基于電子鼻與GC-MS技術(shù)研究薩茲酒花葡萄酒揮發(fā)性風(fēng)味成分

段麗麗，楊曉儀，戢得蓉，唐菊蓮

（四川旅游學(xué)院 食品學(xué)院，四川 成都610100）

薩茲酒花具有持久優(yōu)雅、略帶草藥的清香，經(jīng)常作為香花隨鍋熬煮[1]，在啤酒釀造中賦予啤酒特殊的清香和爽口的苦味，大大提高了啤酒的可飲性，啤酒區(qū)別于其他飲料的關(guān)鍵也正是添加了酒花。酒花香氣成分復(fù)雜，萜類化合物和醇類化合物對酒花的香氣貢獻(xiàn)顯著，但因其香氣物質(zhì)的閾值和存在條件差別很大，其貢獻(xiàn)程度也存在顯著差異[2]。目前酒花的應(yīng)用主要是在啤酒[3]、面包[4]、飲料[5]和口香糖[6]等方面，對于其在葡萄酒中的研究尚未見報道。

電子鼻和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術(shù)可在較短時間內(nèi)完成多組分混合物的定性和定量分析，結(jié)果受主觀因素影響小，在葡萄酒[7]、茶葉[8]和肉類[9]等食品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)研究中有著廣泛的應(yīng)用。如陳明等[10]使用頂空-固相微萃取（headspacesolid phase microextraction，HS-SPME）對樣品香氣化合物進(jìn)行萃取，然后用GC-MS對比分析了蛇龍珠葡萄酒在發(fā)酵前后的香氣化合物變化。劉琨毅等[11]采用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對川南地區(qū)的不同品種葡萄的柑橘-葡萄酒香氣化合物進(jìn)行了檢測，通過比較分析篩選出了夏黑葡萄最適于柑橘-葡萄酒的釀造。但GC-MS不能分析這些物質(zhì)作為一個整體時對樣品風(fēng)味的貢獻(xiàn)，而電子鼻是模擬人的嗅覺系統(tǒng)，將化學(xué)信號轉(zhuǎn)換為電信號，形成傳感器陣列對氣味的響應(yīng)譜，能夠?qū)φw風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行區(qū)分[12]，同時彌補(bǔ)感官評價中人為因素影響和識別精度低的缺點[13]。

本研究將薩茲酒花與葡萄酒釀造相結(jié)合，將酒花特有香味融入葡萄酒中，應(yīng)用電子鼻和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)探究薩茲酒花對葡萄酒香氣成分的影響，并通過主成分分析（principal component analysis，PCA）法對結(jié)果進(jìn)行分析，建立薩茲酒花葡萄酒香氣品質(zhì)的評價模型，篩選出薩茲酒花添加的適宜濃度，以豐富葡萄酒香氣，同時為研究新型葡萄酒、擴(kuò)大酒花的應(yīng)用提供新思路，以及為新型酒花葡萄酒整體品質(zhì)評價提供一定參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酒花（薩茲）：河南省帕洛丁貿(mào)易有限公司；玫瑰香葡萄：成都金滿堂農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司；殼聚糖（粒度120目）：深圳天揚(yáng)生物科技有限公司；葡萄酒-果酒專用酵母RW：安琪酵母股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FOX 4000型電子鼻：法國Alpha MOS公司；SQ680氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Perkin Elmer公司；PC-420D專用磁力加熱攪拌裝置；FALLC4N電子天平：常州市衡正電子儀器有限公司；WK2102電磁爐：美的集團(tuán)有限公司；MY-50粉碎機(jī)：廣州市揚(yáng)鷹醫(yī)療器械有限公司；HHS-8S電子恒溫不銹鋼水浴鍋：上海廣地儀器設(shè)備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 薩茲酒花葡萄酒釀造工藝及操作要點

