郜增 婁向新

東華大學(xué)（上海201620）

長期暴露在高分貝的環(huán)境、細(xì)菌感染、藥物濫用，以及一些相關(guān)的疾病等都可能導(dǎo)致內(nèi)耳毛細(xì)胞不同程度的受損或丟失，并繼而引發(fā)相連的螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的損傷和功能喪失，最終可能造成永久性的感音神經(jīng)性耳聾[1]。據(jù)報(bào)道，全球約有11億青少年因不正確使用電子產(chǎn)品及配套耳機(jī)等音響設(shè)備面臨聽力損傷風(fēng)險(xiǎn)[2]。目前，聽力中度損傷和高度損傷的治療分別通過助聽器和電子耳蝸的植入。雖然當(dāng)今醫(yī)療技術(shù)發(fā)展日新月異，但目前臨床上尚沒有安全性好、可行性高、效果顯著的治療方法來修復(fù)聽覺的損傷。組織工程技術(shù)主要通過生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、電子信息學(xué)與工程學(xué)的多學(xué)科交叉融合，以生物性替代和修復(fù)受損組織或器官為主要目標(biāo)，研究和開發(fā)人體組織器官損傷后功能和形態(tài)修復(fù)的一門新興學(xué)科[3-5]。雖然組織工程技術(shù)的誕生不足40年的歷史，但是經(jīng)過科研人員的不斷努力，該技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于人體各種組織器官的修復(fù)、維護(hù)、促進(jìn)人體各種組織或器官損傷后的功能和形態(tài)重建，例如組織工程化的骨骼，血管和皮膚等[6]。近年來，研究人員在內(nèi)耳柯蒂氏器和聽覺基底膜體外模擬構(gòu)建，以及細(xì)胞外基質(zhì)誘導(dǎo)毛細(xì)胞再生的研究和利用方面取得了一定的突破性研究進(jìn)展。本文就組織工程技術(shù)在聽覺再生研究中的最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為聽覺損傷的臨床診治提供了新的解決思路。

1 柯蒂氏器類器官的構(gòu)建

柯蒂氏器又稱螺旋器，為聽覺末梢的感受器，位于基底膜上的中階內(nèi)，由外毛細(xì)胞、內(nèi)毛細(xì)胞[7]、支持細(xì)胞等聽覺感覺細(xì)胞所組成[8]?？碌偈掀髫?fù)責(zé)將一系列的機(jī)械刺激轉(zhuǎn)化成電信號，形成神經(jīng)沖動然后通過聽神經(jīng)傳遞到大腦的聽覺中樞，進(jìn)而產(chǎn)生聽覺。李華偉教授[9]和Oshima等[10]分別研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)耳耳蝸內(nèi)組織微環(huán)境對聽覺細(xì)胞的發(fā)育和組織形成具有重要的調(diào)控作用，將干細(xì)胞進(jìn)行雞胚聽泡體內(nèi)移植或是體外與雞胚橢圓囊基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)的方法可以促進(jìn)其向聽覺毛細(xì)胞分化，研究結(jié)果表明內(nèi)耳干細(xì)胞所處的微環(huán)境以及與周圍細(xì)胞的相互作用對內(nèi)耳毛細(xì)胞的再生和功能重建具有重要的作用。但利用雞胚橢圓囊基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)毛細(xì)胞分化的步驟繁瑣、不同種屬細(xì)胞之間易交叉污染、誘導(dǎo)信號及有效誘導(dǎo)成分不明確，極大限制其研究和應(yīng)用。同時(shí)，在傳統(tǒng)二維（two-dimensional，2D）培養(yǎng)體系中，各種方法誘導(dǎo)干細(xì)胞形成結(jié)構(gòu)獨(dú)特、功能齊全、細(xì)胞類型復(fù)雜的柯蒂氏器結(jié)構(gòu)的能力非常有限。越來越多的證據(jù)表明，在相關(guān)的支架中三維（three-dimensional，3D）培養(yǎng)不僅對控制干細(xì)胞的增殖和分化是必要的，而且對干細(xì)胞向更高階結(jié)構(gòu)(如類器官)的發(fā)育非常至關(guān)重要[11]。

