曾亞敏
[摘要] 目的 探討核酸檢測、抗體檢測在艾滋病診斷中的臨床價值。 方法 回顧性分析2017年4月~2019年4月我市收集的100例艾滋病患者的完整臨床資料,100例患者均接受過抗體檢測、核酸檢測,對比分析核酸檢測、抗體檢測診斷早期、中晚期艾滋病感染者的診斷符合率及靈敏度。 結(jié)果 經(jīng)核酸、抗體檢測,核酸檢測早期艾滋病感染者的診斷符合率(93.33%)高于抗體檢測(75.00%);抗體檢測診斷中晚期艾滋病感染者的診斷符合率(97.50%)高于核酸檢測(75.00%);核酸檢測診斷早期艾滋病感染者的靈敏度(96.55%)高于抗體檢測(80.36%);抗體檢測診斷中晚期艾滋病感染者的靈敏度(88.64%)高于核酸檢測(71.43%)(P<0.05)。 結(jié)論 在艾滋病感染的早期診斷中,核酸檢測早期艾滋病感染者的準(zhǔn)確率、靈敏度均較高,而在艾滋病感染的中晚期診斷中,抗體檢測的準(zhǔn)確率、靈敏度則均較高。因此,核酸檢測與抗體檢測各有優(yōu)勢,臨床醫(yī)師應(yīng)依據(jù)實際情況選擇適宜的檢測方式,如有必要,可嘗試將二者結(jié)合應(yīng)用,進(jìn)一步提高臨床檢測艾滋病感染的診斷準(zhǔn)確性和靈敏度,幫助醫(yī)師盡早確診艾滋病,早期予以患者相應(yīng)的抗病毒治療。
[關(guān)鍵詞] 艾滋病;核酸檢測;抗體檢測;診斷;臨床價值
[中圖分類號] R446.6? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701(2020)34-0120-06
[Abstract] Objective To explore the clinical value of nucleic acid testing and antibody testing in the diagnosis of AIDS. Methods The complete clinical data of 100 AIDS patients collected in our city from April 2017 to April 2019 were retrospectively analyzed. All 100 patients received antibody testing and nucleic acid testing. The diagnostic coincidence rate and sensitivity of nucleic acid testing and antibody testing in the early and middle stages of patients with advanced HIV infection have been compared and analyzed. Results The diagnostic coincidence rate(93.33%) of early HIV-infected patients with nucleic acid testing was higher than that of antibody testing(75.00%). The diagnostic coincidence rate(97.50%) of the middle and advanced HIV-infected patients with antibody testing was higher than that of nucleic acid testing(75.00%). The sensitivity(96.55%) of nucleic acid testing in diagnosing early HIV infection was higher than that of antibody testing(80.36%). The sensitivity of antibody testing in diagnosing middle and advance HIV infectio (88.64%) was higher than that(71.43%) of nucleic acid testing(P<0.05). Conclusion In the early diagnosis of AIDS infection, the accuracy and sensitivity of nucleic acid detection in early HIV infection are high, while in the diagnosis of the middle and advanced AIDS infection, the accuracy and sensitivity of antibody detection are both high. Therefore, nucleic acid testing and antibody testing have their own advantages. Clinicians should choose appropriate testing methods based on actual conditions. If necessary, the two can be tried to combine further improve the diagnostic accuracy and sensitivity of clinical testing for HIV infection. If necessary, try to combine the two to further improve the diagnostic accuracy and sensitivity of clinical detection of HIV infection, help physicians diagnose AIDS as soon as possible, and give patients corresponding antiviral treatment early.
