一株乳酸菌的分離鑒定及在蘋果汁發(fā)酵中的應(yīng)用

潘勇 李建宋 趙思潔 廖祥儒 郝之奎

摘要：從蘋果樹根際土壤中篩選獲得一株產(chǎn)酸菌株，經(jīng)形態(tài)學(xué)和生理生化特征結(jié)合分子生物學(xué)研究，鑒定為植物乳桿菌，命名為L(zhǎng)actobacillusplantrumasZ;以蘋果為原料，將乳酸菌LactobacillusplantrumasZ應(yīng)用于蘋果汁發(fā)酵，通過單因素和正交試驗(yàn)，初步確定發(fā)酵蘋果汁的最佳工藝條件為在蘋果汁含量為35%、接種量為5%、蜂蜜添加量為2%、30℃發(fā)酵5d的條件下，蘋果汁的感官評(píng)分達(dá)到91分，發(fā)酵蘋果汁中總氨基酸和乳酸含量明顯增加，總SOD活性和總黃酮含量分別增加80.0%和16.9%，維生素C含量保持在80%以上。

關(guān)鍵詞：乳酸菌;鑒定;蘋果汁;發(fā)酵

中圖分類號(hào)：S182文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）22-0202-05

作者簡(jiǎn)介：潘勇（1992─），男，浙江麗水人，技術(shù)員，從事生物技術(shù)研究。E-mail：594696010@qq.com。

通信作者：郝之奎，博士，副教授，研究方向?yàn)槲⑸锛吧镔|(zhì)資源開發(fā)與利用。E-mail：haozhikui123@126.com。

蘋果是日常生活中的第一大水果，因味美且富含微量元素、維生素、果膠、類黃酮及蘋果多酚等營(yíng)養(yǎng)或活性物質(zhì)而深受大眾喜愛[1]。我國(guó)是世界最大蘋果種植國(guó)和產(chǎn)量國(guó)，年產(chǎn)蘋果4388余萬(wàn)t[2]，與其他果品產(chǎn)業(yè)一樣，以鮮銷為主，深加工類品種單一，加工量占總產(chǎn)量比率低，產(chǎn)業(yè)水平和效益不高[3]。利用我國(guó)豐富的蘋果資源開展深加工研究，是提高蘋果產(chǎn)業(yè)效益和水平、增加蘋果附加值、豐富市場(chǎng)、滿足人民群眾需要的重要途徑。

乳酸菌是與人類可共存的一類有益微生物，大多存在于人體消化道內(nèi)，對(duì)維持人體微生態(tài)平衡、提高人體免疫力起著重要作用[4]。隨著對(duì)乳酸菌的研究深入，其價(jià)值得到充分挖掘。日常生活所用的食材如豆制品、肉制品、果蔬等都可用于乳酸發(fā)酵基質(zhì)，乳酸發(fā)酵對(duì)改良食品風(fēng)味、提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值有著重要作用，在食品發(fā)酵工業(yè)領(lǐng)域，乳酸已得到廣泛應(yīng)用[5]。

本研究從蘋果樹根際土壤采集土樣，利用加入溴甲酚紫指示劑的MRS培養(yǎng)基篩選產(chǎn)酸菌株，經(jīng)形態(tài)和生理生化特征研究及分子生物學(xué)鑒定，將篩選的乳酸菌應(yīng)用于蘋果汁發(fā)酵，通過工藝優(yōu)化研究蘋果汁口感和營(yíng)養(yǎng)成分變化，初步探索乳酸菌在制造蘋果汁發(fā)酵飲料中的應(yīng)用。

1材料與方法

1.1材料與儀器

試驗(yàn)于2017年11月至2018年4月在江南大學(xué)生物工程學(xué)院廖祥儒教授實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。試驗(yàn)用蘋果根際土壤取自煙臺(tái)某蘋果園;樣本蘋果為市售鮮果;常用食品級(jí)麥芽糖、檸檬酸氫二銨等培養(yǎng)基添加試劑;T-SOD試劑盒和細(xì)菌基因組提取試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所。

所用設(shè)備為普通實(shí)驗(yàn)室常用設(shè)備，分別為高效液相色譜儀[Agilent1260（安捷倫）]、高速離心噴霧干燥機(jī)（GEANiro）。