近年來，Koehler等[12-15]利用基質(zhì)膠（Matrigel）包被胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ESCs）制備3D懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)，成功地將小鼠ESCs轉(zhuǎn)化成內(nèi)耳聽覺上皮樣結(jié)構(gòu)，命名為“類Corti氏器”。三維懸浮培養(yǎng)使得細(xì)胞能夠利用胚胎發(fā)育過程中的生物信號和力學(xué)刺激，提供一個(gè)更接近人體早期聽覺發(fā)育的微環(huán)境，誘導(dǎo)分化后的內(nèi)耳類器官包含聽毛細(xì)胞、支持細(xì)胞及螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞等內(nèi)耳功能細(xì)胞，細(xì)胞成規(guī)整性排列并檢測到神經(jīng)沖動的釋放，這些結(jié)果對于揭示內(nèi)耳聽覺細(xì)胞再生機(jī)制以及今后研究聽覺功能重建具有重要指導(dǎo)作用。然而，Koehler的3D培養(yǎng)模式依賴基質(zhì)膠包被ESCs而形成的團(tuán)塊結(jié)構(gòu)，以至于不同層流的細(xì)胞接觸誘導(dǎo)因子的誘導(dǎo)效應(yīng)不均衡，沒有全方位模擬出聽覺上皮的多層立體結(jié)構(gòu)[14]。同時(shí)，基于基質(zhì)膠而建立的類Corti氏器只能模擬內(nèi)耳前庭的聽覺上皮的片層結(jié)構(gòu)，不能實(shí)現(xiàn)對耳蝸Corti氏器的3D[16]分層多孔結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能的真正模擬。不過，Koehler的開創(chuàng)性工作給后來的聽覺再生研究者帶來重要啟迪，類Corti氏器官的構(gòu)建和干細(xì)胞技術(shù)的結(jié)合是一個(gè)很有前途的發(fā)展和再生研究的概念。

2 耳蝸基底膜仿生模型的建立與應(yīng)用

基底膜中的主要成分有膠原蛋白、層粘連蛋白、蛋白聚糖，它們分別在聽覺細(xì)胞發(fā)育和功能化過程中起到重要的作用[17]。聽覺的產(chǎn)生是由外界聲波振動引起周圍空氣產(chǎn)生的疏密波，再通過外耳和中耳組成的聲音傳導(dǎo)系統(tǒng)傳遞到內(nèi)耳耳蝸，耳蝸內(nèi)基底膜的振動是以行波的方式傳播的，而基底膜的振動是非線性的?？碌偈掀鞒梢?guī)整的鑲嵌模型與其底部基底膜相連，可以將聲波傳導(dǎo)導(dǎo)致的機(jī)械刺激轉(zhuǎn)化成電信號，再通過聽神經(jīng)傳遞到大腦的聽覺中樞，進(jìn)而產(chǎn)生聽覺。因此，體外構(gòu)建力學(xué)特性、成分組成及誘導(dǎo)信號負(fù)載等綜合的耳蝸基底膜仿生模型不僅能對耳蝸的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和生理特性進(jìn)行模擬與研究，而且可以聽覺細(xì)胞再生及整個(gè)聽覺損傷修復(fù)的研究提供思路和方向。Bekesy[18]描述了耳蝸中基底膜的運(yùn)動形態(tài)，繼而構(gòu)建一維耳蝸簡單的力學(xué)模型。楊俊等[19]根據(jù)流體的運(yùn)動定律和基底膜的運(yùn)動特性，設(shè)計(jì)耳蝸外淋巴液二維非線性運(yùn)動方程模型，模擬結(jié)果表明，該模型部分表征了一些生理學(xué)實(shí)驗(yàn)。繆吉昌等[20]設(shè)計(jì)出了與人耳結(jié)構(gòu)非常接近的3D模型進(jìn)行模擬，建立一種仿生結(jié)構(gòu)的富含淋巴液和基底膜的盒狀模型，可以準(zhǔn)確模擬基底膜的頻率選擇性。王如彬[21]等闡述了外毛細(xì)胞在增加基底膜頻率選擇性的機(jī)械過程中的延時(shí)特性，建立了具有延時(shí)作用的基底膜主動耦合模型，從一個(gè)新的角度解釋了外毛細(xì)胞運(yùn)動對基底膜振動作用。人工耳蝸（cochlear implant,CI）[22,23]的聲學(xué)模型可以將原始聲音信號經(jīng)過前期步驟的處理，最終合成一種聲刺激信號的信號處理算法或聲碼器。林楚湘等[24]建立了一種新的CI仿真聲學(xué)模型版本可以提供直接的電脈沖-聲脈沖映射仿真，該新模型表現(xiàn)出了比經(jīng)典模型更敏感的特性。以上研究采用不同方式模擬了基底膜的結(jié)構(gòu)和物理特性，以及仿生內(nèi)毛細(xì)胞和神經(jīng)纖維間神經(jīng)遞質(zhì)的動態(tài)傳遞過程，有助于解析外周聽覺系統(tǒng)中的耳蝸基底膜、聽覺毛細(xì)胞和神經(jīng)纖維等的工作機(jī)理，進(jìn)而為研究人類聽覺系統(tǒng)損傷的修復(fù)和再生提供一定的組織工程學(xué)和生理學(xué)證據(jù)。