1.3.4 WB蛋白印跡法詳述方法? (1)分離蛋白質(zhì):將HIV裂解成不同片段,依據(jù)目的蛋白性質(zhì),利用電泳法對蛋白質(zhì)進(jìn)行分離,按分子量的大小順序排列病毒不同蛋白;分離后,借助小刀去除樣品墻的上邊緣,于膠板右上角切一小口幫助定位,放入轉(zhuǎn)移緩沖溶液待用。(2)電轉(zhuǎn)移:將一塊PVDF膜剪成合適大小,將其浸泡于甲醇(1 min),放入轉(zhuǎn)移緩沖溶液待用;制作膠膜夾心;連接電源,于4℃條件下維持恒壓100 V,1 h。(3)免疫檢測:①膜染色:斷開電源,取出轉(zhuǎn)移盒并分開各個部分,將PVDF膜放入容器中,以TBS緩沖溶液清洗;剪下5 mm寬的膜放入另一容器中,將其浸泡于染色液(1 min),在脫色液中脫色30 min,確認(rèn)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜。②膜的封閉、清洗:對于未染色的膜,倒出TBS緩沖溶液,加入3%封閉緩沖溶液,搖動時間在1 h以上;倒掉3%封閉緩沖溶液,以TBS緩沖溶液清洗3次,5 min/次。③一抗:倒出TBS緩沖溶液,加入0.5%封閉緩沖溶液10 mL、適量一抗,搖動時間在1 h以上;倒出封閉緩沖溶液及一抗,以TBS緩沖溶液清洗2次,10 min/次。④二抗:倒出TBS緩沖溶液,加入0.5%封閉緩沖溶液5 mL、適量二抗,搖動時間為0.5 h;倒出封閉緩沖溶液及二抗,以TBS緩沖溶液清洗2次,10 min/次。⑤檢測:倒出TBS緩沖溶液,加入顯影劑,搖動PVDF膜,當(dāng)能清晰看到顯色帶,30 min內(nèi)以蒸餾水清洗PVDF膜3次;進(jìn)行特異性抗體孵育后與酶標(biāo)二抗共同顯色,根據(jù)其出現(xiàn)兩條以上的條帶判定HIV陽性。
1.4 觀察指標(biāo)與判定標(biāo)準(zhǔn)
以WB蛋白印跡法確證HIV-1抗體陽性作為臨床檢查艾滋病感染的診斷金標(biāo)準(zhǔn),分別統(tǒng)計分析核酸檢測、抗體檢測的結(jié)果,計算兩種檢查方式診斷早期、中晚期艾滋病感染者的診斷符合率及靈敏度。診斷符合率、靈敏度判定標(biāo)準(zhǔn):①診斷符合率=確診例數(shù)(真陽性)/總檢測例數(shù)×100%;②靈敏度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%。
1.5 統(tǒng)計學(xué)方法
采用SPSS20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,計數(shù)資料(診斷符合率及靈敏度)以[n(%)]表示,采用χ2檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2 結(jié)果
2.1 WB蛋白印跡法確證結(jié)果
經(jīng)WB蛋白印跡法確證,本研究100例艾滋病患者中,早期艾滋病感染者60例,中晚期艾滋病感染者40例。經(jīng)核酸檢測診斷,早期艾滋病感染者58例(其中56例經(jīng)金標(biāo)準(zhǔn)確診),中晚期艾滋病感染者42例(其中30例經(jīng)金標(biāo)準(zhǔn)確診);經(jīng)抗體檢測診斷,早期艾滋病感染者56例(其中45例經(jīng)金標(biāo)準(zhǔn)確診),中晚期艾滋病感染者44例(其中39例經(jīng)金標(biāo)準(zhǔn)確診)。
2.2 兩種檢測方式診斷早期艾滋病感染者的結(jié)果比較
以WB蛋白印跡法確證結(jié)果為診斷金標(biāo)準(zhǔn),核酸檢測診斷早期艾滋病感染者的診斷符合率高于抗體檢測,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。
2.3 兩種檢測方式診斷中晚期艾滋病感染者的結(jié)果比較
