氫過(guò)氧化物氧化對(duì)核桃蛋白結(jié)構(gòu)和乳化特性的影響

王丹丹 毛曉英 孫領(lǐng)鴿 吳慶智 李寶坤 程衛(wèi)東

（石河子大學(xué)食品學(xué)院 新疆石河子 832003）

脂肪氧化酶（LOX）普遍存在于植物性食品種子中[1]。植物中的LOX可能與脂肪酸過(guò)氧化，脂質(zhì)貯藏，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子的產(chǎn)生有關(guān)[2]。不飽和脂肪酸氧化酸敗導(dǎo)致核桃蛋白發(fā)生氧化酸敗，食品色澤、風(fēng)味及品質(zhì)的改變，降低核桃蛋白的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[3]。由于LOX在可控條件下催化亞油酸形成的13-氫過(guò)氧化-順-9，反-11-十八碳二烯酸（HPODE）結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，在熱、紫外線以及金屬離子存在的情況下易于分解[4]，所以有關(guān)HPODE氧化蛋白質(zhì)的研究較少。Kong等[5]報(bào)道，大豆蛋白的氧化程度與脂肪氧合酶的活性有關(guān)；Huang等[6]提出大豆蛋白的結(jié)構(gòu)經(jīng)LOX催化亞油酸反應(yīng)的產(chǎn)物氧化后發(fā)生改變。蛋白質(zhì)具有良好的兩親性，其可以結(jié)合在油水界面上，減少油水界面的表面張力，基于這一性質(zhì)，蛋白質(zhì)可以在油水界面上形成乳化液（O/W、W/O）[7]。蛋白質(zhì)的乳液性質(zhì)與結(jié)構(gòu)性質(zhì)有關(guān)，氧化引起的結(jié)構(gòu)改變，可能影響乳化性質(zhì)的改變[8]。Dickinson[9]研究乳化液，發(fā)現(xiàn)酪蛋白可在分散的液滴周?chē)纬绅椥阅?，以減少在油水界面的表面張力，這可以保持乳液的穩(wěn)定性；Wang等[8]研究酪蛋白氧化，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)氧化是導(dǎo)致乳液性質(zhì)惡化的關(guān)鍵因素。

對(duì)于LOX-亞油酸-核桃蛋白模擬氧化體系的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究以LOX催化亞油酸形成的HPODE代表LOX誘導(dǎo)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)中形成的脂質(zhì)氫過(guò)氧化物。以HPODE氧化的核桃蛋白為研究對(duì)象，利用HPODE對(duì)核桃分離蛋白（WPI）進(jìn)行不同程度的氧化修飾，通過(guò)分析WPI的氧化結(jié)構(gòu)指標(biāo)（如羰基含量、表面疏水性、粒徑分布和分子質(zhì)量大?。┮约叭榛再|(zhì)（如乳液活性及其穩(wěn)定性、乳液粒度、乳液熒光）的變化規(guī)律，探討不同亞油酸添加量所致蛋白質(zhì)氧化對(duì)核桃蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和乳化特性的影響，為進(jìn)一步闡明核桃蛋白氧化機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

新疆薄皮核桃，購(gòu)于新疆石河子市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；脂肪氧合酶（LOX I-B）（98 005 units/mg），東京化成工業(yè)株式會(huì)社，日本；亞油酸，色譜純；2，4-二硝基苯肼，1-苯氨基萘-8-磺酸等分析試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LGJ-18S冷凍干燥機(jī)，北京松源華興科技有限公司；熒光分光光度計(jì)，日立F-7000；EX30生物顯微鏡，武漢華科達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 WPI的制備 參照毛曉英的方法[10]，選取新疆當(dāng)年產(chǎn)薄皮核桃，將核桃仁在2%堿液中浸泡4 min，后手動(dòng)去皮、粉碎，以正己烷為溶劑脫脂，制備核桃脫脂粉。核桃脫脂粉醇洗后，溶于去離子水中，堿溶（pH 11）、酸沉（pH 4.5）法得到核桃分離蛋白，用去離子水調(diào)節(jié)沉淀pH 7.0，冷凍干燥得到核桃分離蛋白，至于4℃冰箱備用。

