不同咀嚼負(fù)荷對(duì)牙周組織炎癥狀態(tài)影響的實(shí)驗(yàn)研究

張博倫　賈如　胡波　裴丹丹　劉潔　韓如浩　逯宜

[摘要]目的：探討牙周炎狀態(tài)下不同咀嚼負(fù)荷對(duì)牙周組織的炎性狀態(tài)的影響。方法：取18只大鼠利用局部注射脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）+高糖飲食喂養(yǎng)方法建立實(shí)驗(yàn)性動(dòng)物牙周炎模型，36d后停止處置并隨機(jī)分為兩組：LPS組與LPS+soft組各9只，分別用正常飼料與定制軟飼料連續(xù)喂養(yǎng)7d，另取3只大鼠作為control組。43d后，采集雙側(cè)上頜第一磨牙腭側(cè)齦溝液與牙齦組織及磨牙區(qū)上頜骨，分別用于ELISA檢測(cè)、提取總RNA、反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行Real-time PCR和用于Micro-CT掃描、三維重建后脫鈣進(jìn)行H&E染色。結(jié)果：相比于control組，LPS+soft組和LPS組腭側(cè)牙槽骨均出現(xiàn)明顯吸收，炎細(xì)胞浸潤(rùn)，破骨細(xì)胞增殖，形成骨吸收陷窩形成，其中LPS組更為明顯。LPS組IL-1β、TNF-α在牙齦組織的表達(dá)與齦溝液含量中分泌水平均高于control組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;牙齦組織中IL-6在LPS組的表達(dá)也顯著高于control組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;另外TNF-α在LPS組中的基因表達(dá)水平較LPS+soft組顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：不同硬度的食物會(huì)導(dǎo)致牙周組織的炎癥反應(yīng)程度出現(xiàn)差異，較軟食物相對(duì)正常食物有減輕其炎性狀態(tài)的作用。

[關(guān)鍵詞]牙周炎;牙列缺損;力學(xué)載荷;脂多糖;炎癥因子

[中圖分類號(hào)]R781.4+2? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號(hào)]1008-6455（2020）08-0023-04

Effects of Inflammation for Periodontitis Tissue on Different Masticatory Loading

ZHANG Bo-lun，JIA Ru，HU Bo，PEI Dan-dan，LIU Jie，HAN Ru-hao，LU Yi

（Department of Prosthodontics，College of Stomatology，Xian Jiaotong University，Key Laboratory of Shaanxi Province for Craniofacial Precision Medicine Research，Xian 710004，Shaanxi，China）

Abstract： Objective? To explore the effect of different mechanical loads on the inflammatory state of periodontitis tissue. Methods? 18 rats were taken to establish an experimental periodontitis model by local injection of LPS （Lipopolysaccharides） + high-sugar feeding method. After 36 days， the injection was stopped and the rats was divided randomly into two groups： the LPS group and the LPS+soft group， there were 9 rats in each group. The two groups were fed respectively with sufficient normal feed and customized soft feed for 7 days. Another 3 rats were taken as control group. After 43 days， the gingival crevicular fluid and the gingival tissue of the palatal side of the maxillary first molars were collected for ELISA detection， total RNA extraction， Real-time PCR after reverse transcription， the maxillary bone of the molar area were collected for H&E staining after Micro-CT scanning and 3D reconstruction. Results? Compared with the control group， the alveolar bone of the LPS+soft group and the LPS group showed obvious resorption， inflammatory cell infiltration， osteoclast proliferation， and Howships lacuna， in particular， the LPS group was more obvious. The expression of IL-1β and TNF-α in gingival tissue and secretion level of gingival crevicular fluid were higher in the LPS group than in the control group， the differences were statistically significant （P<0.05）. The expression of IL-6 in gingival tissue in the LPS group was higher than that in the control group （P<0.05）. In addition， the gene expression level of TNF-α in the LPS group was higher than that in the LPS+soft group （P<0.05）. Conclusion? Different hardness foods will lead to differences in the degree of inflammation of periodontal tissues， the softer foods have a role in reducing their inflammatory status compared to normal diets.

