蘋果梨酵素發(fā)酵過程中的褐變與抗氧化活性

范昊安,沙如意,*,方 晟,薛淑龍,陳 雨,黃 俊,崔艷麗,毛建衛(wèi),4,*

(1.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心,浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院,浙江 杭州 310023;2.紹興文理學(xué)院元培學(xué)院,浙江 紹興 312000;3.浙江大學(xué)理學(xué)部,浙江 杭州 310027;4.浙江工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院,浙江 紹興 312000)

食用酵素是以一種或多種新鮮蔬菜、水果和谷豆類、海藻類、食藥兩用本草類、菌菇類等食材為原料,加(或不加)糖類物質(zhì),經(jīng)多種有益菌通過較長時(shí)間發(fā)酵而生產(chǎn)的功能性微生物發(fā)酵產(chǎn)品,擁有豐富的次生代謝產(chǎn)物、原料本身營養(yǎng)成分和益生菌等功能性成分,特別是富含小分子功能成分[1-2]。

蘋果梨是薔薇科(Rosaceae)梨屬果樹的果實(shí),多產(chǎn)自吉林省延邊自治州[3]。蘋果梨富含氨基酸、微量元素、維生素、多酚類及黃酮類化合物等營養(yǎng)物質(zhì)[4-6],研究表明其具有燥濕健脾、消炎止咳、潤肺、利尿、抗真菌、抗氧化等多種功效[7-10]。蘋果梨的貯藏方式單一,貯藏量僅占總產(chǎn)量的3%,加工量不足總量的10%,大部分用于鮮果或者凍梨銷售[11],目前蘋果梨可開發(fā)加工的產(chǎn)品形式有蘋果梨酒、蘋果梨澄清飲料、蘋果梨果脯、蘋果梨果汁、蘋果梨脆片等[3],但蘋果梨在加工過程中極易發(fā)生褐變,影響產(chǎn)品的外觀品質(zhì)與營養(yǎng)價(jià)值,研究表明果蔬原料中的酶促褐變主要是由多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)引起的[11-12]。PPO能催化酚類物質(zhì)氧化成為醌,進(jìn)而生成棕褐色或黑色的色素。

基于蘋果梨的加工企業(yè)及加工形式較少,食用酵素作為一種綠色高效的農(nóng)產(chǎn)品加工方式,可以在解決蘋果梨貯藏問題的同時(shí),實(shí)現(xiàn)蘋果梨的精深加工,拓寬蘋果梨的應(yīng)用市場。本研究以蘋果梨酵素為研究對象,通過跟蹤檢測蘋果梨發(fā)酵過程中色度、褐變程度、PPO活力等參數(shù)反映蘋果梨酵素在發(fā)酵過程中的色澤變化與褐變狀況,通過跟蹤檢測pH值、可滴定酸、有機(jī)酸、總酚、總黃酮含量變化分析酶促褐變的影響因素及蘋果梨發(fā)酵過程中活性成分的變化;以1,1-二苯基-2-苦苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基清除能力、2,2’-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(2,2’-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS)陽離子自由基清除能力、羥自由基清除能力、過氧化氫清除能力和還原力為抗氧化性指標(biāo),評價(jià)蘋果梨酵素的抗氧化活性,以期為蘋果梨酵素的綜合開發(fā)提供相關(guān)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘋果梨由吉林省延吉市蘋果梨種植基地提供;白砂糖(食品級) 太古糖業(yè)(中國)有限公司;酵液由浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

標(biāo)準(zhǔn)品(檸檬酸、抗壞血酸) 美國Sigma公司;甲醇(色譜純) 美國Thermo Fisher Scientific公司;KH2PO4(色譜純)、鄰苯二酚、ABTS 上海阿拉丁化學(xué)試劑有限公司;DPPH 日本TCI公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

316L型50 L不銹鋼發(fā)酵罐由浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

916 Ti-Touch電位滴定儀 瑞士Metrohm公司;PHS-3C精密酸度計(jì) 杭州齊威儀器有限公司;UV-5500PC紫外分光光度計(jì) 上海市元析儀器有限公司;CM-5分光測色計(jì) 日本Konica Minolta公司;e2695高效液相色譜(配有Waters 2998二極管陣列檢測器)儀 美國Waters公司;SpectraMax iD5多功能酶標(biāo)儀 美國Molecular Devices公司。

