刺激響應(yīng)變形納米載藥體系的構(gòu)建及性能研究

王梓姣， 郭方方， 劉 青， 時(shí)東陸

(同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海 200092)

腫瘤微環(huán)境響應(yīng)釋放的金納米顆粒載藥體系是由金納米顆粒與腫瘤微環(huán)境響應(yīng)單元通過組裝形成的納米載藥體系。它使載帶藥物被高效釋放在腫瘤組織中，有效地提高了抗腫瘤藥物的利用率，降低了抗腫瘤藥物對(duì)正常組織的損傷。但是納米顆粒在體內(nèi)的留存時(shí)間、腫瘤組織的留存效率以及腫瘤細(xì)胞的攝取效率對(duì)其顆粒尺寸的要求各異[1-3]，因此形貌可變的納米載體成為發(fā)展的潮流[4]。本研究利用pH響應(yīng)型可變形三鏈體脫氧核糖核酸(triplex DNA)、不同粒徑(直徑)金納米顆粒以及抗腫瘤藥物多柔比星(doxorubicin hydrochloride, DOX)組裝出一種可響應(yīng)酸性腫瘤微環(huán)境，從而產(chǎn)生結(jié)構(gòu)形態(tài)改變，釋放出DOX的載藥聚集體(cluster-DOX)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

triplex DNA的序列為5′-GGAGGGGAGG-GGAGGTTTACCTCCCCTCCCCTCCCTTTGCCTC-CCCTCCCCTCCTCGACTTTTTTTTTTT-3′，DNA互補(bǔ)鏈(complement DNA)的序列為5′-AGTCGAG-GAGGGGAGGTTTTTTTTTT-3′，保護(hù)鏈(S-10T DNA)的序列為5′-TTTTTTTTTT-3′，上述DNA均定制于生工生物工程(上海)股份有限公司，人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(NCI-H1299)，購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，氯金酸(HAuCl4·4H2O)購(gòu)自上海思域化工科技有限公司，無水碳酸鉀以及二水合檸檬酸三鈉購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，鞣酸以及DOX購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司，胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Gibco公司，MEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)康寧公司，細(xì)胞活性(活死細(xì)胞染色)檢測(cè)試劑盒購(gòu)于江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。超微量分光光度計(jì)使用的是美國(guó)賽默飛世爾科技公司的NanoDrop2000。熒光酶標(biāo)儀使用的是瑞士帝肯公司的Infinite 200 PRO多功能酶標(biāo)儀。倒置熒光顯微鏡使用的是日本Nikon公司的ECLIPSETi。

1.2 聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)檢測(cè)triplex DNA結(jié)構(gòu)形成

triplex DNA與complement DNA按1∶2的濃度比進(jìn)行混合，37℃靜置1h，自然恢復(fù)至室溫，兩條單鏈DNA雜交成為雙鏈結(jié)構(gòu)。將雜交完成的雙鏈DNA分為兩組，一組為不改變pH的中性條件組，一組為加入鹽酸[5]至pH=4.5[6]的酸性條件組，使用12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證。中性條件組使用pH=7的1X TBE緩沖液，酸性條件組則使用pH=4.5的1X TBE緩沖液。

1.3 雙鏈DNA對(duì)DOX的最大載帶量

將濃度為20、50、100、200、500、1000nmol/L的雜交完成的DNA雙鏈溶液分別與濃度為 500nmol/L的DOX溶液混合并過夜，用熒光酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 雙鏈DNA在不同pH下的釋藥

令載帶有DOX的高濃度雜交雙鏈(triplex-DOX)稀釋在不同pH的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline, PBS)中，使其終濃度為0.8μmol/L，37℃下靜置過夜。