1.3.2 HPODE氧化蛋白的制備 參照葉林的方法略改[11]。配制底物亞油酸溶液：1.5 g亞油酸、1 mL 5 mmol/L NaOH溶液，2滴Tween 20搖勻混合，用0.2 mol/L pH 9.0的硼酸緩沖液于50 mL容量瓶中定容。

配制酶液：將90 mg LOX溶于50 mL pH 9.0的磷酸鹽緩沖液。

模擬反應(yīng)種類(lèi)：WPI溶于去離子水，堿液調(diào)節(jié)pH 9.0。稱(chēng)取100 g溶液于5個(gè)錐形瓶中。在5個(gè)加入10 mL酶液的100 g溶液的錐形瓶中，加入亞油酸量為 0，3，4.5，7.5，9 mL，振蕩搖勻，4℃冰箱培養(yǎng)6 h后取出，以酸液調(diào)節(jié) pH至4.5，離心（5 000 g×30 min），蛋白沉淀分散于去離子水中，調(diào)節(jié)至 pH 7.0，離心（8 000 g×30 min），除去不溶物，將其分別冷凍干燥，得到氧化核桃分離蛋白。至于4℃冰箱備用。

1.3.3 WPI乳狀液制備 上述核桃蛋白為原料制備乳狀液。1%的蛋白溶液，與體積分?jǐn)?shù)10%的大豆油，高壓均質(zhì)后得到所需乳狀液。

1.3.4 結(jié)構(gòu)測(cè)定

1.3.4.1 羰基含量的測(cè)定 參照Huang等[12]的方法進(jìn)行測(cè)定。將蛋白用去離子水配制為5 mg/mL，用雙縮脲法測(cè)定上清液中的蛋白質(zhì)含量。在367nm 處用2，4-二硝基苯肼比色，用22000 M-1cm-1消光系數(shù)計(jì)算每毫克蛋白質(zhì)羰基衍生物的物質(zhì)的量。

1.3.4.2 游離巰基和總巰基含量的測(cè)定 根據(jù)Huang[12]的方法略改，采用DNTB比色法。核桃蛋白樣品溶于0.1 mol/L含有1 mmol/L EDTA和1%SDS pH 8.0的磷酸鹽緩沖液中，測(cè)定上清液中蛋白濃度。取上清液在412 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，以13 600 M-1cm-1消光系數(shù)計(jì)算巰基和總巰基含量。

1.3.4.3 表面疏水性的測(cè)定 采用ANS熒光探針?lè)╗12]。樣品溶解于0.01 mol/L pH 8.0磷酸鹽緩沖液中，BCA 法測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)量濃度為0.005～0.5 mg/mL之間，加入ANS探針，在激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為395，473 nm下測(cè)定熒光強(qiáng)度。熒光強(qiáng)度值為Y軸，蛋白質(zhì)濃度為X軸作圖，蛋白質(zhì)濃度為0，Y軸得值即為蛋白質(zhì)表面疏水性指數(shù)。

1.3.4.4 粒徑分布測(cè)定 根據(jù)Huang的方法略改[12]。樣品溶解于0.01 mol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖液中，BCA法測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)量濃度為1mg/mL，采用納米粒度分析儀測(cè)定核桃蛋白粒徑分布。

1.3.5 乳化性質(zhì)

1.3.5.1 乳液活性及其穩(wěn)定性 乳化活性（EAI）和乳化穩(wěn)定性（ESI）方法參考文獻(xiàn)[13]。將蛋白樣品溶于去離子水中，取9 mL蛋白溶液，加3 mL大豆油，于10 000 r/min均質(zhì)2 min，立即移取50 μL于5 mL 1%SDS里面，在500 nm下測(cè)A0，此時(shí)為EAI。10 min 后，再測(cè) A10，此時(shí)為 ESI。分別代入以下公式，計(jì)算。

1.3.5.2 乳液內(nèi)源熒光測(cè)定 取乳液樣品120 μL用6 mL 0.01 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.0）稀釋?zhuān)旌暇鶆蚝笤诩ぐl(fā)波長(zhǎng)為290 nm處，掃描300～400 nm發(fā)散譜帶，狹縫寬均為5 nm。