1.3 方法

1.3.1 蘋果梨酵素的制備

用無菌水沖洗新鮮蘋果梨(果實(shí)完全成熟且無蟲害潰爛),自然瀝干后切塊,將蘋果梨和白砂糖以質(zhì)量比1∶1加入高壓蒸汽滅菌過的50 L不銹鋼發(fā)酵罐中,并加入適量酵液,于(20±5)℃避光發(fā)酵,定期取樣,將樣品離心后的上清液保存于-80 ℃超低溫冰箱中,待測。

1.3.2 色度的測定

使用分光測色計(jì)對蘋果梨酵素進(jìn)行測定,記錄L*、a*、b*值。其中,L*值表示樣品色澤的亮度,a*值表示紅度或綠度,b*值表示黃度或藍(lán)度。以鮮榨蘋果梨汁為參比標(biāo)準(zhǔn)溶液,計(jì)算色差值ΔE,ΔE越小表示待測樣品與參比樣品色澤越接近,反之為相差越大。ΔE計(jì)算公式如下:

1.3.3 褐變程度的測定[13]

取2 mL酵素樣品,以去離子水作空白對照,測定其在420 nm波長處吸光度,吸光度即為蘋果梨酵素的褐變程度。

1.3.4 PPO活力的測定[14]

在96 孔板中快速加入磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)160 μL,0.1 mol/L鄰苯二酚溶液15 μL,酵素樣品30 μL,混勻,于30 ℃反應(yīng)5 min,利用酶標(biāo)儀在420 nm波長處測定吸光度,記錄反應(yīng)開始與結(jié)束時(shí)的吸光度。在此測定條件下,吸光度每分鐘增加0.001定義為一個(gè)酶活力單位(U),計(jì)算如式(2)所示:

式中:ΔA420nm為反應(yīng)前后吸光度差值;D為稀釋倍數(shù);t為反應(yīng)時(shí)間/min。

1.3.5 pH值與可滴定酸的測定

使用精密pH計(jì)測定酵素樣品的pH值。

使用電位滴定儀測定酵素樣品的可滴定酸含量,參照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定方法》中的pH電位法,結(jié)果參考T/CBFIA 08003—2017《食用植物酵素》,以乳酸質(zhì)量濃度(g/100 mL)計(jì)。

1.3.6 有機(jī)酸含量的測定[15]

取400 μL酵素樣品,使用0.01 mol/L KH2PO4(pH 2.7)溶液稀釋至1 mL,經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾,待測。配制質(zhì)量濃度均為1 mg/mL的抗壞血酸、檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾,待測。

檢測條件:色譜柱:Atiantis?T3柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:甲醇-KH2PO4(pH 2.7)2∶98(V/V);流速:1.0 mL/min;柱溫:25 ℃;進(jìn)樣量:10 μL;檢測波長:210 nm。檢測器:二極管陣列檢測器。

1.3.7 總酚含量的測定

采用福林-酚法[16]測定蘋果梨酵素中總酚含量。取100 μL酵素樣品,用去離子水稀釋至0.5 mL,加入體積分?jǐn)?shù)為10%的福林-酚溶液2.5 mL,常溫避光靜置反應(yīng)3 min后,加入75 g/L Na2CO3溶液2 mL,混勻。于25 ℃反應(yīng)1 h,在765 nm波長處測定吸光度。

1.3.8 總黃酮含量的測定

采用NaNO2-Al(NO3)3比色法[17]測定蘋果梨酵素中總黃酮含量。取400 μL酵素樣品,加入50 g/L NaNO2溶液150 μL,混勻靜置6 min,加入100 g/L Al(NO3)3溶液150 μL,混勻靜置6 min,加入40 g/L NaOH溶液2.0 mL,用去離子水定容至5 mL,混勻靜置15 min,在510 nm波長處測吸光度。

