醬香型白酒1輪次釀造細(xì)菌的菌群結(jié)構(gòu)

胡小霞,黃永光,涂華彬,胡 峰,程平言,尤小龍

(1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院,貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州 貴陽 550025;2.貴州茅臺(tái)酒廠(集團(tuán))習(xí)酒有限責(zé)任公司,貴州 習(xí)水 564622)

醬香型白酒作為典型的傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵食品,釀造歷史悠久,深受世界人民尤其是東亞國家消費(fèi)者的喜愛[1]。其釀造工藝特點(diǎn)可概括為高溫制曲、高溫堆積、高溫發(fā)酵、高溫流酒,生產(chǎn)周期長、貯存時(shí)間長,用曲量大,多輪次取酒[2]。酒體風(fēng)格特征為清亮透明、無色或微黃、醬香突出、幽雅細(xì)膩、酒體醇厚、空杯留香持久[3]。

堆積發(fā)酵是醬香白酒釀造的獨(dú)特關(guān)鍵工序,屬于邊糖化邊發(fā)酵方式,通過堆積發(fā)酵可顯著富集微生物和酶類,生成醬香或醬香前體物質(zhì)[4],為入窖發(fā)酵創(chuàng)造條件,相當(dāng)于“二次制曲”[5-7],也是完成入窖發(fā)酵前的糖化基礎(chǔ)。細(xì)菌及細(xì)菌代謝產(chǎn)物在高溫堆積發(fā)酵過程的富集為形成后期窖池發(fā)酵的發(fā)酵動(dòng)力和風(fēng)味動(dòng)力奠定了基礎(chǔ)。堆積發(fā)酵結(jié)束后,酒醅入窖池發(fā)酵,窖池發(fā)酵階段微生物菌群結(jié)構(gòu)繼續(xù)推進(jìn)發(fā)酵,并進(jìn)一步促進(jìn)醬香風(fēng)味化合物的增加[8]。因此,堆積和窖池發(fā)酵的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)及其變化對(duì)產(chǎn)酒和生香具有舉足輕重的作用,而研究醬香型白酒發(fā)酵過程細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)是解析發(fā)酵機(jī)理和風(fēng)味形成的關(guān)鍵,近年引起很多研究人員的關(guān)注。如戴奕杰等[8]分析了醬香白酒釀造的下沙、造沙和7輪次堆積、窖池發(fā)酵糟醅的細(xì)菌多樣性,結(jié)果表明酒醅在發(fā)酵釀酒階段的優(yōu)勢微生物為埃希氏菌屬(Escherichia-Shigella)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、Clostridium_sensu_stricto_1、鏈球菌屬(Streptococcus)、放線桿菌屬(Actinobacillus)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)和鏈格孢屬(Alternaria)。韓興林等[9]分析了醬香型白酒釀造8 個(gè)輪次堆積酒醅中的原核微生物結(jié)構(gòu),結(jié)果指出其優(yōu)勢原核類微生物細(xì)菌屬主要為不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、魏斯氏菌屬(Weissella)、乳球菌屬(Lactococcus)、高溫放線菌屬(Thermoactinomyces)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、Lactobacillus、片球菌屬(Pediococcus)、嗜麥糖寡養(yǎng)食單胞菌(Stenotrophomonas)、棲水菌屬(Enhydrobacter)、醋酸桿菌屬(Acetobacter)、芽孢桿菌屬(Bacillus)和伯克霍爾德菌屬(Burkholderia)共12 種及未知菌屬Desmospora、Serpens 2 種屬。黃蘊(yùn)利等[10]研究了醬香型白酒第2輪次堆積及窖池發(fā)酵過程酒醅中的微生物,發(fā)現(xiàn)堆積酒醅中優(yōu)勢細(xì)菌有Bacillus、腸球菌屬(Enterococcus)、Lactococcus、Lactobacillus、Lentibacillus、克羅彭斯特菌屬(Kroppenstedtia)、腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、嗜堿菌屬(Alkaliphilus)、海洋桿菌屬(Oceanobacillus)、Thermoactinomyces等10 種;而窖池發(fā)酵酒醅中的最優(yōu)勢細(xì)菌屬類有Lactobacillus、Acetobacter、Bacillus、Lactobacillus和Bacillus。郭敏等[11]運(yùn)用高通量測序技術(shù)對(duì)醬香型白酒3輪次和7輪次窖池發(fā)酵酒醅微生物開展研究,發(fā)現(xiàn)兩個(gè)輪次的微生態(tài)多樣性存在較大的差異性特征,3輪次酒醅中Lactobacillus和Bacillus是絕對(duì)優(yōu)勢細(xì)菌,而7輪次酒醅中則是Halomonas為最優(yōu)勢細(xì)菌。