1.5 酸性腫瘤微環(huán)境響應(yīng)的可變形聚集體結(jié)構(gòu)的制備

1.5.1 直徑5nm金顆粒制備 采用鞣酸法[7]制備5nm金顆粒，并通過前期實(shí)驗(yàn)對(duì)條件進(jìn)行了優(yōu)化。配制50mL的二水合檸檬酸三鈉溶液，使其終濃度達(dá)到2.2μmol/L，向其中加入33μL且濃度為 2.5mmol/L的鞣酸溶液，隨后加入335μL濃度為150mmol/L 的碳酸鉀溶液，最后向上述混合溶液中加入1%的氯金酸溶液335μL。室溫下(25℃)攪拌過夜反應(yīng)，溶液顏色由灰黑色逐漸變?yōu)槌燃t色。5nm 金顆粒溶液制備好后，使用超濾管將溶液濃縮，并利用超微量分光光度計(jì)定量溶液濃度，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 直徑13nm金顆粒的制備 采用檸檬酸三鈉還原法[8]制備13nm金顆粒，將1mL濃度為1%的氯金酸溶液以及99mL的Milli-Q水混合，攪拌加熱至溶液沸騰。隨后加入3.5mL濃度為65mmol/L的二水合檸檬酸三鈉溶液，繼續(xù)加熱攪拌30min，溶液變?yōu)榫萍t色。將產(chǎn)物離心濃縮(離心半徑25cm，10000r/min，3min)，通過超微量分光光度計(jì)定量溶液濃度，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.3 酸性腫瘤微環(huán)境響應(yīng)的可變形聚集體的組裝 制作100μL體系的載藥聚集體結(jié)構(gòu)，使13、5nm 金顆粒、triplex DNA、complement DNA、DNA互補(bǔ)鏈的最終濃度分別為3、30、800、1600、400nmol/L。將triplex DNA與complement DNA混合，37℃ 靜置1h，自然恢復(fù)至室溫，兩條單鏈DNA雜交成為雙鏈結(jié)構(gòu)。隨后將雙鏈DNA、S-10T DNA、5nm 金顆粒、13nm金顆粒、適量MIlli-Q水同時(shí)混合并于-80℃冷凍1h，水溶液冷凍成冰，樣品顏色變?yōu)樗{(lán)紫色。樣品于室溫(25℃)下自然融化后溶液恢復(fù)為紫紅色。離心產(chǎn)物(離心半徑25cm，10000r/min，20min)通過10mmol/L的磷酸緩沖液(phosphate buffer solution, PBS)對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行兩次重懸，洗去未聚集成功的小顆粒，最后使產(chǎn)物分散在0.1mol/L PBS中。

1.5.4 酸性腫瘤微環(huán)境響應(yīng)的可變形聚集體的載藥與釋藥 按上述濃度在雜交完成的雙鏈DNA溶液中加入DOX，使其終濃度為4μmol/L，避光室溫(25℃)過夜，再按上述方式組裝出cluster-DOX。重懸完成后，將聚集體濃縮液分散于不同pH的0.1mol/L 的PBS中，37℃過夜。

1.6 酸性腫瘤微環(huán)境響應(yīng)的可變形聚集體結(jié)構(gòu)在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的表現(xiàn)

1.6.1 酸性腫瘤微環(huán)境響應(yīng)的可變形聚集體在腫瘤細(xì)胞中的釋藥 將制備好的cluster-DOX與DOX溶液分別稀釋在培養(yǎng)基中，pH=4.5時(shí)，培養(yǎng)基中游離DOX的濃度均為0.35μmol/L。將配好的培養(yǎng)基加入鋪有NCI-H1299細(xì)胞的96孔板中，培養(yǎng)12、24h后在熒光顯微鏡下拍照。

1.6.1 活死染色檢測(cè)不同顆粒對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性通過冷凍法在5、13nm顆粒表面修飾S-10T DNA后加入培養(yǎng)基中，二者終濃度分別為30、3nmol/L。同時(shí)將制備好的cluster-DOX、DOX溶液以及同濃度的cluster顆粒分別稀釋在培養(yǎng)基中，當(dāng)pH=4.5時(shí)，培養(yǎng)基中游離DOX的濃度均為0.35μmol/L。將配好的培養(yǎng)基加入鋪有NCI-H1299細(xì)胞的96孔板中，培養(yǎng)3d后使用活死細(xì)胞試劑盒進(jìn)行染色，共孵育30min 后在熒光顯微鏡下拍照。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用Graph Pad Prism 7進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并作圖，中性條件組和酸性條件組的比較采用單因素方差分析。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 triplex結(jié)構(gòu)對(duì)pH改變的響應(yīng)

聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在中性條件下，雜交產(chǎn)物條帶(圖1AⅣ藍(lán)色箭頭所示位置)運(yùn)動(dòng)速率明顯變慢，見圖1A，說明此時(shí)大部分triplex DNA與其對(duì)應(yīng)complement DNA形成質(zhì)量更大的雜交雙鏈產(chǎn)物，小部分保持了三鏈形態(tài)(圖1A黃色箭頭所示位置)。但在酸性條件下，雜交鏈溶液的條帶位置(圖1B Ⅳ)分別與單獨(dú)的triplex DNA(圖1B Ⅱ)、complement DNA(圖1B Ⅲ)位置相同，說明此時(shí)雜交雙鏈解鏈為兩條鏈。雜交雙鏈熔解曲線的測(cè)試結(jié)果(圖1C)與PAGE結(jié)果一致，圖中酸性條件下的熔解曲線(圖1C黑色虛線)僅在75℃出現(xiàn)拐點(diǎn)(黃色箭頭)，即此溫度令溶液中三鏈體結(jié)構(gòu)中的Hoogsteen鍵發(fā)生斷裂，C—G·C+三鏈體解鏈成C—G雙鏈體構(gòu)型[9]。而中性條件下，(圖1C紅色虛線)55℃ 處的新增拐點(diǎn)(藍(lán)色剪頭)接近雙鏈所計(jì)算的解鏈溫度，同樣證明了雙鏈雜交成功，但有部分保持三鏈形態(tài)。上述兩項(xiàng)實(shí)驗(yàn)證明了在酸性條件下，因三鏈體結(jié)構(gòu)的形成使雜交雙鏈發(fā)生解鏈。

圖1 triplex結(jié)構(gòu)對(duì)pH改變的響應(yīng)Fig.1 triplex structure response to pH changesA： pH=7時(shí)triplex DNA與其互補(bǔ)鏈的PAGE結(jié)果；B： pH=4.5時(shí)triplex DNA與其互補(bǔ)鏈的PAGE結(jié)果；C： 不同pH下triplex DNA與其互補(bǔ)鏈的溶解曲線，同種顏色的兩條曲線為溫度先升至95℃再降至25℃的溫度循環(huán)

2.2 載藥聚集體結(jié)構(gòu)的形成

使用不同的方法驗(yàn)證聚集體結(jié)構(gòu)的形成。圖2A為加入金溶液的核酸總量與聚集體形成并離心后上清液中游離的核酸量，由此可知，約有2.5μmol/L 的DNA被成功修飾在金顆粒表面。同時(shí)，瓊脂糖凝膠電泳(圖2B)顯示，Ⅲ泳道的條帶明顯滯后于Ⅰ泳道的 5nm金條帶與Ⅱ泳道的13nm金條帶，同樣表明DNA被成功修飾金顆粒表面，且形成聚集體。紫外可見光譜結(jié)果(圖2C)顯示，聚集體吸收峰位于 528nm，對(duì)比單顆粒發(fā)生明顯紅移，與透射電子顯微鏡(transmission electron microscope, TEM)圖(圖3C)與動(dòng)態(tài)光散射(dynamic light scattering, DLS)粒徑(圖3G)結(jié)果一致，均顯示在中性雜交條件下聚集體形成。

隨后，本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了聚集體結(jié)構(gòu)的酸性響應(yīng)能力。TEM結(jié)果表明，本研究自制的5、13nm金顆粒(圖3A、3B)形貌尺寸均一，分散性良好，且聚集體組裝成功(圖3C)并可以在酸性條件下發(fā)生解體(圖3D)。詳細(xì)分析TEM圖后發(fā)現(xiàn)，聚集體尺寸多分布在50～80nm(圖3E黑色)。而在酸性條件下(圖3E花灰色)，尺寸集中在0～40nm。隨后，隨機(jī)統(tǒng)計(jì)了不同條件下，多張TEM圖片中1000 顆納米顆粒。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在中性條件下，超過98%的納米顆粒呈現(xiàn)聚集狀態(tài)(聚集顆粒數(shù)≥2)(圖3F左，pH= 7)，而在酸性條件下，僅有58.37%的顆粒保持聚集狀態(tài)，有41.63%的金納米顆粒變?yōu)榉稚⒌膯晤w粒狀態(tài)(圖3F右，pH=4.5)。同時(shí)，測(cè)量了不同pH下聚集體的DLS粒徑，如圖3G、圖3H所示，pH=7時(shí)，粒徑在50～80nm大小的聚集體顆粒數(shù)占總顆粒數(shù)的75%，而pH=4.5時(shí)，89.6%的顆粒尺寸分布于18～32nm，與TEM結(jié)果相吻合。由此表明，本研究構(gòu)建的納米聚集體，具有良好的pH誘導(dǎo)形變的能力，且形變效率高。