1.3.5.3 乳狀液乳液粒度的測(cè)定 乳狀液用去離子水稀釋至1∶1 000（w/w）粒度分布儀測(cè)定乳液的粒子大小及其分布。

d3，2：表面積平均直徑（surface area mean diameter）

d4，3：體積平均直徑（volume mean diameter）

式中ni——直徑（μm）；di——脂肪球的數(shù)量。

1.3.5.4 乳液微觀結(jié)構(gòu) 使用光學(xué)顯微鏡（EX30）觀察乳液的微觀結(jié)構(gòu)，每個(gè)樣品移取 10 μL制成玻片標(biāo)本，用 400×的物鏡進(jìn)行觀察，根據(jù)照片記錄進(jìn)行分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)

每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果表示為平均數(shù)±SD。顯著性分析采用SPSS statisics 17.0分析，數(shù)據(jù)繪圖使用Origin 8.5。

2 結(jié)果與討論

2.1 氧化對(duì)結(jié)構(gòu)指標(biāo)的影響

2.1.1 核桃蛋白羰基含量分析 蛋白質(zhì)羰基含量是評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)氧化的最廣泛使用的方法之一[14]。在本文中，氫過(guò)氧化物引起的氧化用羰基群的形成來(lái)表示。結(jié)果如表1所示，在LOX催化亞油酸氧化系統(tǒng)中，亞油酸添加量增加到9 mL時(shí)，WPI樣品羰基從未氧化的2.32 nmol/mg增加到4.23 nmol/mg（P＜0.05）。羰基群的形成可以導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子間的共價(jià)結(jié)合，賴(lài)氨酸殘基氧化，形成醛類(lèi)，形成的醛類(lèi)進(jìn)一步相互作用，可與游離氨基酸群結(jié)合或者在兩個(gè)羰基群之間發(fā)生醇醛縮合[15]。蛋白羰基的形成，表明氧化可引起單個(gè)氨基酸殘基轉(zhuǎn)化[16]，多肽骨架斷裂或與非蛋白羰基化合物結(jié)合。Huang等[17]研究LOX催化亞油酸對(duì)大豆蛋白氧化時(shí)發(fā)現(xiàn)，LOX誘導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化，較高濃度氧化時(shí)，大豆蛋白羰基含量顯著增加，增加的羰基含量，暗示著氨基酸組分的變化，將會(huì)對(duì)大豆蛋白結(jié)構(gòu)改變產(chǎn)生影響。

2.1.2 核桃蛋白巰基值和總巰基含量分析 巰基（SH）的含量是蛋白質(zhì)氧化的另一個(gè)普遍的指示器[14]。不同氧化條件，巰基可以被氧化成可逆（二硫化合物和次磺酸）和不可逆（亞磺酸和磺酸）的兩種形式[18]。蛋白質(zhì)氧化，SH群丟失是最早可觀測(cè)到的指標(biāo)，這主要?dú)w因于蛋白質(zhì)內(nèi)部多肽與多肽之間形成二硫鍵[19]。不同亞油酸添加量下，WPI游離巰基和總巰基含量如表1所示，底物亞油酸含量增加，WPI的游離巰基含量下降，從2.72 nmol/mg 下降到 1.92 nmol/mg（P＜0.05）。半胱氨酸殘基是蛋白質(zhì)氧化最敏感的氨基酸殘基[14]，其和二硫鍵對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)起到重要的影響[20]。由此可得，蛋白質(zhì)氧化，可以改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特性。Wu等[21]在研究脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物對(duì)大豆蛋白氧化機(jī)理時(shí)指出，當(dāng)添加HPODE為較高氧化濃度時(shí)會(huì)導(dǎo)致巰基和總巰基含量顯著下降。本研究中，HPODE添加量在低氧化濃度時(shí)，巰基和總巰基含量都表現(xiàn)顯著下降（P＜0.05），此結(jié)果可能與原材料不同有關(guān)。