Key words： periodontitis; dentition defect; masticatory loading; lipopolysaccharide; inflammatory factors

牙周炎是口頜系統(tǒng)的常見疾病，為中老年人群牙齒缺失的首要原因[1]。在對(duì)患者進(jìn)行固定或活動(dòng)義齒修復(fù)時(shí)，通常需選擇余留牙作為基牙，咀嚼力經(jīng)由基牙牙齒硬組織傳導(dǎo)到牙周膜和牙槽骨，進(jìn)而引發(fā)牙周組織相應(yīng)的生物化學(xué)反應(yīng)。研究顯示，健康的牙槽骨在受到力學(xué)刺激后會(huì)發(fā)生成/破骨的雙向改變[2]，但對(duì)于炎性牙周組織在不同咀嚼負(fù)荷下的炎性改變?cè)隗w研究尚未見報(bào)道。學(xué)者們常通過(guò)咬合早接觸誘導(dǎo)咬合創(chuàng)傷建立動(dòng)物模型，而該方法會(huì)引起大鼠咬合痛[3-4]，并非生理狀態(tài)下的過(guò)大牙合力狀態(tài)。因此本課題擬利用脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）+高糖飲食構(gòu)建大鼠牙周炎狀態(tài)，并利用不同硬度飼料加載不同大小的咀嚼負(fù)荷，檢測(cè)患牙牙周組織炎癥反應(yīng)狀態(tài)，以探討牙周炎狀態(tài)下不同咀嚼負(fù)荷對(duì)牙周組織的炎性狀態(tài)的影響，從而對(duì)牙周炎患者的修復(fù)設(shè)計(jì)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)與參考。

1? 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及牙周炎受力載荷模型的建立：清潔級(jí)（SPF等級(jí)）、8～10周齡、雄性、SD（Sprague-Dawley）大鼠，21只，體質(zhì)量（200±20）g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

隨機(jī)選取18只大鼠，建立實(shí)驗(yàn)性牙周炎在體模型，10%葡萄糖水喂養(yǎng)，3%異氟烷吸入麻醉下，在雙側(cè)上頜第一磨牙腭側(cè)近中齦溝、根分叉對(duì)應(yīng)黏膜及第一、第二磨牙間齦乳頭3處位點(diǎn)分別使用微量進(jìn)樣器注射3μl（濃度為10μg/μl）LPS，緩慢注射，并停留數(shù)秒，減少試劑流失，隔天注射，共18次。36d后停止注射LPS及10%葡萄糖水喂養(yǎng)，隨后將18只大鼠平均分成兩組，正常硬度飼料喂養(yǎng)組（LPS組）：9只，每日投食足量常規(guī)飼料（西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），自由飲水，連續(xù)喂養(yǎng)7d;軟食喂養(yǎng)組（LPS+soft組）：9只，每日投食足量定制的軟飼料（西安飛揚(yáng)生物科技有限公司），自由飲水，連續(xù)喂養(yǎng)7d。其余3只大鼠作為空白對(duì)照組（control組），同環(huán)境下繼續(xù)飼養(yǎng)不做處理，共43d。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑和儀器：LPS（L-2880，10mg）（Sigma，美國(guó)）;異氟烷（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）;Rat IL-1β、Rat TNF-α的ELISA試劑盒（杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司）;15#吸潮紙尖（天津加發(fā)醫(yī)療器械有限公司）;輕簡(jiǎn)型動(dòng)物麻醉機(jī)（瑞沃德，深圳）;小動(dòng)物活體Micro-CT（PerkinElmer，美國(guó)）。

1.3 標(biāo)本采集：預(yù)備常用試驗(yàn)器械以及15#吸潮紙尖，預(yù)先剪去0.5mm尖端消毒后置于150μl微離心管內(nèi)，3根每瓶，稱重記錄備用。43d后取全部大鼠，3%異氟烷吸入麻醉下，參照文獻(xiàn)記載方法[5-6]，擦干腭側(cè)黏膜，使用紙尖采集大鼠雙側(cè)第一磨牙腭側(cè)齦溝液，每側(cè)取近中、正中和遠(yuǎn)中3個(gè)位點(diǎn)共3支吸潮紙尖，置于150μl微離心管內(nèi)稱重，設(shè)0.15mg：150μl的濃度為1，加入150μl相應(yīng)倍數(shù)的ELISA試劑盒內(nèi)自帶緩沖液稀釋，-80℃保存。隨后繼續(xù)于3%異氟烷吸入麻醉下斷頭處死所有大鼠，取雙側(cè)第一磨牙腭側(cè)牙齦組織，即刻液氮冷凍后置于凍存管內(nèi)，-80℃保存，分離雙側(cè)磨牙區(qū)上頜骨標(biāo)本，送Micro-CT掃描。