無論在堆積發(fā)酵還是窖內(nèi)發(fā)酵過程,醬香風(fēng)味都主要來源于多種微生物的共同作用[12],其中細(xì)菌的貢獻(xiàn)尤其重要?；诖?本課題組多年來一直聚焦于醬香型白酒釀造微生物多樣性及其生態(tài)結(jié)構(gòu)的研究,運(yùn)用高通量測序技術(shù)等多組學(xué)策略對(duì)醬香型白酒釀造的全輪次(1～7輪次)微生物菌群結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行系統(tǒng)研究。本研究將1輪次堆積和窖池發(fā)酵過程的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行歸納總結(jié),以期為傳統(tǒng)白酒固態(tài)發(fā)酵機(jī)制及產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

樣品取自貴州XJ公司2車間12班釀造窖池第1輪次的堆積和窖池發(fā)酵酒醅。堆積酒醅樣品從堆積1 d開始取樣,周期為2 d(1輪次釀酒時(shí)節(jié)自然氣溫相對(duì)較低,堆升溫較慢,以2 d間隔取樣)。取樣點(diǎn)如圖1a所示,分別取堆子上層A點(diǎn),中層B、C兩點(diǎn),下層D、E兩點(diǎn),取樣后混勻樣品(B、C兩點(diǎn)混勻?yàn)橐粋€(gè)樣,D、E兩點(diǎn)混勻?yàn)橐粋€(gè)樣),再將上、中、下3 個(gè)樣品混合為1 個(gè)樣品。后期所取樣品如同上法。

圖1 堆積（a）和窖池（b）酒醅取樣點(diǎn)Fig. 1 Sampling points of fermented grains during pile (a) and pit (b) fermentation

窖池發(fā)酵過程從酒醅堆積發(fā)酵結(jié)束入窖開始取樣,記為發(fā)酵0 d(即堆積發(fā)酵最后一天,7 d),以后每隔5 d取樣一次,取至窖池發(fā)酵35 d為止(窖池發(fā)酵共35 d)。窖池取樣點(diǎn)如圖1b所示,同一層面分別取3 個(gè)點(diǎn),將同一層面的3 個(gè)點(diǎn)所取酒醅混勻?yàn)? 個(gè)樣,代表窖池1 個(gè)層面的酒醅樣(即A、B、C三點(diǎn)的取樣混勻后為1 個(gè)樣),同樣將D、E、F三點(diǎn)的取樣混勻?yàn)? 個(gè)樣,G、H、I三點(diǎn)的取樣混勻?yàn)? 個(gè)樣,分別代表窖池上、中、下3 個(gè)層面的酒醅樣。再將上中下3 個(gè)樣品混合為1 個(gè)樣品。研究共采集83 個(gè)發(fā)酵酒醅小樣,最終混合成DJ 1 d、DJ 3 d、DJ 5 d、DJ 7 d(FJ 0 d)、FJ 5 d、FJ 10 d、FJ 15 d、FJ 20 d、FJ 25 d、FJ 30 d、FJ 35 d共11 個(gè)樣品。

1.1.2 試劑

DNA Marker 寶生物工程(大連)有限公司;磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS)、引物合成 生工生物工程(上海)股份有限公司;E.Z.N.A. Soil DNA Kit美國Omega BioTek公司;異丙醇(分析純)、TAE(Tris Acetate-EDTA)緩沖液 北京索萊寶科技有限公司;瓊脂糖 南京生興生物技術(shù)有限公司;Goldview染料上海賽百盛有限公司;rTaqDNA聚合酶試劑盒 北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Zealway G154DW高壓蒸汽滅菌鍋 致徽(廈門)儀器有限公司;臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 德國Sigma公司;GeneAmp?9700型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)儀 美國ABI公司;DYY-8C型電泳儀 北京六一儀器廠;JS-680C凝膠成像儀 上海培清科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預(yù)處理[10]及DNA抽提