以WB蛋白印跡法確證結(jié)果為診斷金標(biāo)準(zhǔn),抗體檢測診斷中晚期艾滋病感染者的診斷符合率高于核酸檢測,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。
2.4 兩種檢測方式診斷早、中晚期艾滋病感染者的靈敏度比較
以WB蛋白印跡法確證結(jié)果為診斷金標(biāo)準(zhǔn),核酸檢測診斷早期艾滋病感染者的靈敏度高于抗體檢測;抗體檢測診斷中晚期艾滋病感染者的靈敏度高于核酸檢測,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。
3 討論
艾滋病是一種性傳播疾病,具有死亡率高、傳播性強(qiáng)等特點,目前臨床無任何有效的疫苗或治療方法能治愈艾滋病。據(jù)相關(guān)報道,2016年3月國內(nèi)報告顯示,法定傳染病575 400例,其中,死亡1544例,而艾滋病的死亡率高達(dá)80.1%(1236例),死亡率極高[10]。針對現(xiàn)狀,有學(xué)者研究認(rèn)為[11-12],由于目前醫(yī)學(xué)技術(shù)的局限性,臨床要想減少艾滋病患者的死亡率,所能依靠的辦法只有提高艾滋病確診率,可見臨床早發(fā)現(xiàn)、早診斷對于預(yù)防HIV感染、控制艾滋病傳播及提高艾滋病患者生存率具有重要意義。因此,臨床需對艾滋病的診斷工作予以重視。
在臨床檢測中,一般的HIV感染檢測指抗體檢測,而當(dāng)艾滋病病毒感染過程中,病毒RNA首先出現(xiàn),這時采用核酸檢測會取得更準(zhǔn)確的診斷結(jié)果。根據(jù)《全國艾滋病檢測技術(shù)規(guī)范》(2015年修訂版)[13]中的相關(guān)要求,所有篩查實驗呈陽性反應(yīng)的標(biāo)本不可出具陽性報告,需經(jīng)艾滋病確證實驗室確證陽性后方可出具HIV抗體-1型陽性(或HIV抗體-2型陽性)確證報告。HIV是人類逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種,所謂逆轉(zhuǎn)錄病毒,即病毒侵襲宿主細(xì)胞后,將自己的單鏈RNA作為模板,遵照堿基互補(bǔ)配對原則,基于逆轉(zhuǎn)錄酶作用合成cDNA,而新合成的cDNA會插入宿主的核DNA中,伴隨宿主DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯,最終達(dá)到擴(kuò)增目的病毒的目的,加快艾滋病感染的病程進(jìn)展。其中,HIV-1占世界艾滋病感染的比重極大,HIV廣泛存在于感染者陰道分泌物、血液、腦脊液、精液及乳汁中,以精液、血液、陰道分泌物中的濃度最高。HIV對人體免疫系統(tǒng)具有較高的攻擊能力,能夠引起人類免疫系統(tǒng)缺陷,其主要攻擊目標(biāo)為CD4 T淋巴細(xì)胞。CD4 T淋巴細(xì)胞受到攻擊后,其細(xì)胞數(shù)量及功能均會受到較大影響,進(jìn)而造成機(jī)體免疫功能嚴(yán)重?fù)p害,最終導(dǎo)致一系列免疫缺陷綜合征,直接危及生命健康。
診斷符合率實際上是一種相對性概念,當(dāng)患者體內(nèi)已經(jīng)存在病毒RNA,那么核酸檢測定可準(zhǔn)確檢出感染情況,且準(zhǔn)確率、靈敏度均較高;而隨著抗原的產(chǎn)生,抗原檢測方法可檢出患者是否有感染情況,當(dāng)患者出現(xiàn)抗體,則采用抗體進(jìn)行檢測會取得更高的檢測率及靈敏度。因此,在不同檢測時間采取不同的檢測方式所得的診斷符合率及靈敏度均各不相同。本研究采用核酸檢測、抗體檢測對艾滋病患者進(jìn)行診斷后,取得了如下結(jié)果:經(jīng)檢測,核酸檢測早期艾滋病感染者的診斷符合率(93.33%)明顯高于抗體檢測(75.00%);抗體檢測診斷中晚期艾滋病感染者的診斷符合率(97.50%)高于核酸檢測(75.00%);核酸檢測診斷早期艾滋病感染者的靈敏度(96.55%)顯著高于抗體檢測(80.36%);而抗體檢測診斷中晚期艾滋病感染者的靈敏度(88.64%)高于核酸檢測(71.43%)(P<0.05)。