1.4 Micro-CT檢測(cè)：將所取得的各組大鼠雙側(cè)磨牙區(qū)上頜骨標(biāo)本使用Micro-CT掃描、三維重建。分別在每個(gè)樣本腭側(cè)中部1mm區(qū)域內(nèi)選擇近中、中央、遠(yuǎn)中3個(gè)位點(diǎn)，間隔0.5mm，在Micro-CT二維圖像的冠狀位剖面進(jìn)行測(cè)量，記錄每個(gè)樣本腭側(cè)牙槽嵴頂?shù)揭Ш掀矫娴木嚯x并取平均數(shù)，以進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（見圖1）。

1.5 組織病理學(xué)觀察：將每個(gè)經(jīng)過(guò)Micro-CT掃描后的標(biāo)本用生理鹽水清洗后分置于4%多聚甲醛中固定24h，參照EDTA脫鈣液說(shuō)明書，0.2mol/L磷酸緩沖液中充分漂洗，漂洗后投入10%成品脫鈣液脫鈣約1個(gè)月，至大頭針能刺入骨密質(zhì)為止，經(jīng)脫水后行石蠟包埋，選取相近位置分別做3～5μm近遠(yuǎn)中向切片。隨機(jī)在LPS組、LPS+soft組中各選取4個(gè)樣本的切片，另在control組中隨機(jī)選擇2個(gè)標(biāo)本的切片，進(jìn)行H&E染色，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.6 分子生物學(xué)相關(guān)檢測(cè)：總RNA的提取及Real-time PCR反應(yīng)：自-80℃冰箱中取出牙齦組織，放入液氮預(yù)冷的研缽中加入1ml的Trizol，充分勻漿后，按試劑盒說(shuō)明提取總RNA及合成cDNA模板。對(duì)從RNA中獲得的cDNA進(jìn)行qPCR，檢測(cè)各組樣本中白細(xì)胞介素（Interleukin，IL）1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）及單核細(xì)胞趨化蛋白（Monocyte chemoattractant protein，MCP）1的mRNA表達(dá)。以β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）為內(nèi)參，對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。各基因引物見表1。

IL-1β、TNF-α的ELISA檢測(cè)：實(shí)驗(yàn)前從-80℃冰箱內(nèi)取出微離心管恢復(fù)至室溫，輕柔渦旋振蕩洗脫1h，1 500r/min，4℃離心15min，提取100μl上清液備用。參考Rat IL-1β、Rat TNF-α Elisa試劑盒的說(shuō)明書，將空白對(duì)照孔調(diào)零，使用酶標(biāo)儀進(jìn)行雙波長(zhǎng)檢測(cè)，測(cè)定450nm最大吸收波長(zhǎng)和570nm參考波長(zhǎng)下的OD值。進(jìn)行回歸分析確定最佳擬合曲線，通過(guò)樣本OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上找到樣本對(duì)應(yīng)濃度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：用SPSS 26.0軟件（IBM，美國(guó)）對(duì)所得計(jì)量資料進(jìn)行分析，計(jì)量資料均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示（精確至小數(shù)點(diǎn)后四位），多組間比較采用單因素方差分析，不符合正態(tài)分布或方差不齊的數(shù)據(jù)采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)之間的多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2? 結(jié)果

2.1 牙槽骨吸收情況：Micro-CT掃描后進(jìn)行三維重建，結(jié)果如圖2所示。可以看出與control組相比，LPS組與LPS+soft組均有明顯弧形牙槽骨吸收，遠(yuǎn)中根處尤為明顯，近中根處牙周膜間隙增寬;相比于LPS+soft組，LPS組則吸收更為明顯，且牙根與牙槽骨表面顯得較為粗糙。

測(cè)量結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)：三組牙槽骨吸收高度比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。兩兩比較后得出：control組與LPS組牙槽骨吸收高度比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.0001），control組與LPS+soft組牙槽骨吸收高度比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），LPS組與LPS+soft組牙槽骨吸收高度比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見圖3。

