陳凡榮，佟 毅，劉海濱，梁春慧

（1.中糧生化能源（肇東）有限公司，黑龍江肇東 151100；2.吉林中糧生化有限公司，吉林長春 130033）

近年來，隨著世界性的能源危機日益嚴(yán)重，我國霧霾等環(huán)境問題也愈趨嚴(yán)重。燃料乙醇是一種可再生燃料，與石油功能相似[1]；目前，10 多個國家和地區(qū)已在使用燃料乙醇，使用最多的是美國、巴西、歐盟和中國。一代乙醇是以玉米等淀粉質(zhì)為原料發(fā)酵制得的可再生能源，已經(jīng)在能源領(lǐng)域脫穎而出，并越來越顯示出廣闊和深遠(yuǎn)的發(fā)展前景[5]。

2017 年9 月，國家發(fā)改委、國家能源局、財務(wù)部等十五部委出臺的《關(guān)于擴大生物燃料乙醇生產(chǎn)和推廣使用車用乙醇汽油的實施方案》規(guī)定，2020 年基本實現(xiàn)全覆蓋推廣使用乙醇汽油，對發(fā)展我國燃料乙醇生產(chǎn)和推廣使用車用乙醇汽油具有重大意義。按照規(guī)劃要求，2020年我國所有車用汽油均改為乙醇汽油，當(dāng)前我國車用汽油表觀消費量為1.23億噸，2020 年我國汽油消費量將達到1.2 億噸，按10%組分計算，燃料乙醇消費量為1500萬噸，是當(dāng)前消費量的5倍，市場空間巨大。

隨著政策的深化實施與技術(shù)的進步，中國燃料乙醇工業(yè)將迎來激增現(xiàn)象，在保證生產(chǎn)成本的前提下，優(yōu)化發(fā)酵條件，精細(xì)化控制，提高原料利用率，是提高企業(yè)競爭力的有效手段之一[14]。本試驗以燃料乙醇企業(yè)現(xiàn)有的工藝情況為基礎(chǔ)，利用Minitab17 軟件優(yōu)化燃料乙醇生產(chǎn)的發(fā)酵條件，以期實現(xiàn)生產(chǎn)效率的提高。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑

試驗材料：31%干物液化醪，從燃料乙醇企業(yè)生產(chǎn)現(xiàn)場取回；高效糖化酶，酶活力360000 U/mL；市售酸性蛋白酶，酶活力100000 U/mL。

試劑：市售尿素。

1.2 儀器與設(shè)備

1260 液相色譜，安捷倫科技發(fā)展有限公司；3-18 k 離心機，Sigma 公司；AL20 分析天平，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；FiveEasyPlus pH 計，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；ZHWY-2112F 搖床，上海智城分析儀器制造有限公司。

1.3 檢測方法

試驗組成熟醪的測定：采用高效液相色譜法。

色譜檢測條件：流動相：0.005 mol/L H2SO4；預(yù)處理柱：伯樂125-0129，30 mm×4.6 mm；色譜柱：伯樂HPX-87H，300 mm×7.8 mm；泵流：0.8 mL/min；柱溫：65 ℃；RID 檢測器溫度：50 ℃；進樣量15 μL；運行時間30 min[2]。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵條件因素的優(yōu)化

糖化酶作用于淀粉分子中結(jié)合的1，4-糖苷鍵，從分子長鏈的非還原端，一個一個地水解為葡萄糖分子，水解后的產(chǎn)物幾乎全部生成萄萄糖[4]。發(fā)酵前期糖化酶加量過高，水解產(chǎn)生的葡萄糖含量大，會對酵母產(chǎn)生一定的抑制作用[15]，導(dǎo)致發(fā)酵酒精度偏低；糖化酶加量過低時不能將糊精類物質(zhì)完全分解，發(fā)酵最終酒精度偏低，殘?zhí)呛扛遊6]。

在酒精發(fā)酵過程中，酵母細(xì)胞中含氮量雖然不高，只占到2 %左右[9-10]，但是它的作用卻非常重要。在發(fā)酵過程中添加尿素可為酵母的生長和代謝提供所需的游離氨基氮。大量的研究表明，當(dāng)游離氨基氮的濃度大于100 mg/L時，酵母菌的繁殖呈直線增長，而超過870 mg/L 時，再增加含氮量也不會對其有明顯的影響。因此氮濃度在150～870 mg/L的范圍，會直接影響到發(fā)酵的速度[12]。

酵母生長的最適pH4.5～5.0；但在此條件下也適宜其他雜菌的生長，當(dāng)pH 值降到4.2 以下時，酵母仍能繼續(xù)繁殖，但此時，乳酸菌已停止生長。所以在生產(chǎn)過程中一般將發(fā)酵初始pH 值控制在4.0～4.5之間。