分別稱取混合好的每個(gè)樣品各10 g,用15 mL滅菌后的0.1 mol/L PBS懸浮,加入3 顆玻璃珠,旋渦振蕩10 min。300 r/min離心5 min,取上清液,沉淀用PBS重復(fù)洗滌3 次,離心后收集上清液,混勻所收集上清液。將上清液于12 000 r/min離心5 min,棄上清液,收集細(xì)胞沉淀。用5 mL PBS洗3 次沉淀,每次于12 000 r/min離心5 min后去上清液,收集并混勻沉淀。預(yù)處理結(jié)束后,根據(jù)E.Z.N.A. Soil DNA Kit的操作說明提取各樣品中的微生物總DNA。

1.3.2 PCR擴(kuò)增

利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量;用338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)引物對(duì)V3-V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增程序?yàn)?95 ℃預(yù)變性3 min,27 個(gè)循環(huán)(95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s),最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增體系為20 μL,4 μL 5×FastPfu緩沖液,2 μL 2.5 mmol/L dNTPs,0.8 μL引物(5 μmol/L),0.4 μL FastPfu聚合酶;10 ng DNA模板。

1.3.3 Illumina MiSeq測序

使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物,利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit進(jìn)行純化,Tris-HCl洗脫,2%瓊脂糖電泳檢測。利用QuantiFluor?-ST進(jìn)行檢測定量。根據(jù)Illumina MiSeq平臺(tái)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程將純化后的擴(kuò)增片段構(gòu)建PE 2×300文庫。構(gòu)建文庫步驟:1)連接“Y”字形接頭;2)使用磁珠篩選去除接頭的自連片段;3)利用PCR擴(kuò)增進(jìn)行文庫模板的富集;4)氫氧化鈉變性,產(chǎn)生單鏈DNA片段。再利用Illumina公司的MiSeq PE300平臺(tái)進(jìn)行測序。

1.3.4 酒醅理化指標(biāo)的測定[13]

水分的測定:恒溫烘干法;酸度的測定:酸堿中和滴定法;淀粉及還原糖的測定:斐林試劑法。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析及圖像處理

原始測序序列使用Trimmomatic軟件質(zhì)控,使用FLASH軟件進(jìn)行拼接。使用UPARSE軟件,根據(jù)97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行可操作分類單元(operational taxonomic unit,OTU)聚類;使用UCHIME軟件剔除嵌合體。利用RDP classifier(http://rdp.cme.msu.edu/)對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類注釋,比對(duì)silva123/16s_bacteria數(shù)據(jù)庫,設(shè)置比對(duì)閾值為70%。采用Microsoft Office Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算和分析,群落組成圖、Heatmap圖利用R語言進(jìn)行繪制,物種相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖運(yùn)用Cytoscape軟件進(jìn)行繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 α多樣性分析

通過USEARCH將標(biāo)簽分組成具有97%相似性的OTU。計(jì)算Chao指數(shù)和ACE指數(shù)(以確定物種豐富度)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)(以確定物種多樣性)及檢測到的物種數(shù)目,以描述堆積、窖池發(fā)酵酒醅樣品中的細(xì)菌菌群多樣性,其分析測序指數(shù)結(jié)果見表1。

表1 樣本細(xì)菌群落α多樣性指數(shù)Table 1 α Diversity of bacterial samples

97%水平下共得到OTU數(shù)為122,堆積發(fā)酵結(jié)束即窖池發(fā)酵開始時(shí)OTU數(shù)最高,為102。酒醅樣品的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)表明,堆積發(fā)酵酒醅的細(xì)菌多樣性和豐富度明顯高于窖池發(fā)酵酒醅。并且在堆積過程中,隨著堆積時(shí)間的延長,樣品的細(xì)菌多樣性呈現(xiàn)下降趨勢。而在窖池發(fā)酵過程中,窖池發(fā)酵0 d的豐富度指數(shù)和多樣性指數(shù)最高,窖池發(fā)酵開始后,細(xì)菌多樣性和豐富度急劇大幅下降。所有樣品的Coverage指數(shù)均大于0.999,說明各采樣酒醅樣品文庫的覆蓋率足夠大,樣品中的序列基本被全部測出,測序結(jié)果可體現(xiàn)酒醅樣品細(xì)菌群落多樣性的真實(shí)情況。