上述多項結(jié)果顯示,在早期艾滋病感染診斷中,核酸檢測的診斷準(zhǔn)確性及靈敏度明顯高于抗體檢測,說明該檢測方式對早期艾滋病感染的診斷具有確切效果;而對于中晚期艾滋病感染的診斷,相較于核酸檢測,抗體檢測的診斷準(zhǔn)確性及靈敏度顯然更高,說明抗體檢測對中晚期艾滋病感染的診斷具有明確效果。孫強(qiáng)[14]研究認(rèn)為,在HIV感染早期,核酸檢測的準(zhǔn)確性高于抗體檢測;而在HIV感染的中晚期,抗體檢測的準(zhǔn)確性則高于核酸檢測,臨床工作者需結(jié)合患者病情的不同階段為其選擇更為合適的檢測手段。該學(xué)者經(jīng)研究取得的實驗結(jié)果為其觀點提供了良好的數(shù)據(jù)支持:經(jīng)核酸、抗體檢測,核酸檢測35例早期HIV感染者的準(zhǔn)確率(94.29%)明顯高于抗體檢測準(zhǔn)確率(71.43%);經(jīng)核酸、抗體檢測,抗體檢測31例中晚期HIV感染者的準(zhǔn)確率(93.55%)則高于核酸檢測(74.20%)。由上可知,本研究結(jié)果同該學(xué)者研究結(jié)果相似,具有一定可信度。
核酸檢測通常分為定性、定量兩類,前者主要用于輔助診斷HIV感染,后者則多用于監(jiān)測HIV感染者的病程進(jìn)展及其抗病毒治療效果。其中,定性檢測往往采用實時熒光定量PCR技術(shù),此種技術(shù)具有靈敏度較高、操作快捷簡便等優(yōu)點,基于此,核酸檢測可測定機(jī)體外周血的病毒含量,進(jìn)而準(zhǔn)確、有效地診斷HIV感染,被臨床認(rèn)為是HIV早期診斷的有力手段之一[15-16]。艾滋病核酸檢測包含HIV-1 RNA檢測及HIV-1 DNA檢測,直擊艾滋病病毒的RNA或DNA結(jié)構(gòu),檢測患者血液中是否存在病毒核酸,進(jìn)而診斷其有無病原體感染。在艾滋病患者中,HIV侵入人體且進(jìn)行大量復(fù)制后,會產(chǎn)生較多RNA片段,核酸檢測借助可病毒載量檢測法對早期艾滋病感染進(jìn)行輔助診斷,而隨著人體機(jī)能的增強(qiáng),病毒載量會顯著性降低,同時轉(zhuǎn)而出現(xiàn)抗原、抗體,提高靈敏度。就是核酸檢測早期艾滋病感染診斷準(zhǔn)確性及靈敏度高于抗體檢測,而抗體檢測診斷符合率、靈敏度較低的原因,本研究考慮與以下幾點相關(guān):①艾滋病患者急性感染HIV初期、快速而廣泛的免疫細(xì)胞破壞及HIV感染后出現(xiàn)病毒血癥(不受控制)的持續(xù)時間為4周左右,在此期間,HIV病毒傳染性極強(qiáng),多數(shù)HIV感染患者體內(nèi)均呈過性的高病毒血癥狀態(tài),無特異性臨床癥狀,加之抗體未出現(xiàn),導(dǎo)致抗體檢測難以檢測患者感染情況,檢測靈敏度及診斷符合率均不高[17-18]。②艾滋病主要病原體為HIV,在臨床中,患者檢測HIV由陰性轉(zhuǎn)為陽性即可確診為艾滋病,HIV感染過程中,病毒RNA及病毒抗原往往先于抗體出現(xiàn)(1~2周),而核酸檢測方式對病毒RNA的靈敏度較抗體檢測更高,有利于早期確定患者是否存在HIV感染,進(jìn)而提高其對艾滋病的診斷符合率和靈敏度。③臨床所存在的某些特殊情況實際上也容易導(dǎo)致抗體檢測艾滋病結(jié)果不穩(wěn)定。一般而言,抗體檢測主要通過檢測艾滋病感染患者體內(nèi)抗體確診艾滋病,但對于艾滋病感染患者來說,當(dāng)疾病進(jìn)展至晚期時,部分患者因免疫功能嚴(yán)重受損,抗體滴度會下降至無法達(dá)到抗體檢測需求,加之病毒大量復(fù)制,進(jìn)而中和導(dǎo)致HIV抗體檢測結(jié)果產(chǎn)生不確定性,影響檢測靈敏度及診斷符合率。這時,臨床便需采用或結(jié)合其他檢測方式診斷艾滋病[19]。