3 脫細(xì)胞基質(zhì)對毛細(xì)胞的再生作用

3.1 細(xì)胞外基質(zhì)的重要生理作用

細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)[25,26]是一種具有生物活性的天然生物復(fù)合材料，它對組織細(xì)胞起支持、保護(hù)、營養(yǎng)作用，對細(xì)胞的增殖、分化等生命活動有重要影響。脫細(xì)胞技術(shù)是目前獲得ECM主要采取的方法，一般是指異體組織經(jīng)細(xì)胞滅活處理后，通過脫細(xì)胞工藝去除細(xì)胞而保留其生物活性成分和結(jié)構(gòu)，是含有多種信號分子構(gòu)成高度協(xié)調(diào)的有機(jī)統(tǒng)一體，主要包括膠原、彈性蛋白、氨基葡糖、結(jié)構(gòu)蛋白等。脫細(xì)胞基質(zhì)材料修復(fù)缺損組織再生的機(jī)制是“內(nèi)源性誘導(dǎo)再生”，脫細(xì)胞基質(zhì)中的膠原纖維形成三維多孔連通網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，為細(xì)胞遷移、長入、合成新生膠原蛋白提供物理微環(huán)境，而保留細(xì)胞外基質(zhì)中的各種活性成分與生長因子，實(shí)現(xiàn)組織的形成和結(jié)構(gòu)重塑。從仿生學(xué)角度看，脫細(xì)胞基質(zhì)是機(jī)體組織修復(fù)的基礎(chǔ)，能夠誘導(dǎo)并促進(jìn)細(xì)胞的黏附、增殖、分化及組織形成，是最適合細(xì)胞和組織生長的生物材料[27]。

3.2 兩種重要的外源性活性因子

近年來研究結(jié)果顯示，哺乳動物內(nèi)耳感覺上皮中存在內(nèi)耳干細(xì)胞或前體細(xì)胞，由于增殖能力以及與之相關(guān)的調(diào)控機(jī)制處于相對抑制狀態(tài)，無法通過自身的增殖和分化，修復(fù)和再生受損毛細(xì)胞[28-30]。ECM中一些關(guān)鍵的外源性活性因子（細(xì)胞生長因子和分化因子）對毛細(xì)胞的再生具有關(guān)鍵的誘導(dǎo)作用，且可以提供專門的微環(huán)境來調(diào)節(jié)干細(xì)胞的行為，有可能參與對聽覺細(xì)胞損傷的修復(fù)。Hoftman等在腦和垂體的抽提物中發(fā)現(xiàn)一種能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞生長的物質(zhì)-堿性成纖維生長因子（bFGF）對內(nèi)耳支持細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用，支持細(xì)胞是毛細(xì)胞再生的前體細(xì)胞，因此bFGF對內(nèi)耳毛細(xì)胞的再生有促進(jìn)作用。EGF是一種小分子多肽鏈，能夠有效的促進(jìn)細(xì)胞的分裂，可以促進(jìn)體內(nèi)或體外的多種組織和不同類型細(xì)胞的分裂增殖。趙玉林等[31]發(fā)現(xiàn)EGF在小鼠耳蝸上皮發(fā)育中的表達(dá)呈現(xiàn)明顯的階段性及組織特異性分布的特點(diǎn)，說明EGF參與小鼠耳蝸上皮的發(fā)育過程，其在小鼠耳蝸上皮發(fā)育的增殖期有陽性表達(dá)。