1.3.9 DPPH自由基清除能力的測定[18]

取200 μL酵素樣品,用去離子水稀釋至2 mL,加入0.1 mmol/L DPPH-甲醇溶液4 mL,50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.4)450 μL,于25 ℃恒溫水浴反應(yīng)30 min,以去離子水為空白對照,在517 nm波長處測定吸光度。自由基清除率計(jì)算如式(3)所示:

式中:A0為空白對照吸光度;A1為樣品吸光度;A2為樣品本底管吸光度。

1.3.10 ABTS陽離子自由基清除能力的測定[19]

ABTS稀釋液配制:稱取96.02 mg ABTS和16.55 mg過硫酸鉀,用5 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)定容至25 mL,在暗處室溫放置12～16 h,使用前,用上述磷酸鹽緩沖液稀釋,使其在波長734 nm處的吸光度為0.70±0.02。

取4 μL酵素樣品,用上述磷酸鹽緩沖液稀釋至300 μL,加入ABTS稀釋液5 mL,于30 ℃反應(yīng)1 h。以去離子水為空白對照,在734 nm波長處測吸光度。ABTS陽離子自由基清除率計(jì)算如式(3)所示。

1.3.11 羥自由基清除能力的測定[20]

取500 μL酵素樣品,用去離子水稀釋至2 mL,加入6 mmol/L H2O2溶液1.4 mL,20 mmol/L水楊酸鈉溶液0.6 mL和1.5 mmol/L FeSO4溶液2 mL,混勻,于37 ℃恒溫水浴反應(yīng)1 h。以去離子水為空白對照,在510 nm波長處測定吸光度。羥自由基清除率計(jì)算如式(3)所示。

1.3.12 過氧化氫清除能力的測定[21]

取500 μL酵素樣品,用去離子水補(bǔ)至1 mL,加入8 mmol/L H2O2溶液1.2 mL,混合均勻,于室溫靜置10 min。以去離子水為空白對照,在230 nm波長處測定吸光度。過氧化氫清除率計(jì)算如式(3)所示。

1.3.13 還原力的測定[22]

取200 μL酵素樣品,用0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.6)補(bǔ)至2.5 mL,加入10 g/L鐵氰化鉀溶液2.5 mL,混合均勻,于50 ℃反應(yīng)30 min,再加入100 g/L三氯乙酸溶液2.5 mL,混合均勻,靜置10 min,立即取2.5 mL上清液,加入去離子水2.5 mL和1 g/L三氯化鐵溶液0.5 mL,混合均勻。以去離子水為空白對照,在700 nm波長處測定吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋果梨酵素發(fā)酵過程中色度的變化

色澤是衡量酵素品質(zhì)質(zhì)量的重要物理指標(biāo),同時(shí)也可以反映蘋果梨酵素在發(fā)酵過程中的褐變狀況。如表1所示,發(fā)酵過程中色度變化顯著(P＜0.05)。L*代表亮度,L*值下降可以直觀反映蘋果梨加工過程中褐變的發(fā)生[23]。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長,L*值呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢,發(fā)酵第80天L*值達(dá)到最低值,為58.71±0.00,發(fā)酵140 d,L*值回升至96.32±0.11。a*＞0代表紅色色調(diào),b*＞0代表黃色色調(diào),在發(fā)酵過程中兩者均呈先上升后下降的趨勢。發(fā)酵5～80 d,a*值從0.66±0.01上升至18.98±0.02,說明隨著褐變的發(fā)生,蘋果梨酵素逐漸呈現(xiàn)紅褐色。發(fā)酵80～140 d,a*值回降至0.90±0.06,說明發(fā)酵后期紅色色調(diào)基本消失,復(fù)色為蘋果梨汁本色。在發(fā)酵過程中,b*值從5.32±0.01上升至10.23±0.15,說明長期發(fā)酵適當(dāng)加深了蘋果梨酵素的淡黃色色調(diào)。結(jié)果表明,發(fā)酵140 d的蘋果梨酵素總色調(diào)呈鮮亮的淡黃色,復(fù)色效果明顯。