1.2培養(yǎng)基

試驗(yàn)培養(yǎng)基主要是乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基（MRS培養(yǎng)基）、1.6%溴甲酚紫乙醇溶液、多價(jià)蛋白胨-酵母膏培養(yǎng)基（PY培養(yǎng)基）。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1菌株篩選

在MRS液體培養(yǎng)基中添加乳酸并調(diào)節(jié)pH值為5.5，加入適量土壤樣本，30℃恒溫?fù)u床中低速培養(yǎng)14～18h，用滅菌水稀釋104倍、105倍、106倍，分別取100μL均勻稀釋液涂布于含有0.15%溴甲酚紫的MRS固體培養(yǎng)基平板上，倒置并在30℃條件下培養(yǎng)至形成菌落，挑選變黃菌落劃線純化至獲得純培養(yǎng)。

1.3.2菌株鑒定

1.3.2.1[JP3]菌株形態(tài)學(xué)觀察觀察研究30℃培養(yǎng)條件下形成的菌落特征和顯微形態(tài)學(xué)特征（革蘭氏染色）。

1.3.2.2菌株生理生化特征依據(jù)文獻(xiàn)[6-8]的方法研究所獲純培養(yǎng)的糖利用、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、耐鹽、耐乙醇及七葉苷水解等生理生化特性。

1.3.2.3菌株16SrRNA基因序列分析利用細(xì)菌通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′）擴(kuò)增純培養(yǎng)基因組，3%瓊脂糖電泳檢測(cè)并回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物后測(cè)序（華大基因科技股份有限公司）。利用數(shù)據(jù)庫(kù)http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov，BLAST程序分析同源性并初步鑒定。

1.3.3菌株生長(zhǎng)特性研究

1.3.3.1最適生長(zhǎng)溫度的測(cè)定利用MRS培養(yǎng)基，5%接種量，設(shè)20、25、30、35、40℃等5個(gè)溫度梯度，60r/min搖床培養(yǎng)24h，采樣后測(cè)生物量（在600nm處測(cè)定吸光度D600nm），3個(gè)平行試驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

1.3.3.2最適生長(zhǎng)pH值的測(cè)定

利用MRS培養(yǎng)基，5%接種量，設(shè)4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8等9個(gè)pH值梯度，60r/min搖床培養(yǎng)24h，采樣后測(cè)生物量（在600nm處測(cè)定D600nm），3個(gè)平行試驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

1.3.3.3生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酸能力的測(cè)定

利用MRS培養(yǎng)基，設(shè)5%接種量，60r/min搖床30℃培養(yǎng)，間隔2h采樣測(cè)定D600nm，研究所獲得純培養(yǎng)的生長(zhǎng)和產(chǎn)酸特性[9]。

1.3.4菌株在蘋果汁發(fā)酵飲料中的初步應(yīng)用

1.3.4.1發(fā)酵劑的制備把活化好的菌株按5%的接種量接種到MRS∶蘋果汁分別為4∶1、3∶2、2∶3、1∶4等4種比例的發(fā)酵培養(yǎng)基，60r/min搖床30℃培養(yǎng)24h，分別轉(zhuǎn)接至含1%蜂蜜的蘋果汁中30℃發(fā)酵，24h后得蘋果汁發(fā)酵劑。

1.3.4.2乳酸菌發(fā)酵蘋果汁飲料工藝流程

乳酸菌發(fā)酵蘋果汁飲料工藝流程為新鮮蘋果→清洗、去皮、去核→榨汁→護(hù)色（0.2%檸檬酸水）→滅菌（75℃，5min）→冷卻→加純凈水（蘋果汁含量30%）→加2%的蜂蜜→接入發(fā)酵劑（接種量5%）→靜止發(fā)酵（30℃，5d，起始pH值=7.0）→過濾→成品。

