhuǎn)入-20 ℃ 3～4 h，-80 ℃過夜，最后轉(zhuǎn)入液氮罐中長期保存。

隨機挑選置于液氮罐中凍存2個月以上的中華鱉胚胎細胞進行復(fù)蘇，先置于37 ℃水浴鍋中使其快速溶解，然后 2 000 r/min 離心5 min，去除上清，用新鮮培養(yǎng)基輕輕吹打混勻，然后轉(zhuǎn)入細胞瓶置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 細胞原代培養(yǎng)

挑選孵化19 d的中華鱉卵（圖1），再乙醇消毒后輕輕剪開卵殼，可以觀察到所挑選的受精卵明顯處于發(fā)育階段（圖2）;將胚胎組織從卵殼中剝離出來置于PBS中漂洗干凈后（圖3），再將胚胎組織置于含有抗生素培養(yǎng)基中浸泡漂洗殺菌（圖4）;處理好的胚胎組織轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基中，利用眼科手術(shù)剪將胚胎組織剪碎至1 mm3大?。▓D5）;用無菌接種針將剪碎的組織轉(zhuǎn)入細胞瓶（圖6），讓組織均勻分布以利于細胞生長（圖7）;胚胎細胞在30 ℃條件下，一般在2 d以后就可以在組織塊周圍長出原代細胞，4 d左右能長到細胞瓶表面的50%～60%，圖8為培養(yǎng)3 d時，胚胎細胞生長情況。

2.2 胚胎細胞的傳代培養(yǎng)

不同溫度、不同培養(yǎng)基、不同血清濃度的對比試驗結(jié)果表明，中華鱉胚胎細胞的傳代培養(yǎng)可以在M199或 L-15培養(yǎng)基中正常生長，在血清體積分數(shù)為15%的培養(yǎng)基中生長增殖較快，明顯優(yōu)于使用5%或10%體積分數(shù)血清的培養(yǎng)基;而在培養(yǎng)溫度方面，試驗結(jié)果顯示細胞在20 ℃生長緩慢，24～26 ℃ 生長較快，30 ℃生長旺盛但細胞容易脫落，比較可見以26 ℃的培養(yǎng)溫度最為適合細胞生長增殖。因此，中華鱉胚胎細胞的傳代細胞適宜培養(yǎng)條件可以確定為：含15%體積分數(shù)血清的M199或L-15培養(yǎng)基，26 ℃恒溫培養(yǎng)，7 d左右傳代1次。

2.3 細胞的凍存與復(fù)蘇

對比試驗表明，采用逐級梯度降溫法來保存細胞，細胞復(fù)蘇后的存活率較高，比如將凍存2個月的中華鱉胚胎細胞從液氮中取出后進行快速復(fù)蘇，在用M199培養(yǎng)基（含30%胎牛血清）進行培養(yǎng)8～10 h后，存活細胞基本貼壁;更換培養(yǎng)基，去除死細胞，利用含15%血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，一般在3 d左右，細胞單層基本鋪滿（圖9）。

3 討論與結(jié)論

雖然中華鱉細胞建系工作一直在持續(xù)，2001年李正秋等報道了中華鱉心臟組織細胞的建系過程和細胞的生物學(xué)特性[9]、2010年曾令兵等介紹了中華鱉5種組織細胞的離體培養(yǎng)情況[10]，但是迄今為止市場上并沒有商業(yè)化的中華鱉細胞系。

由于中華鱉源的細胞系缺乏，導(dǎo)致目前對其免疫學(xué)、病害致病機制研究手段受到較大局限，特別是病毒性疾病方面，目前主要集中于利用超離后電鏡觀察、超薄組織切片、組織病理學(xué)等方法進行研究[11-12]，這導(dǎo)致一方面研究進展較慢，另一方面不利于病原免疫技術(shù)的開發(fā)，比如病毒滅活疫苗這種較為快捷的病毒免疫保護方式在缺少細胞的情況下，無法進行規(guī)劃化研制，單純靠中華鱉組織病樣來源，成本既高，成品又少，不能有效地進行推廣利用。雖然經(jīng)過研究人員的長期篩選，已在10多種魚類細胞中篩選出一些對鱉病毒敏感的細胞，比如鯉上皮乳狀瘤細胞（EPC）、草魚卵巢細胞（CO）、鰻鱺性腺細胞（EG）等，可以用于觀察病毒侵染的部分屬性，但由于病毒感染宿主時有種屬特異性，導(dǎo)致其結(jié)果無法很好地說明病原的致病情況[13]。

因而，本研究通過中華鱉胚胎組織原代細胞培養(yǎng)試驗，不僅建立了1種中華鱉組織的原代細胞培養(yǎng)方法，而且獲得了可傳代培養(yǎng)的中華鱉胚胎組織細胞，這將有利于進一步在細胞水平上開展中華鱉免疫學(xué)、病原致病機理制多層面的研究，促進中華鱉病毒疫苗的研制，從而能極大地促進中華鱉養(yǎng)殖業(yè)的長期可持續(xù)性發(fā)展。

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