蒲小蘭 吳煒 林書蘭 王曉玉 王娃金
【摘 ?要】采用聚酰胺柱層析法分離總黃酮,紫外分光光度法檢測椰島牌海王酒中的總黃酮。將酒樣加聚酰胺吸附,水浴揮干乙醇,轉(zhuǎn)入層析柱,用甲醇洗脫黃酮,在波長360nm處測定其含量。蘆丁標準品濃度范圍在30?g/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系,相對標準偏差為1.8%,加標回收率在97~102之間。結(jié)果表明,本檢測方法操作簡便、穩(wěn)定性好。
【關(guān)鍵詞】總黃酮;保健酒;聚酰胺柱層析;紫外分光光度法
【中圖分類號】R151 ? ? ?【文獻標識碼】A ? ? ?【文章編號】1004-7484(2020)09-0270-02
1材料與方法
1.1儀器
島津UV—1800型紫外分光光度計;十萬分之一天平(Sartorius BP211D);千分之一天平(上海恒平電子天平 JA5003);超聲波洗器(上??茖С晝x器有限公司);數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州奧化儀器有限公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-2000);層析柱(1.5 × 50cm)、容量瓶(10 mL,25 mL,50 mL)、移液管(1mL,2 mL,5 mL)、蒸發(fā)皿、脫脂棉花。
1.2試劑
除非另有說明,本實驗所用試劑均為分析純,水為GB/T 6682規(guī)定的三級水。
蘆丁對照品(含量92.5%)購自中國食品藥品檢定研究院(批號100080 - 200707),供UV法檢查用;聚酰胺(80~100目,柱層析FCC,國藥集團化學試劑有限公司);甲醇(國藥集團化學試劑有限公司);乙醇(95%,廣東光華科技股份有限公司);氫氧化鈉(廣東光華科技股份有限公司);冰醋酸(西隴化工股份有限公司)。
1.3實驗方法
1.3.1標準曲線的制作
精密稱取在103+1℃下干燥至恒重的蘆丁對照品2.50mg至50 mL容量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度,制成每1mL含有46.25μg(按92.5%折算)的蘆丁標準儲備溶液。精密吸取該蘆丁標準儲備溶液0.0mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0mL于10mL容量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,于360nm波長處測定吸光度值,求回歸方程,用以計算試樣中總黃酮含量。
1.3.2樣品的制備
1.3.2.1聚酰胺的預處理
購買的聚酰胺先用80目不銹鋼篩子篩除大于80目的部分,然后用100目不銹鋼篩子篩除小于100目的部分,取80~100的聚酰胺,用適量90%~95%乙醇浸泡聚酰胺,不斷攪拌,除去氣泡后裝入層析柱中。用3~4倍體積的90%~95%乙醇洗脫,洗至洗脫液透明并在蒸干后無殘渣(或極少殘渣),然后用水洗脫至無醇味。再依次用2~2.5倍體積的5%NaOH溶液,1倍體積的水,2~2.5倍體積的10% 醋酸溶液洗脫,最后用蒸餾水洗至流出液pH為中性;最后將處理好的聚酰胺置于60 ℃烘干,備用。
供試品溶液的制備
準確吸取2mL保健酒樣于蒸發(fā)皿中,加入1.5g經(jīng)過預處理的聚酰胺粉(80~100目)吸附,于水浴70 ℃揮干溶劑,轉(zhuǎn)入層析柱中,用50 mL甲醇洗脫(流速為2~3s/d),洗脫液減壓濃縮后轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中,用甲醇定容,搖勻,即得。
1.3.3樣品含量的測定
取上述供試品溶液,以相應試劑為空白,在360nm波長處測定吸光度值,對比標準曲線,計算試樣中總黃酮含量。
2 結(jié)果與分析
2.1聚酰胺預處理必要性的考察
分別吸取2 mL酒樣 6份于6個蒸發(fā)皿,分為兩組,每組3份,一組加入1.5g處理過的聚酰胺粉(30~60目),另一組加入1.5g未經(jīng)處理的聚酰胺粉(30~60目)進行吸附,于水浴70 ℃揮干溶劑,然后轉(zhuǎn)入層析柱中。先用40 mL苯洗,洗脫液棄去,再用50 mL甲醇洗脫,洗脫液濃縮后轉(zhuǎn)移至25mL容量瓶中,用甲醇定容。于360 nm波長測定吸光度。結(jié)果見表1
經(jīng)成組雙側(cè)t檢驗,t= 15.584,t > t(0.05,4)=2.776,P < 0.05,即聚酰胺的處理與否對總黃酮含量測定結(jié)果有顯著性影響,故市售聚酰胺需經(jīng)過預處理才能用于供試品溶液的制備。
2.2聚酰胺粒徑的篩選
準確吸取2mL酒樣于蒸發(fā)皿中,加不同粒徑的聚酰胺粉1.5g吸附,于70℃揮干溶劑,然后轉(zhuǎn)入層析柱中。用50 mL甲醇洗脫,洗脫液濃縮后轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中,用甲醇定容。于360 nm波長測定吸光度。重復3次,結(jié)果見表2。
由表4可以發(fā)現(xiàn),聚酰胺的粒徑對總黃酮含量測定結(jié)果有顯著性影響,粒徑為80~100目的分離富集效果最佳,因此,選擇粒徑為80~100目的聚酰胺進行柱層析。