抗體檢測包括HIV抗體篩查(初篩、復(fù)篩)、HIV抗體確證試驗,ELISA為抗體初篩檢測最常用且效果最好的一種檢測方法,目前研究顯示[20],隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展及進(jìn)步,ELISA的試劑已開發(fā)至第4代。第4代試劑并非術(shù)簡單疊加、融合抗原和抗體,而是將P24抗原、HIV抗體進(jìn)行有效結(jié)合,使二者集中于一個微孔內(nèi),進(jìn)行HIV反應(yīng),并于抗原檢測系統(tǒng)中加入生物素-鏈親和素放大系統(tǒng),由此提高ELISA檢測反應(yīng)靈敏度,提高抗體檢測診斷符合率及靈敏度。相較于第3代試劑,第4代試劑敏感性較高,且可縮短“HIV窗口期”,縮短周期為4~9 d,然而根據(jù)現(xiàn)有的醫(yī)療條件來看,第3代試劑更適用于目前的臨床檢測條件,且其檢測艾滋病的靈敏度本身也較高?!癏IV窗口期”即人體感染HIV后,通常需要2~12周(約42 d),血液中才能檢測到HIV抗體,在這段時期內(nèi),常規(guī)檢測技術(shù)根本無法檢測出患者是否攜帶HIV,因此,縮短HIV檢測窗口期對盡早確診艾滋病具有積極意義。相關(guān)文獻(xiàn)指出[21],當(dāng)血漿病毒載量>5000拷貝/mL時,核酸檢測可作為診斷HIV-1感染陽性樣本的診斷依據(jù),并認(rèn)為陽性樣本病毒載量高的原因與艾滋病感染者病情以及對治療藥物的耐藥性相關(guān),且患者感染HIV后,其病情進(jìn)展速度同血漿中的病毒載量呈正相關(guān)。但對于中晚期艾滋病感染患者而言,隨著其自身抵抗力的下降,體內(nèi)病毒不斷進(jìn)行復(fù)制,病毒載量又呈現(xiàn)出持續(xù)增加情況,可見,人體內(nèi)的病毒載量水平并非處于相對穩(wěn)定的狀態(tài),而是同機(jī)體免疫力呈正相關(guān),隨人體免疫力變化而變化,采用核酸檢測靈敏度不高[22-23]。除病毒含量伴隨艾滋病病程不斷變化的因素影響外,核酸檢測還存在一定不足,譬如,此種檢測方式容易受到病毒亞型的變異影響,且對血液樣本的采集、處理、保存及運輸均有較高要求,否則容易導(dǎo)致檢測結(jié)果不穩(wěn)定,故檢測成本相對于抗體檢測較高,在臨床中的使用具有相應(yīng)的局限性。因此,病毒載量檢測法對中晚期艾滋病感染者的檢測結(jié)果便會出現(xiàn)不確定性,診斷靈敏度會較早期檢測下降,所能起到的作用是輔助診斷中晚期艾滋病感染者的疾病進(jìn)程,同時指導(dǎo)其用藥,即中后期核酸檢測難以準(zhǔn)確、有效診斷艾滋病感染,而抗體檢測呈現(xiàn)與之相反的原因。與此同時,當(dāng)中晚期艾滋病患者產(chǎn)生了足夠被檢出的抗體后,抗體便會一直出現(xiàn),這十分利于抗體檢測完成對HIV感染的診斷,提高靈敏度,進(jìn)而確證中晚期艾滋病患者感染,為臨床醫(yī)師制定治療方案提供數(shù)據(jù)支持。
綜上所述,核酸檢測、抗體檢測用于艾滋病患者診斷中均具有較高的診斷價值,其中,核酸檢測能夠有效提高早期艾滋病患者的診斷符合率及靈敏度,而抗體檢測能夠?qū)⒅型砥诎滩』颊叩脑\斷符合率、靈敏度顯著提高,為臨床提供可靠的數(shù)據(jù)資料。而鑒于核酸檢測、抗體檢測的不同優(yōu)勢,臨床可針對艾滋病感染的不同進(jìn)程,為患者選擇相適應(yīng)的檢測方式,以便醫(yī)師取得更為可靠的數(shù)據(jù)資料,準(zhǔn)確評估艾滋病患者的感染情況。同時,因核酸、抗體檢測艾滋病均存在相應(yīng)不足,本研究建議將兩種檢測方法相互配合進(jìn)行檢測,以相互彌補(bǔ)缺陷,擴(kuò)大優(yōu)勢,提高艾滋病診斷的準(zhǔn)確性以及靈敏度,減少臨床誤診、漏診情況的發(fā)生,最終幫助醫(yī)師評估艾滋病感染者病情。
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(收稿日期:2020-07-01)