2.2 細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)多樣性

2.2.1 基于門水平的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)多樣性分析

圖2 酒醅樣品中的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)（門水平）Fig. 2 Bacterial community structure of fermented grain samples at the phylum level

醬香型白酒1輪次堆積和窖池發(fā)酵過程不同樣本序列經(jīng)RDP classifier軟件進(jìn)行分類分析,在門水平上,其各樣本的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成如圖2所示。從醬香型白酒1輪次堆積和窖池發(fā)酵酒醅中共檢測到8 個(gè)門。從堆積發(fā)酵酒醅中檢測到厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、藍(lán)細(xì)菌(Cyanobacteria)、梭桿菌門(Fusobacteria)、異常球菌-棲熱菌門(Deinococcus-Thermus)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)8 個(gè)門;從窖池發(fā)酵酒醅中檢測到除Deinococcus-Thermus外的其他7 個(gè)門,而在入窖池發(fā)酵后5～35 d中共檢出Firmicutes、Proteobacteria、Actinobacteria、Bacteroidetes、Gemmatimonadetes 5 個(gè)門(圖2)。

在門水平,堆積發(fā)酵優(yōu)勢細(xì)菌(平均相對(duì)豐度大于1%)為Firmicutes、Proteobacteria和Actinobacteria,其中Firmicutes和Proteobacteria占主導(dǎo)地位(平均相對(duì)豐度大于10%),平均相對(duì)豐度分別為75.58%和21.53%。窖池發(fā)酵酒醅中優(yōu)勢細(xì)菌為Firmicutes和Proteobacteria,Firmicutes占絕對(duì)主導(dǎo)地位(平均相對(duì)豐度為98.01%);在堆積發(fā)酵結(jié)束即窖池發(fā)酵開始時(shí),Firmicutes、Proteobacteria和Bacteroidetes平均相對(duì)豐度大于1%。窖池發(fā)酵開始后,Proteobacteria的相對(duì)豐度由12.42%(窖池發(fā)酵0 d)急劇下降至0.01%(窖池發(fā)酵5 d)以下,直至窖池發(fā)酵結(jié)束時(shí)相對(duì)豐度也不超過0.06%;Bacteroidetes則從2.91%下降并一直維持在0.01%以下。從窖池發(fā)酵的5～35 d,平均相對(duì)豐度大于1%的菌門僅有Firmicutes。黃蘊(yùn)莉等[10]對(duì)相同車間第2輪次堆積和窖池發(fā)酵酒醅進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)其酒醅樣品中同樣是Firmicutes占絕對(duì)主導(dǎo)地位,相對(duì)豐度均占92%以上,這與王雪山等[14]報(bào)道的白酒發(fā)酵過程中由多菌種演替為單一厚壁菌門為主導(dǎo)的典型發(fā)酵模式相符,不同的是1輪次堆積發(fā)酵過程中Proteobacteria相對(duì)豐度(21.53%)占比顯著高于2輪次(小于1%)。

2.2.2 基于屬水平的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)多樣性分析

圖3 酒醅樣品中的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)（屬水平）Fig. 3 Bacterial community structure of fermented grain samples at the genus level

在屬水平上,從醬香型白酒1輪次堆積和窖池發(fā)酵酒醅中共檢出71 個(gè)屬,圖3為平均相對(duì)豐度至少在一個(gè)酒醅樣品中大于1%的菌群結(jié)構(gòu)。從堆積和窖池發(fā)酵酒醅中分別檢出69 個(gè)和63 個(gè)屬,堆積發(fā)酵結(jié)束即窖池發(fā)酵開始檢出61 個(gè)屬。窖池發(fā)酵0～5 d,有47 個(gè)屬的相對(duì)豐度大幅下降至低于檢出限,Lactobacillus相對(duì)豐度從79.42%上升至99.96%,成為主要菌群,從而也導(dǎo)致發(fā)酵酒醅酸度升高(從0.65 mmol/10 g上升至1.43 mmol/10 g)。上述47 個(gè)菌屬含量大幅下降可能源于發(fā)酵環(huán)境改變或者Lactobacillus對(duì)其生物性抑制所致。窖池發(fā)酵5～35 d,新檢出19 個(gè)屬,其中梭菌屬(Clostridium_sensu_stricto_1)和g__unclassified_f__Peptostreptococcaceae 2 個(gè)屬在堆積發(fā)酵酒醅中未檢出,該兩種菌屬屬于專性厭氧菌[15-16],適宜于厭氧發(fā)酵環(huán)境。氣球菌屬(Aerococcus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、嗜熱桿菌(Thermus)、Xylella及3 個(gè)未分類菌屬則只出現(xiàn)在堆積發(fā)酵中。這8 種菌屬在堆積酒醅樣品中平均相對(duì)豐度和占0.13%。