2.3樣品預處理必要性的考察
量取一定量酒樣于25 mL容量瓶中,超聲20 min,靜置。吸取2mL于蒸發(fā)皿中,加1.5g聚酰胺粉(30~60目)吸附,于水浴70℃揮干,然后轉(zhuǎn)入層析柱中。用50 mL甲醇洗脫,洗脫液濃縮后轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中,用甲醇定容,重復制備樣品3份。另取3份樣品,不經(jīng)超聲預處理,直接上樣,按上述方法處理,于360 nm波長測定吸光度,結(jié)果如表3所示。
經(jīng)成對資料雙側(cè)t檢驗,t = 3.051,t < t(0.05,2)=4.303,P > 0.05,即樣品超聲與未超聲測定的吸光度無明顯差異。所以,取樣時不需要經(jīng)過超聲處理。
2.4樣品取樣量的篩選
分別量取一定量的酒樣,用乙醇稀釋不同的倍數(shù),準確吸取一定的量,加入聚酰胺(30~60目)進行吸附,于水浴70℃揮干,然后轉(zhuǎn)入層析柱中,采用不同體積的甲醇洗脫,洗脫液濃縮,轉(zhuǎn)移至容量瓶中,用甲醇定容,測定吸光值。樣品取樣量,稀釋倍數(shù),聚酰胺用量,甲醇用量,最終定容體積及吸光值見表4
由表中的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn),樣品不稀釋直接進行聚酰胺柱層析,可以達到紫外-可見風光光度法對吸光值在0.3~0.7范圍內(nèi)的要求,考慮到供試品溶液制備過程中試劑、試藥的用量及批量檢測的效率,取樣量定為2 mL,最終定容體積為25 mL,其它參數(shù)另外考察。
2.5樣品取樣量與聚酰胺用量之間關(guān)系的考察
準確吸取樣品溶液B(2) 2mL于蒸發(fā)皿中,加不同比例地聚酰胺粉吸附,于水浴70℃揮干,然后轉(zhuǎn)入層析柱中。用50 mL甲醇洗脫,洗脫液濃縮后轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中,用甲醇定容。于360 nm波長測定吸光度。重復3次。另取1g和2g聚酰胺各三份,按上述方法處理。結(jié)果見表5
由表5可以看出,聚酰胺用量為1g和1.5g,檢測的吸光值均大于用量為2.0g的吸光值,用量為1g和1.5g的吸光值無差異,但實驗過程中發(fā)現(xiàn),采用1g聚酰胺吸附時,易出現(xiàn)黏附在蒸發(fā)皿的現(xiàn)象,因此,設(shè)定聚酰胺的用量為1.5 g。
2.6水浴溫度的考察
分別量取樣品B(2) 2 mL于不同的蒸發(fā)皿中,加入1.5 g 聚酰胺吸附,于水浴上(設(shè)置不同的水浴溫度見表6)揮干,然后轉(zhuǎn)入層析柱中。用50 mL甲醇洗脫,洗脫液濃縮后轉(zhuǎn)移至25mL容量瓶中,用甲醇定容。于360nm波長測定吸光度。每個溫度重復制備3份,對結(jié)果進行單因素方差分析,見表7
由表7可以發(fā)現(xiàn),設(shè)定的水浴溫度對總黃酮含量測定結(jié)果無顯著性影響,當水浴溫度為70℃時,水浴揮干時間約30 min,有利于操作。因此,設(shè)定水浴溫度為70℃。
2.7除雜劑的篩選
分別吸取2mL樣品B(2)于蒸發(fā)皿中,加1.5g聚酰胺粉吸附,于水浴70℃揮干,然后轉(zhuǎn)入層析柱中。方法一:先用20 mL苯洗,洗脫液棄去,再用50 mL甲醇洗脫;方法二:先用20mL 石油醚洗脫,洗脫液棄去,再用50 mL甲醇洗脫;方法三: 直接用50 mL甲醇洗脫。洗脫液濃縮后轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中,用甲醇定容,搖勻,于360nm波長測定吸光度。每種除雜劑平行制備樣品3份。結(jié)果如表8所示。
經(jīng)統(tǒng)計分析t 檢驗,苯洗脫與不除雜之間的t為0.711, 苯洗脫與石油醚洗脫的t為1.650,t
2.8洗脫劑用量的考察
準確吸取2mL樣品B(2)于蒸發(fā)皿中,加1.5g聚酰胺粉吸附,于水浴70℃揮干,然后轉(zhuǎn)入層析柱中。用甲醇洗脫,每10 mL收集一次,對洗脫液進行Alcl3反應,同時于波長360 nm處測定每一瓶洗脫液的吸光值。結(jié)果發(fā)現(xiàn):洗脫至30 mL,Alcl3反應結(jié)果幾乎為陰性,洗脫曲線表明當洗脫體積為45 mL 時,洗脫完全。洗脫曲線見圖1
為了確定最終洗脫體積,我們設(shè)選取了45 mL前后的3個體積(40、50、60mL)進行驗證,結(jié)果如表9所示,
由表9可以看出當洗脫劑甲醇的用量達到50 mL時,樣品中總黃酮能夠被洗脫完全。因此,設(shè)定甲醇的洗脫體積為50 mL。
2.9洗脫流速的考察
分別準確吸取樣品B(2)2mL于不同的蒸發(fā)皿中,加入1.5g聚酰胺吸附,于水浴70℃揮干,然后轉(zhuǎn)入層析柱中。用甲醇50 mL洗脫,設(shè)置不同的流速(見表10),洗脫液減壓濃縮后轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中,甲醇定容,搖勻,此液在360 nm處測定吸光度,對結(jié)果進行單因素方差分析,進行F 檢驗,結(jié)果見11.