2.1.3 核桃蛋白表面疏水性分析 氧化修飾蛋白質(zhì)表面的氨基酸殘基可以對(duì)蛋白質(zhì)的構(gòu)象和空間結(jié)構(gòu)產(chǎn)生明顯的影響，表面疏水性或暴露的疏水群可以表示蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征[19]。其可以評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)構(gòu)象轉(zhuǎn)變[8]。從表1得出，亞油酸添加量達(dá)到9 mL時(shí)，WPI表面疏水性指數(shù)與未氧化的WPI相比下降了5.68%?？梢?jiàn)亞油酸氧化處理后，H0下降。這可能是因?yàn)閬喕g相互聚合，或者蛋白質(zhì)分子在疏水作用和二硫鍵相互作用下重新聚集，暴露的疏水殘基共價(jià)修飾、引入新的親水組分[22]，或者是由于氧化導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生解開(kāi)再聚集的修飾，導(dǎo)致原先暴露的疏水基團(tuán)更大的被包埋，并且形成新的親水組分 （例如羰基群）[8]。黃友如在LOX-亞油酸-大豆蛋白模擬體系中發(fā)現(xiàn)隨著大豆蛋白氧化程度的增加，表面疏水性逐漸下降[23]。

表1 不同亞油酸添加量對(duì)WPI羰基、巰基及表面疏水性的影響Table1 Effects of different amount of linoleic acid added on the carbonyl，sulfhydryl and surface hydrophobicity of WPI

2.1.4 核桃蛋白粒徑分布分析 不同亞油酸添加量下，核桃分離蛋白粒徑分布如圖1所示。與沒(méi)有氧化的樣品相比，亞油酸添加量為3 mL時(shí)，WPI的粒徑分布逐漸減小。當(dāng)?shù)孜飦営退崽砑恿繛? mL時(shí)，WPI的粒度達(dá)到最大。粒子尺寸的改變反應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)的改變?；趫D1得到的數(shù)據(jù)，粒徑分布趨勢(shì)如此可能是由于低濃度氧化引起WPI的分子結(jié)構(gòu)展開(kāi)，導(dǎo)致平均粒徑變小，這可能是由于一些較大的可溶性聚合物分解成更小的可溶性多肽。氧化程度增加，暴露的疏水基團(tuán)相互作用，生成可溶性聚集體（這與上述疏水性下降一致）?；蛘呤怯捎诙蜴I的共價(jià)結(jié)合，引起WPI的共價(jià)聚集（這與游離的SH群減少，表明氧化蛋白質(zhì)的ss形成保持一致），轉(zhuǎn)變成不可溶性聚集體，致使平均粒徑變大。

圖1 不同亞油酸添加量對(duì)WPI粒徑分布的影響Fig.1 Effects of different amount of linoleic acid added on the particle size distribution of WPI

2.2 氧化對(duì)乳化性的影響

2.2.1 核桃蛋白乳狀液活性及其穩(wěn)定性分析 不同亞油酸添加量對(duì)WPI乳化活性及乳化穩(wěn)定性的影響如圖2所示。未氧化的WPI的乳化活性指數(shù)（EAI）和乳化穩(wěn)定指數(shù)（ESI）分別為 74.66 m2/g和 20.9%。當(dāng)亞油酸添加量為4.5 mL時(shí)，兩項(xiàng)指標(biāo)均得到改善。此時(shí)，EAI和ESI分別增加到88.98 m2/g（P＜0.05）和27.49%。亞油酸添加量繼續(xù)增加，EAI呈現(xiàn)明顯降低的趨勢(shì)，而ESI降低不明顯。產(chǎn)生這種結(jié)果可能是由于巰基群氧化所形成的二硫鍵，致使蛋白質(zhì)分子之間共價(jià)交聯(lián)，形成的大分子聚集體可以在油滴表面形成更穩(wěn)定的蛋白膜[15]，所以適度氧化蛋白質(zhì)ESI有所增加。

圖2 不同亞油酸添加量對(duì)WPI乳化活性及乳化穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effects of different amount of linoleic acid added on EAI and ESI of WPI emulsion