在屬水平,堆積發(fā)酵優(yōu)勢細(xì)菌屬有13 個(gè),分別為Lactobacillus、Escherichia-Shigella、Bacillus、Lentibacillus、Kroppenstedtia、g__unclassified_f__Enterobacteriaceae、Thermoactinomyces、Pediococcus、Acetobacter、Oceanobacillus、Acinetobacter、Lactococcus和糖多孢菌屬(Saccharopolyspora),其中Lactobacillus、Escherichia-Shigella和Bacillus占主導(dǎo)地位,平均相對(duì)豐度分別為35.93%、12.19%和11.63%。近年有報(bào)道分析了醬香白酒釀造全輪次及第2輪次發(fā)酵酒醅的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)[8-10]。本研究結(jié)論再次證實(shí)了上述研究者的結(jié)果:Lactobacillus、Escherichia-Shigella、Bacillus、Thermoactinomyces、Pediococcus、Acetobacter、Acinetobacter、Lactococcus是醬香白酒第1輪次酒醅堆積發(fā)酵的優(yōu)勢菌屬,同時(shí)本研究還新發(fā)現(xiàn)Lentibacillus、Kroppenstedtia、g__unclassified_f__Enterobacteriaceae、Oceanobacillus、Saccharopolyspora也是醬香型白酒第1輪次酒醅堆積發(fā)酵的優(yōu)勢細(xì)菌屬。醬香型白酒釀造第1輪次和第2輪次發(fā)酵酒醅的優(yōu)勢細(xì)菌屬相比,Lactobacillus、Bacillus、g__unclassified_f__Enterobacteriaceae、Lentibacillus、Kroppenstedtia、Thermoactinomyces、Oceanobacillus、Lactococcus是2 個(gè)輪次堆積發(fā)酵酒醅中共有的優(yōu)勢細(xì)菌屬;而Lactobacillus則在2 個(gè)輪次窖池發(fā)酵酒醅中均占絕對(duì)主導(dǎo)地位。