由方差分析結(jié)果可以看出,洗脫流速對含量測定結(jié)果有顯著性影響,我們對5種流速進行了兩兩比較,進行q檢驗,結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同的流速組有差別,其中流速為2-3 s/d 結(jié)果最好,因此,柱層析流速為2-3 s/d。
2.10檢測波長的選擇
精密稱取蘆丁標準品2.83g(含量92.5%)至50 mL容量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度,搖勻,即得濃度為52.355?g/mL的蘆丁標準儲備液蘆丁標準溶液。以此溶液進行全波長掃描,發(fā)現(xiàn)在360 nm處有最大吸收,因此選擇360 nm作為測定波長。圖譜如圖2
2.11標準曲線和線性范圍
分別準確移取蘆丁標準溶液(52.355μg/mL)0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于10 mL容量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻。于波長360 nm處測定吸光度,以吸光度(A)對蘆丁標準溶液濃度(?g/mL)進行線性回歸,得到標準曲線y=0.0316x-0.0024,r=0.99995,數(shù)據(jù)見表1,標準曲線見圖2。由試驗結(jié)果可知,蘆丁在5.2355 ~26.1775?g/mL范圍內(nèi),呈良好線性關(guān)系。
2.12方法的檢出限
2.12.1檢出限和定量限的確定
把3倍空白值的標準偏差相對應的質(zhì)量作為檢出限。其中吸光法的檢出限L = 3 s/b。s 為空白值的標準偏差,b 為標準曲線回歸方程的斜率。20次全試劑空白值的標準偏差為0.0079,標準曲線回歸方程的斜率為0.0316,由此計算出該方法的檢出限為0.75?g。
2.12.2檢出限的驗證
直接取0.5mL蘆丁標準儲備液(52.355?g/mL)至25mL容量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,得濃度為1.0471?g/mL的溶液,于360nm波長處測定吸光度為0.03445,根據(jù)回歸方程y=0.0316x-0.0024計算濃度為1.1519?g/mL,說明該方法檢出限設(shè)置合理。
2.13精密度試驗
取一份B(2)樣品,按“3檢測方法”所述方法處理,連續(xù)測定6次,結(jié)果見表3。
結(jié)果表明,該方法精密度良好。
2.14重復性試驗
取編號為B(2)的樣品,按“3檢測方法”所述方法處理,平行處理制備6份,分別測定吸光度,結(jié)果見表2。
結(jié)果表明,該方法重復性良好。
2.15穩(wěn)定性試驗
取一份B(2)樣品,按“3檢測方法”所述方法處理,樣品制備完成后,分別在0、15、30、60、90、120 min,測定吸光度,每次測定后,容量瓶用封口膠封口并保存于冰箱中。結(jié)果見表4。
結(jié)果表明,樣品溶液在120 min內(nèi)穩(wěn)定。若樣品處理好后無法及時上機測定,容量瓶應用封口膠封口并保存于冰箱,且應在120min內(nèi)完成上機測定。
2.16重現(xiàn)性試驗
由兩名實驗人員按“3檢測方法”所述方法對樣品B(2)進行處理,每人平行操作3份,測定吸光度,結(jié)果見表5。
由表5可以看出,不同人員采用該方法對同一樣品進行處理,各自的平均吸光度分別為0.329及0.332,吸光度值相差0.003,差異極小,平均RSD為1.27%,由此說明,該方法重現(xiàn)性較好。
2.17回收率試驗
吸取2 mL已知含量的B(2)樣品(總黃酮含量為13.33mg/100mL,由多次測量的平均值計算所得)6份,按樣品含量的100%加入蘆丁標準溶液(濃度為),按“3檢測方法”所述方法處理,于360nm波長處測定吸光度,結(jié)果如表6所示。
加標回收試驗結(jié)果表明,該方法準確度高,方法可靠。
討論:
1.聚酰胺的粒徑篩選,粒徑對總黃酮含量測定結(jié)果有顯著性影響,粒徑為80~100目的分離富集效果最佳;
2.試劑篩選對樣品除雜與不除雜,對總黃酮的含量測定無顯著性差異,考慮對操作者的環(huán)保及勞動保護,因此,供試液制備不經(jīng)除雜劑洗脫。
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