表1 發(fā)酵過程中色度的變化Table 1 Changes in chroma during fermentation

圖1 發(fā)酵過程中色差的變化Fig. 1 Changes in chromatic aberration during fermentation

色差值ΔE越小,蘋果梨酵素的色度越接近鮮榨蘋果梨汁(L*=96.94±0.01,a*=-0.56±0.01,b*=8.26±0.03)。如圖1所示,發(fā)酵過程中ΔE值呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。發(fā)酵前15 d,ΔE值均小于5,說明無明顯褐變發(fā)生。發(fā)酵20～80 d,ΔE快速上升,酵素總體呈現(xiàn)紅褐色。發(fā)酵80 d后,ΔE值急劇下降,并在發(fā)酵第140天達(dá)到最低值2.53±0.19。發(fā)酵第140天時(shí)色澤變化最小,且其ΔE值與發(fā)酵第10天無顯著差異(P＞0.05),說明較長期的發(fā)酵過程保持了蘋果梨的綜合色度,起到了有效的護(hù)色復(fù)色效果。

2.2 蘋果梨酵素發(fā)酵過程中褐變程度的變化

圖2 發(fā)酵過程中褐變程度的變化Fig. 2 Changes in browning degree during fermentation

由圖2可知,褐變程度在發(fā)酵過程中呈先上升后下降的趨勢,其變化趨勢與L*值相反。發(fā)酵5～40 d,褐變程度快速上升且于發(fā)酵15～20 d上升速度最快,增幅達(dá)到312.46%。發(fā)酵40～80 d,褐變程度進(jìn)一步上升,并在發(fā)酵第80天時(shí)達(dá)到最高值2.010±0.002。發(fā)酵前期褐變程度的上升主要源于PPO引起的酶促褐變,高糖滲透壓導(dǎo)致多酚、黃酮類物質(zhì)的溶出與細(xì)胞內(nèi)PPO的釋放,使得底物、酶與氧氣充分接觸,從而促進(jìn)酶促褐變的發(fā)生[24]。在發(fā)酵后期,褐變程度持續(xù)下降至0.706±0.004,由此可知酶促褐變在發(fā)酵后期受到控制。李梅等[25]研究發(fā)現(xiàn)毛竹筍自然發(fā)酵63 d的L*值相較發(fā)酵21 d明顯回升,更有效保持毛竹筍的綜合色澤,說明延長發(fā)酵具有一定的生物護(hù)色效果。

2.3 蘋果梨酵素發(fā)酵過程中PPO活力的變化

梨中的PPO是引起酶促褐變的主要原因之一,酚類物質(zhì)在PPO催化作用下氧化為鄰醌及其聚合物類黑色素,進(jìn)而導(dǎo)致色澤加深、變暗[26]。如圖3所示,PPO活力在發(fā)酵過程中呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,與褐變程度變化趨勢相似,說明蘋果梨酵素的褐變一定程度上由PPO引起的酶促褐變所致。發(fā)酵前50 d,PPO活力快速上升,于第50天達(dá)到酶活力峰值(26.26±0.28)U/mL,發(fā)酵前期PPO活力增強(qiáng)可能與蘋果梨果肉組織損傷有關(guān)[27]。發(fā)酵50 d后,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長,PPO活力不斷下降,發(fā)酵第80天蘋果梨酵素中PPO活力與發(fā)酵第20天己無明顯差異(P＞0.05),這可能與發(fā)酵過程中有機(jī)酸、多酚類、黃酮類化合物等活性物質(zhì)的生成代謝有關(guān)。在生產(chǎn)實(shí)踐中,抑制PPO活力是加工過程中抑制酶促褐變的主要方法,在蘋果梨酵素制作的過程中,通過自身因素抑制PPO活力,從而達(dá)到護(hù)色目的,為有效控制酶促褐變提供了經(jīng)濟(jì)環(huán)保的新思路。

圖3 發(fā)酵過程中PPO活力的變化Fig. 3 Changes in PPO activity during fermentation

2.4 蘋果梨酵素發(fā)酵過程中pH值與可滴定酸的變化

圖4 發(fā)酵過程中pH值和可滴定酸含量的變化Fig. 4 Changes in pH value and total titratable acidity during fermentation