1.3.4.3蘋果汁發(fā)酵條件的優(yōu)化（1）單因素試驗(yàn)：依據(jù)“1.3.3.1”節(jié)試驗(yàn)結(jié)果確定溫度，依據(jù)“1.3.4.2”節(jié)工藝，其他條件不變，接種量分別為1%、3%、5%、7%、9%、11%，以感官評(píng)分為指標(biāo)對(duì)個(gè)樣本進(jìn)行評(píng)價(jià)。依據(jù)“1.3.3.1”節(jié)試驗(yàn)結(jié)果確定溫度，依據(jù)“1.3.4.2”節(jié)工藝，其他條件不變，蘋果汁含量分別為20%、30%、40%、50%、60%、70%，以感官評(píng)分為指標(biāo)對(duì)個(gè)樣本進(jìn)行評(píng)價(jià)。依據(jù)“1.3.3.1”節(jié)試驗(yàn)結(jié)果確定溫度，依據(jù)“1.3.4.2”節(jié)工藝，其他條件不變，蜂蜜添加量分別為2%、4%、6%、8%、10%、12%，以感官評(píng)分為指標(biāo)對(duì)個(gè)樣本進(jìn)行評(píng)價(jià)。

（2）正交試驗(yàn)：以接種量、蜂蜜添加量和蘋果汁含量為三因素，感官評(píng)分為指標(biāo)，設(shè)計(jì)L9（33）正交試驗(yàn)（表1），研究最佳發(fā)酵工藝條件。

1.3.4.4感官評(píng)定參考國(guó)標(biāo)感官評(píng)定相關(guān)方法，隨機(jī)組織20位有感官評(píng)價(jià)經(jīng)驗(yàn)的人員從色、氣、味等設(shè)計(jì)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)（表2），取平均值作為結(jié)果。

1.3.4.5蘋果汁發(fā)酵前后主要成分的變化（1）氨基酸和有機(jī)酸含量測(cè)定：在最優(yōu)發(fā)酵工藝條件下發(fā)酵蘋果汁，發(fā)酵前后氨基酸含量和有機(jī)酸（蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸）含量用高效液相色譜法測(cè)定[10]。

（2）總SOD活性、總黃酮含量和維生素C含量的測(cè)定：蘋果汁發(fā)酵前后采樣并制備10%的勻漿液，4000r/min離心10min，取上清液測(cè)總SOD活性;據(jù)GB/T12143—2008《飲料通用分析方法》附錄G的方法測(cè)定總黃酮含量;采用紫外分光光度法[11]測(cè)維生素C含量。樣品均重復(fù)3次取平均值。

2結(jié)果與分析

2.1菌株鑒定

2.1.1菌株形態(tài)特征

篩選獲得的純培養(yǎng)菌落大小懸殊，直徑為1～2mm，淡黃色，不透明，球形，邊緣整齊，中凸起，表面光滑，革蘭氏陽(yáng)性（圖1）。

2.1.2生理生化特性參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，初步鑒定所獲純培養(yǎng)為植物乳桿菌屬（表3）。

2.1.3分子生物學(xué)研究

利用PCR儀擴(kuò)增純培養(yǎng)基因組，由圖2可知，片段長(zhǎng)度為1500bp左右，拖尾不明顯。測(cè)序后通過BLAST，與Lactobacillusplantarum的同源性可達(dá)99%。結(jié)合生理生化研究結(jié)果，初步確定該純培養(yǎng)為植物乳桿菌，并命名為L(zhǎng)actobacillusplantrumasZ。

2.2LactobacillusplantrumasZ生長(zhǎng)特性

2.2.1asZ的最適生長(zhǎng)溫度及最適pH值最適溫度和最適pH值研究結(jié)果分別是30℃和6.5（圖3、圖4）。

2.2.2菌株生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酸能力的測(cè)定

由圖5可知，asZ的停滯期在0～4h，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期在4～12h，此階段D600nm值從0.1達(dá)到2.0，12h后進(jìn)入穩(wěn)定期。由圖6可知，asZ產(chǎn)酸能力強(qiáng)，發(fā)酵10h，pH值由6.5降至3.8，對(duì)數(shù)期產(chǎn)酸較為明顯。