圖3 聚集體顆粒對(duì)pH變化的響應(yīng)Fig.3 Response of nanoclusters to pH changesA： 直徑5nm裸金的TEM圖像；B： 直徑13nm裸金的TEM圖像；C： pH=7時(shí)載藥聚集體的TEM圖像；D： pH=4.5時(shí)載藥聚集體的 TEM圖像；E： 不同pH下聚集體顆粒的尺寸分布；F： 不同pH下聚集體顆粒與單顆粒數(shù)量對(duì)比；G： pH=7時(shí)聚集體的DLS粒徑； H： pH=4.5時(shí)聚集體的DLS粒徑

2.3 酸性腫瘤微環(huán)境響應(yīng)的可變形聚集體結(jié)構(gòu)的載藥與釋藥

2.3.1 DOX的標(biāo)準(zhǔn)曲線與雜交雙鏈DNA對(duì)DOX的載帶量 DOX的標(biāo)準(zhǔn)熒光曲線如圖4A中所示，其擬合方程已列在表1中，由此可知不同濃度的游離DOX具有不同強(qiáng)度的紅色自發(fā)熒光，且?guī)缀醪皇躳H改變的影響。之前的研究表明，當(dāng)DOX插入DNA雙鏈后，固有熒光淬滅，當(dāng)其恢復(fù)游離狀態(tài)后，熒光恢復(fù)[10]。

當(dāng)雙鏈DNA的濃度為100nmol/L時(shí)，熒光強(qiáng)度的下降速度明顯降低，且接近最低值。說明此時(shí)絕大部分DOX被插入到雙鏈DNA中，僅有極少量處于游離狀態(tài)，且此時(shí)雙鏈DNA處于滿載狀態(tài)。為盡可能減少用藥量且略有過量來保證雙鏈DNA可以充分載帶，故本研究中，都將DOX與雙鏈DNA的濃度比例保持在5∶1，見圖4。

表1 DOX在不同pH下熒光標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合方程

2.3.2 不同pH下雜交雙鏈DNA對(duì)DOX的釋放能力 酸性條件雙鏈DNA對(duì)DOX的釋放情況結(jié)果如圖5所示，當(dāng)pH=4時(shí)，溶液的熒光值約為pH=7溶液熒光值的3.9倍，當(dāng)pH=5時(shí)，熒光值約為pH= 7時(shí)的2.6倍。由DOX的標(biāo)準(zhǔn)曲線估算出溶液中游離的DOX濃度分別為0.78μmol/L和0.6μmol/L，對(duì)比pH=7條件下溶液中僅有0.2μmol/L 游離狀態(tài)的DOX，表明插入雙鏈中的DOX被成功釋放出來。

圖5 triplex-DOX在不同pH下對(duì)DOX的釋放Fig.5 triplex-DOX release DOX at different pH與pH=7相比，***P<0.01

2.3.3 不同pH下酸性腫瘤微環(huán)境響應(yīng)的可變形聚集體結(jié)構(gòu)對(duì)DOX的釋放能力 隨后，驗(yàn)證本文所設(shè)計(jì)的pH響應(yīng)載藥體系(cluster-DOX)是否能夠達(dá)到可控釋藥的目的。結(jié)果如圖6所示，當(dāng)pH=4和4.5時(shí)的熒光值分別是pH=7時(shí)熒光值的10.1倍、4.9倍，此時(shí)溶液中對(duì)應(yīng)的游離狀態(tài)的DOX濃度約為0.6μmol/L及0.35μmol/L。cluster-DOX熒光值增加倍數(shù)相較于triplex-DOX更明顯是由于離心去除了過量的DOX。上述實(shí)驗(yàn)證明了本研究的載藥聚集體結(jié)構(gòu)可以成功響應(yīng)酸性環(huán)境，產(chǎn)生形變，釋放載代藥物。

圖6 cluster-DOX在不同pH下對(duì)DOX的釋放Fig.6 cluster-DOX release DOX at different pH與pH=7相比，***P<0.01

2.4 酸性腫瘤微環(huán)境響應(yīng)的可變形聚集體結(jié)構(gòu)的在腫瘤細(xì)胞中的表現(xiàn)