如圖4所示,pH值和可滴定酸含量在發(fā)酵過程中呈現(xiàn)相反的變化趨勢。pH值在20 d內(nèi)由5.10±0.05迅速下降至4.37±0.06,后期緩慢下降直至穩(wěn)定于4.14±0.02。權(quán)伍榮等[28]研究表明當(dāng)pH值小于4.20時(shí),蘋果梨PPO活力幾乎為0。其原因在于PPO為含銅蛋白質(zhì),在低pH值時(shí),PPO中的輔基銅會被解離成銅離子,同時(shí)酸性較強(qiáng)會使蛋白質(zhì)變性,導(dǎo)致PPO失活[29]。發(fā)酵第50天,蘋果梨酵素pH值降至4.20±0.02,由圖3可知,同期PPO活力亦開始下降,說明發(fā)酵產(chǎn)生的低pH值環(huán)境較好地抑制了PPO活力。發(fā)酵過程中,可滴定酸呈逐漸上升趨勢,且在前30 d上升速率較快,后期趨于平緩,由(0.017±0.003)g/100 mL上升至(0.320±0.004)g/100 mL。發(fā)酵前期可滴定酸含量的快速上升是由于發(fā)酵過程中醋酸、草酸等多種有機(jī)酸的生成所致[30]。發(fā)酵后期可滴定酸含量的緩慢上升可能是因?yàn)镻PO引起的酶促褐變消耗大量氧氣,微生物在溶氧不足的條件下將乙醇轉(zhuǎn)化為醋酸,將己糖轉(zhuǎn)化為乳酸等有機(jī)酸[31],但同時(shí)檸檬酸與抗壞血酸含量不斷下降,使可滴定酸含量上升趨勢較為平緩。

2.5 蘋果梨酵素發(fā)酵過程中有機(jī)酸含量的變化

如圖5所示,發(fā)酵過程中抗壞血酸和檸檬酸含量呈先上升后下降的趨勢。檸檬酸前15 d未檢出,說明檸檬酸是由蘋果梨酵素發(fā)酵代謝產(chǎn)生的,并在發(fā)酵第40天達(dá)到最大值(0.587±0.011)mg/mL。抗壞血酸是蘋果梨中主要有機(jī)酸之一[32],其質(zhì)量濃度在發(fā)酵第50天達(dá)到最大值(0.794±0.001)mg/mL。發(fā)酵后期兩者含量的降低可能是與PPO及其褐變產(chǎn)物反應(yīng)消耗所致。部分有機(jī)酸對酶促褐變具有雙重抑制作用,在降低pH值的同時(shí),抗壞血酸可以將醌類及其衍生物還原成酚類物質(zhì)[33],甚至可以作為競爭性抑制劑被PPO直接氧化,從而起到控制褐變的作用;檸檬酸可以鰲合PPO的銅離子輔基,進(jìn)而抑制其活力[27]。Sapers等[34]研究發(fā)現(xiàn)相較單獨(dú)使用褐變抑制劑,抗壞血酸和檸檬酸兩者聯(lián)用具有更好的褐變抑制效果。由此可知,蘋果梨酵素通過微生物發(fā)酵代謝生成抗壞血酸和檸檬酸,在解決抗壞血酸自身成本問題的同時(shí),有效控制酶促褐變,達(dá)到護(hù)色效果。

圖5 發(fā)酵過程中有機(jī)酸含量的變化Fig. 5 Changes in organic acid content during fermentation

2.6 蘋果梨酵素發(fā)酵過程中總酚含量的變化

圖6 發(fā)酵過程中總酚含量的變化Fig. 6 Changes in total phenolic content during fermentation

如圖6所示,發(fā)酵過程中總酚含量呈迅速上升后趨于平緩的趨勢。在發(fā)酵前20 d,總酚含量快速上升,增長約17.52 倍,可能與發(fā)酵前期蘋果梨中的多酚類物質(zhì)大量溶出有關(guān)。發(fā)酵20 d后,總酚含量緩慢上升,于第140天達(dá)到最大值(0.426±0.004)mg/mL,這可能是隨著發(fā)酵的進(jìn)行,在微生物作用下,單體酚類物質(zhì)的合成所致[35]。王磊等[36]研究表明底物濃度(即總酚含量)在低范圍時(shí),隨著總酚含量的增加,PPO活力也相應(yīng)增強(qiáng),但隨著總酚含量的持續(xù)增長,高濃度的底物會對PPO活力起到抑制作用,進(jìn)一步說明蘋果梨酵素發(fā)酵過程中總酚含量的上升抑制了PPO活力,從而控制酶促褐變的發(fā)生。