2.3菌株LactobacillusplantrumasZ在蘋果汁發(fā)酵飲料中的應(yīng)用

2.3.1蘋果汁發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.3.1.1單因素試驗(yàn)（1）蘋果汁含量對(duì)發(fā)酵果汁感官的影響：將滅菌后的蘋果汁加純凈水分別配制成20%、30%、40%、50%、60%、70%含量的蘋果汁，再添加2%蜂蜜，起始pH值為7.0，接種量為5%，在30℃條件下發(fā)酵5d。由圖7可知，當(dāng)蘋果汁含量38%時(shí)，其感官評(píng)分最高，故蘋果汁含量以35%、40%、45%作為正交試驗(yàn)的3個(gè)水平。

（2）接種量對(duì)發(fā)酵蘋果汁感官的影響：適當(dāng)提高接種量可以縮短微生物生長(zhǎng)的延滯期，縮短發(fā)酵時(shí)間，由圖8可知，感官評(píng)分隨著接種量的增大呈現(xiàn)出先增高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)接種量理論值達(dá)到5.2%時(shí)，感官評(píng)分達(dá)到最高值87分，故以4%、5%、6%的接種量作為正交試驗(yàn)的3個(gè)水平。

（3）蜂蜜添加量對(duì)發(fā)酵蘋果汁感官的影響：蜂蜜添加過少或過多會(huì)影響發(fā)酵飲料的酸甜感，如圖9所示，感官分值似乎有2個(gè)峰值，結(jié)合產(chǎn)業(yè)化成本因素，選擇1%、2%和3%的蜂蜜添加量作為正交試驗(yàn)的3個(gè)水平。

2.3.1.2正交試驗(yàn)

由表4可知，接種量對(duì)感官影響最大，蘋果汁含量次之，蜂蜜添加量影響最小，最佳培養(yǎng)條件為A1B2C2，即蘋果汁含量為35%，接種量為5%，蜂蜜添加量為2%，此時(shí)感官評(píng)分達(dá)到91分。

2.3.2蘋果汁發(fā)酵前后主要成分的變化

2.3.2.1氨基酸含量的變化發(fā)酵對(duì)總氨基酸含量變化影響明顯，發(fā)酵后總氨基酸提高了762.7%，其中脯氨酸提高最為明顯，達(dá)5946.7%，精氨酸增加3427.9%。只有亮氨酸比發(fā)酵前降低7.2%（表5）。

2.3.2.2有機(jī)酸含量的變化

由圖10可知，檸檬酸含量變化不大，蘋果酸含量下降明顯，發(fā)酵后有微量的乙酸產(chǎn)生，乳酸含量明顯增加，從發(fā)酵前的0.32mg/100mL增長(zhǎng)到496.87mg/100mL，增長(zhǎng)了1551.7倍。

[FK（W10][TPPY10.tif][

2.3.2.3總SOD活性、總黃酮含量和維生素C含量的測(cè)定

由表6可知，發(fā)酵后總SOD活性和總黃酮含量分別增加80.0%和16.9%，維生素C的含量有所減少，但保留80%，可能原因是發(fā)酵形成了低pH值環(huán)境維生素C，損失的維生素C可能作為底物利用。

3結(jié)論

生物技術(shù)的發(fā)展極大地拓寬了乳酸菌的應(yīng)用領(lǐng)域，也為傳統(tǒng)水果的深加工提供了強(qiáng)大的技術(shù)支撐。乳酸菌在發(fā)酵過程中會(huì)產(chǎn)生多種酶，對(duì)所發(fā)酵的食材等底物起到降解、轉(zhuǎn)化作用，或通過乳酸本身的代謝產(chǎn)生多種新的物質(zhì)，所以，通過發(fā)酵賦予了傳統(tǒng)水果新的口感和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值或新的功能。本研究利用稀釋涂布法，篩選獲得并鑒定了LactobacillusplantrumasZ。利用該菌株發(fā)酵了蘋果汁初步探索了發(fā)酵工藝條件，對(duì)開發(fā)以蘋果為原料的營(yíng)養(yǎng)飲料做了有益嘗試。

從本研究結(jié)果來看，雖然蘋果汁的發(fā)酵產(chǎn)物營(yíng)養(yǎng)成分有很大改善，但在功能方面還需要突出，比如通過發(fā)酵，在提高免疫力方面的功能還需要突出，這可能需要從改良發(fā)酵配方角度如添加幾丁質(zhì)水解產(chǎn)物（N-乙?；咸烟堑龋┻M(jìn)一步深入研究。

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