13 個(gè)優(yōu)勢細(xì)菌屬中,Escherichia-Shigella、Thermoactinomyces、Lentibacillus、g__unclassified_f__Enterobacteriaceae、Pediococcus、Oceanobacillus、Lactococcus和Saccharopolyspora 8 個(gè)屬隨發(fā)酵時(shí)間的延長其豐度總體呈下降趨勢,且在堆積發(fā)酵結(jié)束時(shí)相對(duì)豐度小于1%;Bacillus同樣隨著發(fā)酵時(shí)間延長相對(duì)豐度下降,但在堆積發(fā)酵結(jié)束時(shí)其相對(duì)豐度大于1%。這些優(yōu)勢微生物相對(duì)豐度下降與發(fā)酵過程中營養(yǎng)物質(zhì)消耗(如淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)從DJ 1 d的34.52%下降至DJ 7 d的29.84%)、微生物代謝產(chǎn)物累積導(dǎo)致發(fā)酵環(huán)境改變(如酸度從DJ 1 d的0.61 mmol/10 g上升至DJ 7 d的0.65 mmol/10 g)和微生物之間的相互作用相關(guān)。窖池發(fā)酵酒醅中平均相對(duì)豐度超過1%的菌屬只有Lactobacillus,平均相對(duì)豐度占79.42%,該菌屬在窖池發(fā)酵中也占絕對(duì)主導(dǎo)地位。窖池發(fā)酵開始時(shí)(即堆積發(fā)酵結(jié)束),優(yōu)勢細(xì)菌屬有Lactobacillus、Acinetobacter、叢毛單胞菌屬(Comamonas)、Acetobacter、Kroppenstedtia和Bacillus。窖池發(fā)酵開始后,除Lactobacillus相對(duì)豐度從79.42%急劇上升至99.96%并維持在99.84%～99.96%之間,其余5 個(gè)菌屬相對(duì)豐度均從大于1%急劇下降至0.04%以下,發(fā)酵窖池的菌群結(jié)構(gòu)由多菌種演替為單一的Lactobacillus為主導(dǎo),這與戴奕杰等[8]關(guān)于隨著醬香型白酒發(fā)酵時(shí)間的推移,細(xì)菌群落形成單一菌類為主導(dǎo)環(huán)境的說法相符。Acinetobacter以葡萄糖和其他碳水化合物代謝產(chǎn)酸,為醬香型白酒各輪次堆積酒醅中的優(yōu)勢細(xì)菌菌屬[9]。Acetobacter以乙醇、甘油和乳酸為碳源,能利用正丙醇、正丁醇和D-葡萄糖產(chǎn)酸,但不水解乳糖和淀粉[15],是醬香型大曲[17]和酒醅中常見的微生物[10-11]。Comamonas屬好氧或兼性好氧異養(yǎng)微生物[18-20],革蘭氏陰性桿菌,于1985年由De Vos等[21]發(fā)現(xiàn),具有降解苯酚[22]和木質(zhì)素[23-24]的功能,在白酒釀造中鮮有報(bào)道,2017年由Wang Xueshan等[25]第一次在濃香型白酒中檢出,本研究是第一次在醬香型白酒中發(fā)現(xiàn)。Kroppenstedtia屬于高溫放線菌科(Thermoactinomycetaceae),Thermoactinomycetaceae多數(shù)在高溫下生長[26],是高溫大曲[27]和醬香型白酒堆積酒醅中的優(yōu)勢菌[10]。Bacillus是醬香型白酒生產(chǎn)過程中的主要功能菌[6,28]。菌群檢出結(jié)果表明,窖池發(fā)酵開始后,Lactobacillus含量急劇上升,Acinetobacter、Comamonas、Acetobacter、Kroppenstedtia和Bacillus含量急劇下降。進(jìn)入窖池發(fā)酵,微生物生態(tài)從好氧及兼氧環(huán)境轉(zhuǎn)入?yún)捬醐h(huán)境,大量厭氧微生物開始代謝產(chǎn)酸等,導(dǎo)致發(fā)酵酒醅環(huán)境酸度升高,乳酸菌耐酸性好,其含量隨之上升,占絕對(duì)優(yōu)勢地位,并代謝產(chǎn)生大量乳酸,更致使酒醅環(huán)境pH值顯著降低,進(jìn)而抑制其他微生物的生長,同時(shí)也通過產(chǎn)生的抑菌素(如Nisin、lactacin、pediocin)抑制革蘭氏陽性細(xì)菌的生長繁殖[29]。革蘭氏陽性菌Kroppenstedtia和Bacillus生物量的降低也說明其生態(tài)調(diào)控機(jī)制。Comamonas只在DJ 7 d(FJ 0 d)時(shí)相對(duì)豐度較大(3.26%),在其余樣品中均小于0.01%,關(guān)于此菌,還有待進(jìn)一步研究。

堆積發(fā)酵和窖池發(fā)酵是醬香型白酒釀造過程中兩個(gè)不同的發(fā)酵體系,因發(fā)酵場和物態(tài)、生態(tài)上差異較大,所以兩種發(fā)酵體系中的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)會(huì)存在明顯的差異。又由于堆積發(fā)酵和窖池發(fā)酵是一個(gè)連續(xù)的工藝體系,所以在堆積和窖池整個(gè)發(fā)酵過程有87.5%的細(xì)菌門和85.92%的細(xì)菌屬同時(shí)出現(xiàn)在兩個(gè)階段,這些微生物從堆積發(fā)酵遷移到窖池發(fā)酵。隨發(fā)酵時(shí)間延長,發(fā)酵環(huán)境參數(shù)發(fā)生改變,微生物的分布也發(fā)生了變化,堆積發(fā)酵結(jié)束即窖池發(fā)酵開始是這些共有微生物遷移、發(fā)酵的過渡期。