2.7 蘋果梨酵素發(fā)酵過程中總黃酮含量的變化

圖7 發(fā)酵過程中總黃酮含量的變化Fig. 7 Changes in total flavonoid content during fermentation

如圖7所示,發(fā)酵過程中總黃酮含量呈先迅速上升,后有所下降,再持續(xù)上升的趨勢。在發(fā)酵前30 d,總黃酮質(zhì)量濃度快速上升,并于第30天達(dá)到最大值(44.522±0.338)μg/mL。發(fā)酵第50天總黃酮含量的下降可能是因?yàn)榇藭r(shí)PPO活力最強(qiáng),黃酮類化合物在PPO的作用下被氧化分解。隨后,總黃酮質(zhì)量濃度持續(xù)上升至(44.443±0.276)μg/mL,這可能是由于游離態(tài)的黃酮醇類物質(zhì)與糖苷結(jié)合而成的黃酮醇配糖體在發(fā)酵后期發(fā)生水解,導(dǎo)致總黃酮含量回升[37]。

2.8 蘋果梨酵素發(fā)酵過程中DPPH自由基清除率的變化

圖8 發(fā)酵過程中DPPH自由基清除率的變化Fig. 8 Changes in DPPH radical scavenging activity during fermentation

如圖8所示,發(fā)酵過程中DPPH自由基清除率呈迅速上升后趨于平緩的趨勢。發(fā)酵前30 d,DPPH自由基清除率快速上升至最大值(90.91±0.74)%,隨后趨于平緩,說明適當(dāng)延長發(fā)酵時(shí)間可明顯提高蘋果梨酵素的抗氧化活性。Galvis Sáchez等[38]研究表明6 種不同梨品種的果實(shí)及其果皮均具有良好的DPPH自由基清除能力,且清除DPPH自由基可能是梨中多種酚類物質(zhì)共同作用的結(jié)果。

2.9 蘋果梨酵素發(fā)酵過程中ABTS陽離子自由基清除率的變化

如圖9所示,發(fā)酵過程中ABTS陽離子自由基清除率呈迅速上升后趨于平緩的趨勢。發(fā)酵前20 d,ABTS陽離子自由基清除率從(12.86±0.48)%快速上升至(93.74±0.65)%。隨后清除率緩慢上升直至平緩,并于第80天達(dá)到最大值(99.82±0.18)%。蘋果梨酵素ABTS陽離子自由基清除能力變化趨勢與其總酚含量變化相似,說明兩者具有極顯著的相關(guān)性(P＜0.01),與葡萄酵素的研究結(jié)果一致[39]。

圖9 發(fā)酵過程中ABTS陽離子自由基清除率的變化Fig. 9 Changes in ABTS cation radical scavenging activity during fermentation

2.10 蘋果梨酵素發(fā)酵過程中羥自由基清除率的變化

圖10 發(fā)酵過程中羥自由基清除率的變化Fig. 10 Changes in hydroxyl radical scavenging activity during fermentation

如圖10所示,發(fā)酵過程中羥自由基清除率呈持續(xù)上升的趨勢。發(fā)酵前10 d,蘋果梨酵素對羥自由基具有促氧化作用,但隨著發(fā)酵時(shí)間的延長,羥自由基清除率不斷上升,當(dāng)發(fā)酵第110天時(shí)達(dá)到最大值(70.74±0.88)%。趙金偉等[10]研究表明蘋果梨酚類物質(zhì)對羥自由基的清除能力較強(qiáng),說明適當(dāng)發(fā)酵可以抑制蘋果梨酵素發(fā)酵前期不良的促氧化作用,并進(jìn)一步增強(qiáng)其在發(fā)酵后期的羥自由基清除能力。

2.11 蘋果梨酵素發(fā)酵過程中過氧化氫清除率的變化

圖11 發(fā)酵過程中過氧化氫清除率的變化Fig. 11 Changes in hydrogen peroxide scavenging activity during fermentation