2.4.1 酸性腫瘤微環(huán)境響應(yīng)的可變形載藥聚集體在腫瘤細(xì)胞中的釋藥 選用具有DOX耐藥性的NCI-H1299細(xì)胞[11]來驗(yàn)證載藥聚集體對(duì)藥物的載帶能力，該細(xì)胞對(duì)DOX敏感性較差。由圖7可知，反應(yīng)12h后，cluster-DOX組NCI-H1299細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生變化，紅色熒光表示有大量DOX進(jìn)入細(xì)胞中。反應(yīng)24h后，cluster-DOX組的細(xì)胞形態(tài)產(chǎn)生更明顯的損傷，DOX完全進(jìn)入細(xì)胞當(dāng)中。相比之下，相同時(shí)間下僅加入DOX的對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)并未發(fā)生明顯變化，且細(xì)胞內(nèi)未觀察到紅色熒光，此結(jié)果可能與DOX濃度過低，刺激時(shí)間較短有關(guān)[12-13]。對(duì)圖片進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析后可發(fā)現(xiàn)，12h時(shí)有95%的細(xì)胞有了紅色熒光，24h所有細(xì)胞均有了紅色熒光。則說明了本次所設(shè)計(jì)的載藥聚集體可成功響應(yīng)酸性腫瘤微環(huán)境，釋放出所載帶的抗腫瘤藥物，且極大提高了抗腫瘤藥物進(jìn)入細(xì)胞的效率。

圖7 載藥聚集體在細(xì)胞內(nèi)的表現(xiàn)Fig.7 Performance of cluster-DOX in cellsA： 12h時(shí)cluster-DOX在NCI-H1299細(xì)胞中的入胞與釋藥；B： 12h時(shí)DOX在NCI-H1299細(xì)胞中的入胞與釋藥；24h時(shí)cluster-DOX在NCI-H1299細(xì)胞中的入胞與釋藥；D： 24h時(shí)DOX在NCI-H1299細(xì)胞中的入胞與釋藥

2.4.2 酸性腫瘤微環(huán)境響應(yīng)的可變形載藥聚集體對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性 如圖8所示，單獨(dú)的5、13nm金顆粒以及所組裝的聚集體對(duì)NCI-H1299細(xì)胞的毒性較小，證明了載體的安全性。且cluster-DOX組對(duì)細(xì)胞的毒性相較于僅加入DOX來說，有極為明顯的差距，cluster-DOX組僅有極少數(shù)細(xì)胞存活，而DOX組則正好相反。統(tǒng)計(jì)后可得，僅含DOX的試驗(yàn)組細(xì)胞存活率為94.8%，聚集體組細(xì)胞存活率為85.8%，cluster-DOX組細(xì)胞存活率僅為11.9%。以上結(jié)果均表明本研究構(gòu)建出一種高效、安全、效果良好的腫瘤微環(huán)境響應(yīng)的載藥聚集體。

圖8 載藥聚集體對(duì)細(xì)胞活性的影響Fig.8 Effect of cluster-DOX on cell viability

3 討 論

腫瘤微環(huán)境響應(yīng)釋放的金納米顆粒載藥體系在化學(xué)療法、光熱療法、射頻療法等多種治療中應(yīng)用廣泛[13-20]。目前對(duì)腫瘤微環(huán)境響應(yīng)釋放的金納米顆粒載體的研究，多是利用響應(yīng)單元改變納米顆粒表面性質(zhì)來達(dá)到載藥目的。但是，納米載體的尺寸大小與其在體內(nèi)的表現(xiàn)息息相關(guān)。為了進(jìn)一步提高納米載藥體系穿過血流進(jìn)入患病部位的效率，克服各種生物屏障，激活其診斷或治療目標(biāo)部位的功能，本研究引入了DNA-金納米顆粒復(fù)合物，設(shè)計(jì)出一種形貌可變的納米載體。

本研究利用腫瘤細(xì)胞微環(huán)境所具有的酸性特點(diǎn)，引入了一種優(yōu)異的pH響應(yīng)型的可變形三鏈體脫氧核糖核酸。而C—G·C+三鏈體DNA結(jié)構(gòu)作為triplex DNA的其中一種，在pH=4.5的酸性條件下穩(wěn)定，在中性pH下重新解鏈成C—G雙鏈體構(gòu)型[21-22]，其響應(yīng)率高，pH響應(yīng)區(qū)間窄[23-27]。這與腫瘤微環(huán)境所具有的偏酸性特點(diǎn)相對(duì)應(yīng)，因此，選擇了C—G·C+三鏈體DNA結(jié)構(gòu)作為本載藥聚集體的響應(yīng)框架。PAGE以及DNA溶解曲線的實(shí)驗(yàn)證明了在中性條件下，triplex DNA可以和其互補(bǔ)序列complement DNA形成雜交雙鏈，使溶液環(huán)境變?yōu)樗嵝院?，因三鏈體結(jié)構(gòu)的形成，使雜交雙鏈發(fā)生解鏈，即選擇的C—G·C+型可以實(shí)現(xiàn)預(yù)期的pH誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)變化。