2.3 相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)分析

為進(jìn)一步研究上述主要微生物之間的相互關(guān)系,選取屬水平總豐度前25的物種,并計(jì)算物種之間的斯皮爾曼等級(jí)相關(guān)系數(shù),對(duì)其進(jìn)行物種之間的相關(guān)性分析,結(jié)果如圖4所示。

圖4 堆積和發(fā)酵酒醅樣品中的細(xì)菌菌群相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖（屬水平）Fig. 4 Correlation network diagram of bacterial communities in fermented grain samples during pile and pit fermentation at the genus level

堆積和窖池發(fā)酵酒醅細(xì)菌菌群之間的相關(guān)性結(jié)果(圖4)表明,多數(shù)微生物菌屬之間呈顯著正相關(guān)調(diào)節(jié)機(jī)制。堆積發(fā)酵中有8 個(gè)菌屬間呈顯著負(fù)相關(guān),54 個(gè)菌屬間呈顯著正相關(guān)。而窖池發(fā)酵中有3 個(gè)菌屬間呈顯著負(fù)相關(guān),85 個(gè)菌屬間呈顯著正相關(guān)。這些相互生物學(xué)關(guān)系構(gòu)成了發(fā)酵過程的基本生物學(xué)調(diào)控機(jī)制,也是發(fā)酵過程發(fā)酵動(dòng)力、風(fēng)味動(dòng)力形成和調(diào)控機(jī)制的基本組成。

高相關(guān)性節(jié)點(diǎn)是指與一定數(shù)量的其他微生物均有相關(guān)性的一類微生物,也稱為Hub節(jié)點(diǎn)[30]。Hubs種類及多少在一定程度上可反映特定環(huán)境中微生物菌群結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。從堆積發(fā)酵酒醅細(xì)菌菌群的相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)(圖4A)中發(fā)現(xiàn)Lactobacillus一個(gè)負(fù)相關(guān)Hub(這里指至少與其他8 個(gè)屬的微生物存在負(fù)相關(guān)性的節(jié)點(diǎn))。Lactobacillus和Enterococcus、Pediococcus、多孢放線菌屬(Actinopolyspora)、Saccharopolyspora、Streptococcus、Lactococcus、g__unclassified_f__Enterobacteriaceae、Staphylococcus之間呈顯著負(fù)相關(guān)性。這8 種菌屬在堆積發(fā)酵過程含量全部呈現(xiàn)下降態(tài)勢,堆積發(fā)酵結(jié)束時(shí),相對(duì)豐度均小于1%。堆積發(fā)酵過程,Lactobacillus含量逐漸上升,從DJ 0 d的7.30%上升到FJ 0 d的79.42%,為堆積發(fā)酵的優(yōu)勢菌屬。Enterococcus、Pediococcus、Actinopolyspora、Lactococcus、Saccharopolyspora、Streptococcus、Staphylococcus、g__unclassified_f__Enterobacteriaceae 8 個(gè)菌屬之間兩兩顯著正相關(guān),是網(wǎng)絡(luò)圖譜中的正相關(guān)Hubs(這里指至少與其他6 個(gè)屬的微生物存在正相關(guān)性節(jié)點(diǎn))。Escherichia-Shigella、g__unclassified_o__Bacillales、Bacillus、Oceanobacillus、Kroppenstedtia、Weissella、Lentibacillus 7 個(gè)菌屬之間,除Escherichia-Shigella和Bacillus相關(guān)性不顯著外,其余全部都兩兩顯著正相關(guān),g__unclassified_o__Bacillales、Oceanobacillus、Kroppenstedtia、Weissella、Lentibacillus也是網(wǎng)絡(luò)圖譜中的正相關(guān)Hubs,這5 種菌屬相對(duì)豐度含量總體呈下降趨勢。