過氧化氫自身在細(xì)胞內(nèi)并不活躍,但其在金屬離子作用下會產(chǎn)生羥自由基,從而造成細(xì)胞損傷[40]。如圖11所示,發(fā)酵過程中過氧化氫清除率呈迅速上升后趨于平緩的趨勢。在發(fā)酵第20天快速上升至(96.25±1.06)%后,過氧化氫清除率基本穩(wěn)定,且于發(fā)酵第80天達(dá)到最大值(98.81±1.21)%。陳斐冷等[41]研究表明高異黃酮和酚類等物質(zhì)具有極強(qiáng)的過氧化氫清除能力,蘋果梨酵素過氧化氫清除能力的快速提升可能與其總酚和總黃酮含量的變化有關(guān)。

2.12 蘋果梨酵素發(fā)酵過程中還原力的變化

Fe3+的還原反應(yīng)通常被用來判斷供電子基團(tuán)的強(qiáng)弱,其所反映的還原力與眾多抗氧化機(jī)制密切相關(guān)[42]。如圖12所示,發(fā)酵過程中還原力呈持續(xù)上升的趨勢,并于發(fā)酵第140天達(dá)到最大值0.666±0.001,相較發(fā)酵第5天增長了4.4 倍。郭紅蓮等[43]研究表明相較于未發(fā)酵的枸杞液,枸杞酵素的還原力顯著提高。發(fā)酵時(shí)間的延長有利于蘋果梨酵素還原力的增強(qiáng)。

圖12 發(fā)酵過程中還原力的變化Fig. 12 Changes in reducing power during fermentation

2.13 相關(guān)性分析

圖13 發(fā)酵過程中各理化指標(biāo)與抗氧化活性的相關(guān)性分析熱圖Fig. 13 Heatmap from correlation analysis between physicochemical parameters and antioxidant activity during fermentation

由圖13可知,褐變狀況方面,L*值、色差、褐變程度、PPO活力間呈現(xiàn)極顯著相關(guān)(P＜0.01);褐變控制方面,pH值、可滴定酸、抗壞血酸、檸檬酸、總酚、總黃酮與褐變程度、PPO活力亦具有顯著相關(guān)性(P＜0.05),說明pH值、可滴定酸、抗壞血酸、檸檬酸、總酚、總黃酮等因素可以有效抑制蘋果梨酵素的褐變;抗氧化活性方面,總酚、總黃酮、檸檬酸含量與DPPH自由基、ABTS陽離子自由基、羥自由基清除能力、過氧化氫清除能力、還原力之間均存在極顯著正相關(guān)性(P＜0.01),說明多酚類物質(zhì)、黃酮類物質(zhì)和有機(jī)酸具有較好的抗氧化活性。

3 結(jié) 論

本研究通過測定色度、色差、褐變程度、PPO活力等參數(shù)反映蘋果梨酵素在發(fā)酵過程中的色澤變化與褐變狀況,結(jié)果表明:較長期發(fā)酵可以有效控制PPO引起的酶促褐變,其褐變控制與pH值、可滴定酸、抗壞血酸、檸檬酸、總酚、總黃酮等理化指標(biāo)的變化顯著相關(guān)(P＜0.05),為蘋果梨的加工、護(hù)色、復(fù)色提供科學(xué)合理的新方法。同時(shí)測定DPPH自由基清除率、ABTS陽離子自由基清除率、羥自由基清除率、過氧化氫清除率、還原力等指標(biāo),結(jié)果表明:蘋果梨酵素在發(fā)酵過程中抗氧化活性均呈先快速增加后趨于平緩的趨勢。經(jīng)過發(fā)酵,其抗氧化活性得以大幅度提升,抗氧化活性的提高與總酚、總黃酮、檸檬酸含量的變化顯著相關(guān)(P＜0.05)。蘋果梨酵素富含有機(jī)酸、多酚類化合物、黃酮類化合物等活性成分,其協(xié)同作用可能抑制褐變,且具有良好的抗氧化活性,說明發(fā)酵制備酵素是蘋果梨高值化利用的一種加工方式。