3.3 脫細(xì)胞外基質(zhì)的構(gòu)建

由于聽覺耳蝸柯蒂氏器的復(fù)雜膜性結(jié)構(gòu)，利用組織工程技術(shù)基于聽覺組織再生的脫細(xì)胞基質(zhì)開發(fā)與研究一直進(jìn)展緩慢。多年來脫細(xì)胞基質(zhì)的研究主要集中在利用物理、化學(xué)和生物方法脫去活組織的細(xì)胞結(jié)構(gòu)從而得到脫細(xì)胞組織用去組織工程化的再生新組織的構(gòu)建。Santi等[30]取材新鮮耳蝸用去垢劑脫去細(xì)胞結(jié)構(gòu)，獲得脫細(xì)胞結(jié)構(gòu)的耳蝸組織，同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)層粘連蛋白和IV型膠原等細(xì)胞外基質(zhì)中重要的活性蛋白仍然保留在脫細(xì)胞耳蝸的血管網(wǎng)、基底膜和螺旋緣等部位。這種脫細(xì)胞結(jié)構(gòu)的耳蝸組織ECM的組成和結(jié)構(gòu)可以作為一種新型載體用于毛細(xì)胞和聽覺螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的再生研究。Mellott等[29]也證明來自人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞接種在去細(xì)胞化的耳蝸ECM中,發(fā)現(xiàn)脫細(xì)胞的耳蝸ECM可以促進(jìn)毛細(xì)胞標(biāo)志蛋白Myosin VIIa的表達(dá)，表明耳蝸ECM的成分和拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)可能參與了干細(xì)胞分化的誘導(dǎo)。雖然天然動物耳蝸組織脫細(xì)胞誘導(dǎo)人干細(xì)胞向聽覺細(xì)胞分化作用已初見端倪，但由于天然組織的免疫排斥反應(yīng)，及異種細(xì)胞接種易導(dǎo)致種屬交叉感染，等方面的副作用極大限制了耳蝸組織ECM的研究和應(yīng)用。Oshima等[10]將iPSCs分化成表達(dá)Pax2和Pax8的內(nèi)耳前體細(xì)胞，然后進(jìn)一步引導(dǎo)內(nèi)耳前體細(xì)胞在纖連蛋白、明膠和滅活的雞胚橢圓囊基質(zhì)細(xì)胞等不同基質(zhì)上進(jìn)行分化，發(fā)現(xiàn)只有在雞胚橢圓囊基質(zhì)細(xì)胞上分化的誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞，才能產(chǎn)生表達(dá)靜纖毛標(biāo)志蛋白Espin的細(xì)胞。但目前雞胚橢圓囊基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化為毛細(xì)胞的分子機(jī)制還不甚明了，分化產(chǎn)生的毛細(xì)胞不具有典型的毛細(xì)胞特性，沒有功能性。同時(shí)，單獨(dú)的細(xì)胞共培養(yǎng)，缺乏合適的空隙和良好的三維空間結(jié)構(gòu)及必要的可塑性。因此，采用一定的理化處理方法構(gòu)建仿生可降解的納米纖維支架來負(fù)載活性脫細(xì)胞基質(zhì)成分，是將來誘導(dǎo)毛細(xì)胞再生的重要研究方向。