從窖池發(fā)酵酒醅細(xì)菌菌群相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)(圖4 B)中發(fā)現(xiàn)存在1 4 個(gè)正相關(guān)H u b s,分別為Bacteroidetes下的穩(wěn)桿菌屬(Empedobacter)、金黃桿菌屬(Chryseobacterium)、鞘脂桿菌屬(Sphingobacterium)、Myroides、黃桿菌屬(Flavobacterium)、Proteobacteria下的葡糖桿菌屬(Gluconobacter)、Pseudochrobactrum、普羅威登斯菌屬(Providencia)、Comamonas、Stenotrophomonas、Defluviimonas,Firmicutes下的Lentibacillus、Oceanobacillus,Actinobacteria下的Corynebacterium_1。僅有Lactobacillus和Thermoactinomyces、Pediococcus、Pediococcus和g__unclassified_f__Peptostreptococcaceae之間呈顯著負(fù)相關(guān)。

在堆積發(fā)酵過程,Lactobacillus與8 個(gè)正相關(guān)Hubs呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)機(jī)制,而在窖池發(fā)酵過程中,Lactobacillus僅與Thermoactinomyces和Pediococcus顯著負(fù)相關(guān),Thermoactinomyces和Pediococcus節(jié)點(diǎn)連通性都不是很高,說明在堆積發(fā)酵階段Lactobacillus對(duì)其他微生物的抑制作用強(qiáng)于窖池發(fā)酵階段,且Lactobacillus在窖池發(fā)酵過程中含量比堆積發(fā)酵過程多,由此可推斷,窖池發(fā)酵過程中微生物種類較少,以及除Lactobacillus以外的其他微生物含量很低的主要原因并不在于Lactobacillus對(duì)其他微生物的生物學(xué)抑制作用,其真正的內(nèi)在調(diào)節(jié)機(jī)制本課題組正在開展進(jìn)一步的研究論證。

3 結(jié) 論

醬香型白酒1輪次堆積發(fā)酵過程細(xì)菌的多樣性和豐富度明顯高于窖池酒醅,隨著堆積發(fā)酵時(shí)間的延長,細(xì)菌多樣性呈現(xiàn)下降趨勢;隨著窖池發(fā)酵開始,細(xì)菌的多樣性和豐富度呈現(xiàn)急劇大幅下降。在門和屬水平上,堆積發(fā)酵檢出的總細(xì)菌、主要細(xì)菌和優(yōu)勢細(xì)菌種類均比窖池發(fā)酵同比數(shù)據(jù)多。從醬香型白酒1輪次堆積和窖池發(fā)酵過程一共檢出8 個(gè)門,71 個(gè)屬。從堆積發(fā)酵酒醅中檢出8 個(gè)門,69 個(gè)屬;從窖池發(fā)酵酒醅中檢出7 個(gè)門,63 個(gè)屬。堆積發(fā)酵優(yōu)勢細(xì)菌門為Firmicutes、Proteobacteria和Actinobacteria,其中Firmicutes和Proteobacteria占主導(dǎo)地位;優(yōu)勢細(xì)菌屬有Lactobacillus、Escherichia-Shigella、Bacillus、Lentibacillus、Kroppenstedtia、g__unclassified_f__Enterobacteriaceae、Thermoactinomyces、Pediococcus、Acetobacter、Oceanobacillus、Acinetobacter、Lactococcus和Saccharopolyspora 13 個(gè),其中Lactobacillus、Escherichia-Shigella和Bacillus占主導(dǎo)地位。窖池發(fā)酵酒醅中優(yōu)勢細(xì)菌門為Firmicutes和Proteobacteria,Firmicutes占絕對(duì)主導(dǎo)地位。窖池發(fā)酵優(yōu)勢細(xì)菌屬是Lactobacillus,其占絕對(duì)主導(dǎo)地位。

細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)相關(guān)性調(diào)節(jié)機(jī)制上絕大多數(shù)菌屬之間呈顯著正相關(guān)性機(jī)制,這種機(jī)制對(duì)堆積和窖池發(fā)酵過程穩(wěn)定的菌群形成具有重要調(diào)控作用。堆積發(fā)酵過程存在Enterococcus、Pediococcus和Actinopolyspora等13 個(gè)正相關(guān)Hubs,Lactobacillus 1 個(gè)負(fù)相關(guān)Hub;窖池發(fā)酵中存在Empedobacter、Chryseobacterium和鞘脂桿菌屬(Sphingobacterium)等14 個(gè)正相關(guān)Hubs。