2.2 組織病理學(xué)觀察結(jié)果：H&E染色結(jié)果顯示：與control組相比，LPS組和LPS+soft組均有一定程度的炎細(xì)胞浸潤(rùn)，破骨細(xì)胞增殖，骨吸收陷窩形成，牙槽骨表面凹凸不平;LPS+soft組相比于LPS組炎性細(xì)胞數(shù)量減少，牙槽骨表面平整度較好。見圖4。

注：A.control組;B.LPS組;C.LPS+soft組。黑色箭頭指示破骨細(xì)胞及骨吸收陷窩;紅色箭頭指示炎細(xì)胞浸潤(rùn)區(qū)域

2.3 Real-time PCR結(jié)果：Real-time PCR結(jié)果顯示：炎性相關(guān)因子IL-1β、IL-6與TNF-α的表達(dá)三組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（IL-1β：P=0.0014<0.01;IL-6：P=0.0076<0.01;TNF-α：P=0.0016<0.01，n=6～8）;且control組與LPS組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（IL-1β：P=0.0046<0.01;IL-6：P=0.0068<0.01;TNF-α：P=0.0033<0.01，n=6～8）;LPS組和LPS+soft組間TNF-α水平比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.0283<0.05，n=6～8）;而MCP-1三組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.2258>0.05，n=6～8）;所有因子在control組與LPS+soft組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖5。

注：A.IL-1β;B.IL-6;C.TNF-α;D.MCP-1。與control組比較，**P<0.01，n=6～8;LPS組與LPS+soft組比較，#P<0.05，n=6～8

2.4 IL-1β、TNF-α的ELISA檢驗(yàn)結(jié)果：ELISA結(jié)果如圖6所示：IL-1β和TNF-α在LPS組中的濃度均顯著高于control組（IL-1β：P=0.0412<0.05;TNF-α：P=0.0364<0.05，n≥3）;而IL-1β和TNF-α在LPS+soft組中濃度與LPS組相比有降低趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

注：A.IL-1β;B.TNF-α。與control組比較，*P<0.05，n≥3

3? 討論

牙周炎與牙列缺損是中老年人常見的口腔疾病[7]，且常常并存，對(duì)于修復(fù)醫(yī)生來(lái)說(shuō)如何利用患有牙周炎的余留牙作為基牙進(jìn)行修復(fù)是個(gè)難題。牙周病患牙若承擔(dān)過(guò)大的咬合力，則會(huì)加重牙周病，這個(gè)過(guò)程中牙周組織具體發(fā)生了怎樣的變化，機(jī)制是什么，是口腔研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。

成功建立一個(gè)牙周炎在體模型是本實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)。文獻(xiàn)表明，LPS是公認(rèn)的牙周炎相關(guān)因素[8-9]，使用一定濃度的LPS在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物牙周膜進(jìn)行局部注射便能形成牙周炎[10-11]，且研究表明，45d后牙周炎表現(xiàn)仍然明顯存在[12]。另外，學(xué)者們還常將實(shí)驗(yàn)鼠飲用水換成10%葡萄糖溶液作為輔助刺激因素誘導(dǎo)建模[13-14]，該方法操作簡(jiǎn)單、無(wú)創(chuàng)。本次實(shí)驗(yàn)中通過(guò)LPS的局部注射輔以高糖飲水來(lái)進(jìn)行牙周炎模型的建立，以期更有效地獲取理想結(jié)果。眾所周知，異常的咬合接觸常常會(huì)迅速造成不適感，也是牙周病的促進(jìn)因素之一，但并非是決定性的致病因素，Weston等[15]的Meta分析并沒(méi)有找到足夠證據(jù)支持或反對(duì)咬合調(diào)整有利于牙周治療的觀點(diǎn)。有綜述中提到食物的性狀會(huì)引起咀嚼肌活動(dòng)的改變[16]，潘云潔[17]等實(shí)驗(yàn)證明了食物硬度與咬合力存在相關(guān)性，也有研究表明過(guò)大機(jī)械應(yīng)力作用下第4天起大鼠就會(huì)發(fā)生牙槽骨的改變，7d后趨化因子CCL2達(dá)到高表達(dá)水平，因此基于這些研究成果，設(shè)計(jì)改變食物硬度對(duì)牙周炎在體模型增加力學(xué)因素，并用7d作為加力時(shí)間[18-19]，以完成動(dòng)物模型的建立。