4 組織工程化載藥體系的構(gòu)建及應(yīng)用

目前除了助聽器和電子耳蝸植入外，藥物治療一直是內(nèi)耳疾病的另一主要治療方法，但是內(nèi)耳與全身血液循環(huán)之間存在血-迷路屏障，所以藥物進(jìn)入內(nèi)耳的劑量就非常有限，因而需要內(nèi)耳局部直接給藥。內(nèi)耳局部給藥不僅可以減少藥物劑量和藥物對人體的不良反應(yīng)，還可以提高藥物在內(nèi)耳的作用效率。圓窗膜[32]由三層結(jié)構(gòu)組成，中層為結(jié)締組織，外層和內(nèi)層分別和中耳、內(nèi)耳的黏膜相連接，其本質(zhì)為一個(gè)半透膜可以允許小分子藥物的滲透。Parnes等[33]實(shí)驗(yàn)證明在向鼓室注射地塞米松后，可以在內(nèi)耳的鼓階、中階和前庭階內(nèi)檢測到該藥物，說明地塞米松經(jīng)圓窗膜滲透入鼓階后，能在較短的時(shí)間內(nèi)分布到中階和前庭階。而且通過圓窗膜滲透給藥法相較于內(nèi)耳開窗法更易于實(shí)現(xiàn)，所以是目前內(nèi)耳局部給藥的主要途徑。隨著藥劑學(xué)的發(fā)展水凝膠和納米顆粒的載藥體系被廣泛應(yīng)用和研究。徐磊等[34]探索可生物降解的殼聚糖-磷酸甘油凝膠系統(tǒng)攜帶及釋放地塞米松進(jìn)入內(nèi)耳的特性,及其治療內(nèi)耳疾病的可行性。盡管凝膠本身可以在中耳存留較長的時(shí)間，但是藥物分子可能從凝膠的空隙之間流失，所以利用凝膠的藥物緩釋方法對內(nèi)耳的疾病治療有一定的局限性。而納米顆粒載藥系統(tǒng)[35]可以表現(xiàn)出更高的藥物運(yùn)載能力和特殊的藥物積累效應(yīng)，與凝膠緩釋藥物相比，基于納米顆粒載藥系統(tǒng)在藥物溶解性、藥物循環(huán)次數(shù)和療效上顯示出明顯優(yōu)勢。脂質(zhì)納米膠囊（lipid nanocapsules LNCS）[36]也同樣被應(yīng)用于內(nèi)耳藥物遞送的研究中。研究人員利用此類納米顆粒包裹咯利普蘭作用于體外培養(yǎng)的螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和樹突細(xì)胞，同時(shí)，在動物實(shí)驗(yàn)中將載藥膠囊傳遞入耳聾豚鼠模型中，觀察納米載體對藥物的緩釋及對機(jī)體的作用。研究證實(shí)，脂質(zhì)納米膠囊也可以作為一種新型的內(nèi)耳疾病載藥體[37]。

5 討論

哺乳動物內(nèi)耳是一類結(jié)構(gòu)和功能復(fù)雜的器官，包括耳蝸和前庭兩部分，耳蝸對聽覺產(chǎn)生起到關(guān)鍵作用。耳蝸內(nèi)的毛細(xì)胞和相連的螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞是緊密相連又各自分工明確的功能型細(xì)胞。聽力損傷修復(fù)的關(guān)鍵在于重新誘導(dǎo)毛細(xì)胞的再生，以及毛細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞建立突觸聯(lián)系。而目前藥物治療、細(xì)胞替代療法和基因治療等都存在一定的局限性和可行性欠佳。目前，雖然組織工程技術(shù)發(fā)展如火如荼，然而其在聽覺損傷修復(fù)與再生的研究和應(yīng)用才剛剛起步。耳蝸毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的再生及聽覺重建是一項(xiàng)復(fù)雜而系統(tǒng)的工程。隨著組織工程技術(shù)的不斷發(fā)展和研究的不斷深入，通過組織工程技術(shù)方法構(gòu)建仿生柯蒂氏器來模擬內(nèi)耳微環(huán)境和干細(xì)胞發(fā)育微環(huán)境，并結(jié)合脫細(xì)胞活性ECM關(guān)鍵信號因子的調(diào)控作用，進(jìn)而模擬體內(nèi)真實(shí)環(huán)境誘導(dǎo)干細(xì)胞向毛細(xì)胞和聽神經(jīng)細(xì)胞分化，為聽力損傷修復(fù)提供了一個(gè)新的研究思路。如果成功在體外構(gòu)建出內(nèi)耳的組織結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步研究探討是否可以安全有效的移植入機(jī)體，并發(fā)揮生物學(xué)功能這將是聽力疾病研究的一大突破。