酸性蛋白酶是具催化功能的酶，能夠水解蛋白質(zhì)，在酸性條件下具有較高的活性，能水解原料中的縮氨酸鍵，釋放氨基酸[11]。酵母在發(fā)酵階段的生長可以通過懸浮蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化的氨基酸來促進，從而加速發(fā)酵并提高產(chǎn)量。酸性蛋白酶加量過低時，不能將原料中的蛋白質(zhì)分解以供酵母利用，導(dǎo)致發(fā)酵結(jié)束酒精度較低；在氮源充足的情況下，原料中蛋白質(zhì)含量是固定的，酸性蛋白酶加量過高對酒精度的影響作用差異不大[13]。

由于試驗因素較多，對所有因子進行交互試驗需耗費大量時間和精力，采用Mintab軟件輔助設(shè)計全因子試驗[3]，結(jié)合前期試驗條件的影響，擬定試驗因子為糖化酶加量(最大值1.2 kg/t醪、最小值0.8 kg/t醪)，尿素(最大值4.0 kg/t 醪/、最小值2.5 kg/t 醪)，酸性蛋白酶加量(最大值0.3 kg/t 醪、最小值0.2 kg/t醪)，pH(最大值4.5、最小值4.0)具體設(shè)計如表1所示。

表1 實驗設(shè)計各因素與水平 (kg/t醪)

2.2 實驗結(jié)果與分析

每個試驗組重復(fù)兩次實驗，在發(fā)酵結(jié)束測定酒精度。具體實驗數(shù)據(jù)見表2。

通過軟件計算，得出模型及回歸方程，其R-sq=91.04%、R-sq（調(diào)整）=86.78%，說明刪去所有影響不顯著項后的模型結(jié)構(gòu)較好，回歸方程具有較好的預(yù)測能力。以未編碼單位表示的回歸方程酒精度（%vol)=15.6159+0.04094 糖化酶+0.04406 尿素+0.03469 酸性蛋白酶-0.00094 pH+0.02781 糖化酶*尿素+0.01219 糖化酶*酸性蛋白酶+0.00781 糖化酶*pH+0.01531 尿素*酸性蛋白酶+0.01969 尿素*pH+0.00156 酸性蛋白酶*pH（圖1）。方程的擬合是使用已編碼單位進行的，多項式模型方程擬合的性質(zhì)由確定系數(shù)R2表示，R2=0.9125，說明此模型近似的擬合于真實情況，預(yù)測值和實測值之間具有高度的相關(guān)性，可以解釋91.25%實驗所得的響應(yīng)值的變化。

表2 Plaekett-Burman實驗設(shè)計表及結(jié)果

通過效應(yīng)Pareto 可以看出，試驗的關(guān)鍵因子為B、A、C、AB、BD、BC、AC、AD、CD、D，即尿素、糖化酶、酸性蛋白酶、糖化酶×尿素、尿素×酸性蛋白酶、尿素×酸性蛋白酶、糖化酶×酸性蛋白酶、糖化酶×pH值、酸性蛋白酶×pH值、pH值（圖1）。

由圖1 可以看出，尿素斜率較大，說明其對發(fā)酵的影響顯著，其次為糖化酶、酸性蛋白酶，pH 值的斜率較為平緩，說明其對發(fā)酵的影響較不顯著。因子的重要順序為B＞A＞C＞D（尿素＞糖化酶＞酸性蛋白酶＞pH值）。（圖2）

由圖2 可以看出，糖化酶與pH 值、尿素與pH值之間存在著一定的交互作用，糖化酶與尿素、糖化酶與酸性蛋白酶、尿素與酸性蛋白酶不存在明顯的交互作用關(guān)系。（圖3）。

通過相應(yīng)優(yōu)化器，利用控制方程式對數(shù)據(jù)進行計算[7-8]，得出最佳操作水平為糖化酶1.2 kg/t 醪、尿素4.0 kg/t 醪、酸性蛋白酶0.3 kg/t 醪、pH 4.5。采用最佳操作水平數(shù)據(jù)進行試驗，以驗證發(fā)酵結(jié)果，通過試驗發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵72 h 時，發(fā)酵酒精度為15.82%vol，優(yōu)于其他試驗組。如圖4所示。

3 結(jié)論與展望

使用燃料乙醇企業(yè)生產(chǎn)線上的31%干物液化醪進行發(fā)酵試驗，經(jīng)過具體實驗，糖化酶1.2 kg/t醪、尿素4.0 kg/t 醪、酸性蛋白酶0.3 kg/t 醪、pH 4.5，發(fā)酵效果最優(yōu)，酒精度可達15.82 %vol，乙醇得率提高2%。由于研究方向以及設(shè)備儀器的原因，本次實驗主要對發(fā)酵成熟酒精度進行了比較，并未對發(fā)酵后的殘總糖、殘淀粉等項目進行檢測，后續(xù)研究將對配料物料粒度分布、液化和發(fā)酵參數(shù)控制進行綜合研究，從而確定更優(yōu)的燃料乙醇的生產(chǎn)工藝條件，促進酒精發(fā)酵的高效發(fā)展與進步。