本研究利用雜交雙鏈兩端以及互補(bǔ)鏈S-10T上的巰基，通過冷凍法將其修飾在不同的金納米顆粒上，由DNA鏈的牽引固定作用，令5、13nm金顆粒形成聚集體結(jié)構(gòu)，組裝出聚集體結(jié)構(gòu)。冷凍法[28]是最新出現(xiàn)的修飾方法，冷凍法無需添加其他化學(xué)試劑，方法簡(jiǎn)單，最短耗時(shí)僅需2min，且表面修飾的DNA數(shù)量更多[6]。瓊脂糖凝膠電泳以及紫外可見光譜結(jié)果說明了本研究成功構(gòu)建出了粒徑較大的聚集體結(jié)構(gòu)。而TEM以及DLS均表明，絕大多數(shù)聚集體尺寸在50～80nm之間，為更易進(jìn)入細(xì)胞的大小,且不易被腎臟快速清除[27-30]。5nm金顆粒具有水溶性好、合成方法簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性好、不易聚集等優(yōu)點(diǎn)，故本文選取5nm金顆粒作為主要響應(yīng)基元，同時(shí)為了所組裝的聚集體達(dá)到利于細(xì)胞內(nèi)吞的尺寸大小，向其中加入少量13nm金顆粒作為聚集體的核心。且當(dāng)聚集體處于酸性條件下時(shí)，三鏈體結(jié)構(gòu)形成，雜交雙鏈解鏈，聚集體重新恢復(fù)分散的單顆?；蛐【奂w狀態(tài)，更易被細(xì)胞外排。

DOX是臨床及科研中非常經(jīng)典的抗腫瘤藥物，其抗癌譜相對(duì)大部分藥物來說更為廣泛，同時(shí)由于其自發(fā)熒光的特性，極大地方便了其表征過程。游離狀態(tài)下，DOX的自發(fā)熒光強(qiáng)度會(huì)隨著其濃度的增強(qiáng)而發(fā)生線性增長(zhǎng)，且pH改變對(duì)其熒光強(qiáng)度的影響極低，故可借此來估算溶液中游離DOX的濃度。而DNA雙鏈中，連續(xù)的CG堿基提供了DOX的運(yùn)載位點(diǎn)，DOX可以利用其平面芳香環(huán)結(jié)構(gòu)選擇性的插入DNA雙螺旋的CG或GC堿基對(duì)中[31-32]。當(dāng)DOX插入DNA雙鏈后，其固有熒光淬滅，在驗(yàn)證不同pH下雙鏈DNA對(duì)DOX釋放能力的試驗(yàn)中，溶液中游離的DOX明顯增多，證明了在酸性環(huán)境下時(shí)，Hoogsteen鍵形成，促使雙鏈打開并將DOX釋放，且其自發(fā)熒光恢復(fù)，是刺激響應(yīng)變形載體成功構(gòu)建的有力保證。

通過載帶有DOX的雜交雙鏈與納米顆粒組裝出響應(yīng)腫瘤酸性微環(huán)境的載藥聚集體(cluster-DOX)。在酸性環(huán)境下，溶液中游離的DOX較中性環(huán)境下明顯增多，且pH為4～4.5時(shí)，DOX的釋放量有較明顯的變化，說明cluster-DOX成功釋放出藥物DOX，可以達(dá)到殺死腫瘤細(xì)胞的目的。而細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，載藥聚集體可以被細(xì)胞快速內(nèi)吞，釋放出DOX，并對(duì)腫瘤細(xì)胞有顯著的殺傷效果。

綜上，本研究構(gòu)建的納米載藥體系完成了結(jié)構(gòu)的聚集、解聚過程，在該過程中，載帶的藥物可以被成功釋放出來，達(dá)到更加精準(zhǔn)、快速、高效、更低藥物劑量殺死腫瘤細(xì)胞的目的。本研究成果可以為新一代刺激響應(yīng)型納米載帶體系提供新的思路，也為納米材料輔助癌癥治療提供借鑒意義。