2.2.2 核桃蛋白乳狀液內(nèi)源熒光分析 色氨酸殘基可以在激發(fā)波長(zhǎng)290 nm處，于300～400 nm范圍內(nèi)發(fā)出熒光[24]，熒光光譜分析主要由色氨酸（Trp）殘基的極性環(huán)境決定，其可監(jiān)測(cè)蛋白-蛋白、脂質(zhì)-蛋白的構(gòu)象改變[25]。新鮮核桃蛋白乳液在290 nm處激發(fā)得到色氨酸為發(fā)射基團(tuán)的熒光光譜，可以反映乳液中色氨酸殘基的氧化程度及其微環(huán)境的變化。熒光強(qiáng)度顯著降低，指示著蛋白結(jié)構(gòu)逐漸展開(kāi)[26]。表2所示，未氧化的WPI熒光強(qiáng)度為695.3，當(dāng)亞油酸添加量為9 mL時(shí)，熒光強(qiáng)度下降到664.5。此結(jié)果表明，氫過(guò)氧自由基氧化破壞了乳狀液的結(jié)構(gòu)。Estevez[27]曾報(bào)道，氧化降低了肌原纖維蛋白O/W型乳液色氨酸的熒光強(qiáng)度。發(fā)色團(tuán)更多的暴露在極性環(huán)境下，最大內(nèi)源熒光發(fā)射光譜紅移，發(fā)色團(tuán)與猝火劑相互作用，溶劑和蛋白質(zhì)熒光的量子產(chǎn)量下降[28]。然而，最大內(nèi)源熒光（λmax）從 335 移動(dòng)到 330（藍(lán)移），說(shuō)明亞油酸添加量增加，乳液中色氨酸轉(zhuǎn)移到更加疏水的非極性環(huán)境中[29]。這可能是由于氧化的WPI蛋白中，色氨酸殘基被埋藏在疏水基團(tuán)內(nèi)部，導(dǎo)致了λmax的下降。

圖3 不同亞油酸添加量對(duì)WPI乳狀液內(nèi)源熒光的影響Fig.3 Effects of different amount of linoleic acid added on fluorescence intensity of WPI emulsion

表2 不同亞油酸添加量對(duì)WPI乳狀液熒光λmax和熒光強(qiáng)度的影響Table2 Effects of different amount of linoleic acid added on λmaxand fluorescence intensity of WPI emulsion

2.2.3 核桃蛋白乳狀液乳液粒度分析 乳液液滴大小與蛋白質(zhì)的乳化能力[30]和分子間粒子的疏水作用[31]有關(guān)。乳劑的液滴粒徑影響乳化穩(wěn)定性，以及蛋白質(zhì)乳液的貨架期[32]。形成乳液的過(guò)程中，蛋白質(zhì)可以促進(jìn)油相與水相的結(jié)合，乳液中油滴的粒徑大小可以直觀的展示乳液中油滴的分散狀態(tài)[33]。d3，2反映乳液中的小顆粒組分，d3，2越小，其乳液所對(duì)應(yīng)的乳化活性較好[34]。d4，3反映蛋白質(zhì)幫

圖4 不同亞油酸添加量對(duì)WPI乳狀液乳液粒度大小的影響Fig.4 Effects of different amount of linoleic acid added on drop size of emulsion of WPI emulsion

2.2.4 核桃蛋白乳狀液微觀結(jié)構(gòu)分析 電子顯微鏡顯示了蛋白質(zhì)的微觀結(jié)構(gòu)。圖5所示亞油酸添加量不同，乳液油滴聚集形態(tài)不同。亞油酸添加量在0～4.5 mL之間，液滴大小逐漸增加。隨后，隨著氧化程度的增加，乳液液滴顆粒又變得密集。當(dāng)亞油酸添加量達(dá)到9 mL時(shí)，液滴尺寸變得最大。液滴聚結(jié)和絮凝出現(xiàn)在被過(guò)度氧化的WPI穩(wěn)定的乳劑中。這一觀察結(jié)果正好與上述闡述的乳狀液助油相分散于水相的乳化能力，d4，3越小，其乳化能力越好[35]。如圖4所示，亞油酸添加量從0～4.5 mL 時(shí)，乳狀液 d4，3、d3，2的值有所增加，當(dāng)亞油酸添加量至7.5 mL時(shí)，d3，2下降到最小，對(duì)應(yīng)乳化活性最高。由此說(shuō)明適度的氧化使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開(kāi)，暴露出更多的疏水基團(tuán)，形成可溶性聚合物[24]。這與Poon[34]報(bào)道的d3，2越小，乳液的乳化活性越好相一致。液滴大小的結(jié)果一致。乳液液滴水相中的蛋白質(zhì)，在油水界面發(fā)生聚集，隨著氧化程度的增加，液滴變大，蛋白質(zhì)聚合程度增加。這表明，氧化影響表面液滴的均勻分布。在乳液中，只有30%～40%覆蓋蛋白的界面，因?yàn)橹挥幸徊糠值氖杷鶊F(tuán)覆蓋在油水界面上，其它的蛋白肽存在于水相中[36]。乳化的過(guò)程，是在油水界面上由界面張力驅(qū)動(dòng)的分子重組和蛋白質(zhì)重排的過(guò)程[7]。