本實(shí)驗(yàn)中，建模后通過(guò)Micro-CT掃描后三維重建的結(jié)果直觀的看到，經(jīng)過(guò)7d正常硬度飼料喂養(yǎng)的大鼠，對(duì)比軟飼料喂養(yǎng)的大鼠，其牙槽骨表面更加粗糙。經(jīng)二維成像數(shù)據(jù)定量分析，與空白組對(duì)比無(wú)論軟飼料還是正常硬度飼料喂養(yǎng)組，牙槽骨的吸收量都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分析牙周炎患牙在受力較輕的狀態(tài)下，牙槽骨吸收速率會(huì)有所下降，成/破骨狀態(tài)會(huì)達(dá)到一個(gè)新的平衡，但想要通過(guò)較小的牙合力刺激，來(lái)達(dá)到促進(jìn)成骨的目的，還需要進(jìn)一步的研究證實(shí)。通過(guò)H&E染色，觀察到三組中破骨細(xì)胞增殖、炎細(xì)胞浸潤(rùn)及骨吸收陷窩形成具有差異，也印證了三維重建的結(jié)果。

對(duì)取自實(shí)驗(yàn)大鼠的牙齦組織樣本中的炎性相關(guān)標(biāo)志基因做出mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)。結(jié)果顯示相比于空白對(duì)照組而言，在正常硬度飼料喂養(yǎng)組中IL-1β、IL-6及TNF-α的表達(dá)水平均顯著升高。兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間對(duì)比，軟飼料喂養(yǎng)組低于正常硬度飼料喂養(yǎng)組表達(dá)水平的趨勢(shì)。推測(cè)停止LPS注射后，出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因可能有以下3種：軟飼料喂養(yǎng)組炎癥存在但已停止進(jìn)展，而正常硬度飼料喂養(yǎng)組繼續(xù)加重;軟飼料喂養(yǎng)組炎癥繼續(xù)加重但速率減慢，而正常硬度飼料喂養(yǎng)組則繼續(xù)急劇加重;軟飼料喂養(yǎng)組炎癥出現(xiàn)消退，而正常硬度飼料喂養(yǎng)組仍未出現(xiàn)改善。這樣看來(lái)，通過(guò)改變食物硬度減輕牙周炎患牙咀嚼負(fù)擔(dān)，對(duì)于控制炎癥而言，不失為一種有效措施。

此外，還嘗試通過(guò)采集齦溝液，使用ELISA檢驗(yàn)對(duì)比齦溝液中IL-1β與TNF-α濃度的差異，來(lái)觀察牙周組織的炎性分泌水平的改變。結(jié)果顯示兩種蛋白在正常硬度飼料喂養(yǎng)組中的濃度均顯著高于空白對(duì)照組，符合結(jié)論。而軟飼料喂養(yǎng)組雖有低于正常硬度飼料喂養(yǎng)組的趨勢(shì)，但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其原因可能與齦溝液樣本量較少，檢測(cè)靈敏度等原因有關(guān)。

綜上所述，硬性食物會(huì)導(dǎo)致炎性牙周組織的炎癥反應(yīng)程度出現(xiàn)差異;較軟食物相對(duì)正常食物而言有減輕牙周炎性狀態(tài)的作用。這提示在臨床修復(fù)工作中，不但應(yīng)積極治療基牙的炎癥狀態(tài)、盡量減輕牙周炎患牙的咀嚼負(fù)荷，還應(yīng)建議患者在日常飲食中食用軟質(zhì)食物，以改善基牙的炎性狀態(tài)，延長(zhǎng)余留牙與修復(fù)體的使用壽命。

本實(shí)驗(yàn)雖得出了一些有意義的結(jié)果，但仍存在一些不足，如因?yàn)閯?dòng)物倫理審查的原因?qū)е聦?shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量不夠充足，為增加處理組動(dòng)物數(shù)量，盡量減少實(shí)驗(yàn)誤差而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中正常對(duì)照組動(dòng)物數(shù)量較少，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將盡可能增加樣本量，同時(shí)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，進(jìn)一步提高研究可信度。

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[收稿日期]2020-05-28

本文引用格式：張博倫，賈如，胡波，等.不同咀嚼負(fù)荷對(duì)牙周組織炎癥狀態(tài)影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2020，29（8）：23-27.