Table3 不同亞油酸添加量對(duì)WPI乳狀液乳液粒度的影響Table3 Effects of different amount of linoleic acid added on drop size of emulsion of WPI emulsion

圖5 不同亞油酸添加量對(duì)WPI乳狀液微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig.5 Effects of different amount of linoleic acid added on microstructure of WPI emulsion

2.3 蛋白氧化結(jié)構(gòu)對(duì)功能的相關(guān)性分析

皮爾遜相關(guān)性分析在結(jié)構(gòu)和乳化功能指標(biāo)之間建立相關(guān)聯(lián)系。皮爾遜相關(guān)系數(shù)清楚地表明，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)如羰基變化，可以影響其它結(jié)構(gòu)之間如巰基值、總巰基值與表面疏水性顯著變化，且與EAI呈顯著負(fù)相關(guān)，但與ESI不相關(guān)。WU等[37]報(bào)道氧化導(dǎo)致大豆蛋白質(zhì)二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的顯著變化，從而導(dǎo)致功能屬性的增加或下降，但此結(jié)果表明，結(jié)構(gòu)的改變，對(duì)功能性質(zhì)的影響并不顯著，這可能與HPODE氧化體系對(duì)蛋白質(zhì)的影響活性較低有關(guān)。

表4 乳化性質(zhì)和氧化核桃蛋白結(jié)構(gòu)的Pearson相關(guān)系數(shù)Table4 Pearson correlation coefficient of emulsifying property and oxidized walnut protein structure

3 結(jié)論

LOX催化亞油酸形成HPODE，代表LOX誘導(dǎo)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)中形成脂質(zhì)氫過(guò)氧化物。HPODE與蛋白質(zhì)分子中含ε-氨基群的賴(lài)氨酸殘基、含巰基群的半胱氨酸殘基反應(yīng)，生成共價(jià)結(jié)合物，最終導(dǎo)致蛋白質(zhì)羰基化，蛋白質(zhì)巰基群含量下降。表面疏水性由于氧化導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集，暴露的疏水殘基共價(jià)修飾，引入新的親水組分，致使表面疏水性下降。從粒徑分布結(jié)果顯示，隨著亞油酸添加量的增加，疏水基團(tuán)共價(jià)修飾及二硫鍵共價(jià)鍵導(dǎo)致聚集體的形成。由此得出，HPODE氧化會(huì)改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。HPODE對(duì)蛋白質(zhì)乳化功能的影響也做了進(jìn)一步研究，EAI/ESI結(jié)果顯示，適當(dāng)?shù)难趸瘽舛扔欣谔岣吆颂业鞍椎娜榛钚院腿榛€(wěn)定性。內(nèi)源熒光光譜分析監(jiān)測(cè)了核桃分離蛋白乳液的構(gòu)象改變，結(jié)果顯示出核桃蛋白的吸光度改變，由此說(shuō)明色氨酸的化學(xué)環(huán)境發(fā)生了改變。乳狀液乳液粒度中，d3，2反映乳液中的小顆粒組分，其表征樣品的乳化活性，當(dāng)亞油酸添加量至7.5 mL時(shí)，d3，2下降到最小，對(duì)應(yīng)乳化活性最高。電子顯微鏡顯示了蛋白質(zhì)的微觀結(jié)構(gòu)，亞油酸添加量不同，乳液油滴聚集形態(tài)不同。在結(jié)構(gòu)和乳化功能指標(biāo)之間建立皮爾遜相關(guān)性系數(shù)，結(jié)果表明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變，對(duì)功能性質(zhì)的影響并不顯著。