操作要點：選取新鮮、無腐爛、無病蟲害且成熟度好的玫瑰香葡萄樣品，清洗干凈，去皮取果肉，酒花采取4個添加量，分別為0、0.5 g/L、0.8 g/L、1.0 g/L，分別編號為C00、E01、E02、E03，按工藝流程進(jìn)行薩茲酒花葡萄酒釀造[14]。將果肉和果肉質(zhì)量20%的酒花溶液一起放入發(fā)酵瓶中，接入1.0%活化后的酵母溶液，置于20～25 ℃發(fā)酵，當(dāng)皮渣下沉、整罐酒體渾濁和酒液基本沒有甜味時發(fā)酵結(jié)束。添加糖以調(diào)整酒樣總糖度至22°Bx。主發(fā)酵結(jié)束后，過濾除雜，再在15 ℃條件下進(jìn)行二次發(fā)酵（120 h）。待后發(fā)酵結(jié)束后，（2±2）℃低溫保藏168 h左右。在溫度為15 ℃的條件下，向酒樣中加入0.05%的殼聚糖進(jìn)行澄清（10 h）。將澄清過濾后的酒液移入新的發(fā)酵容器在5 ℃條件下進(jìn)行陳釀，后置于陰涼通風(fēng)環(huán)境下進(jìn)行保藏，即得薩茲酒花葡萄酒。

1.3.2 電子鼻測試條件

取樣品5 mL置于10 mL頂空瓶中，靜置10 min以保證樣品香氣足夠揮發(fā)并達(dá)到平衡狀態(tài)。用注射器吸取1 000 μL注入電子鼻檢測器。電子鼻手動進(jìn)樣，進(jìn)樣速度0.7 L/min，數(shù)據(jù)采集時間120 s，數(shù)據(jù)采集延遲240 s，每個樣品平行測試3次，取傳感器在第120 秒時獲得的穩(wěn)定信號進(jìn)行分析。

1.3.3 GC-MS分析

萃取條件：準(zhǔn)確吸取4 mL不同酒花含量葡萄酒的酒樣，置于15 mL固相微萃取樣品瓶中，加入0.5 g NaCl以促進(jìn)香氣成分揮發(fā)，加蓋密封，于40 ℃水浴中平衡10 min，將已活化的萃取頭插入樣品瓶上，萃取吸附40 min后拔出。當(dāng)樣品萃取平衡后，縮回纖維頭，吸附后的萃取針頭迅速插入氣相色譜進(jìn)樣口，推出纖維頭于230 ℃解吸5 min，GC-MS分析。

GC條件：進(jìn)樣口溫度230℃；色譜柱為DB-Wax（30 mm×0.25 mm×0.25 μm）；升溫程序為初始溫度40 ℃，保持5 min，以6 ℃/min升至230 ℃，保持6 min；載氣（高純氦氣），流速0.97 mL/min，不分流。

MS條件：電子電離（electronic ionization，EI）源，電子能量為70 eV，燈絲流量為0.20 mA，離子源溫度為230 ℃，接口溫度為250 ℃，質(zhì)量掃描范圍30.00～500.00 m/z。

定性定量分析：將未知化合物經(jīng)過計算機(jī)與美國國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）質(zhì)譜庫和Wiley質(zhì)譜庫檢索定性，結(jié)合解析譜庫，確定香氣物質(zhì)，數(shù)據(jù)平行測定3次，按峰面積歸一化法[15-16]計算各組分的相對含量。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2010統(tǒng)計處理并繪圖，利用SPSS 19.0軟件進(jìn)行主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 電子鼻對薩茲酒花葡萄酒揮發(fā)性成分的檢測

2.1.1 主成分分析

不同濃度薩茲酒花葡萄酒對電子鼻響應(yīng)值的PCA 結(jié)果見圖1。由圖1可知，將3種濃度的薩茲酒花葡萄酒對18個傳感器的電子鼻響應(yīng)值進(jìn)行降維處理后，得到兩個主成分，其中，第1主成分（PC1）的方差貢獻(xiàn)率為72.00%，第2主成分（PC2）的方差貢獻(xiàn)率為27.18%，二者累計方差貢獻(xiàn)率達(dá)到99.18%，足以代表樣品的絕大部分信息[17-19]。由圖1可知，空白組（C00）分布在坐標(biāo)軸的第四象限，且和實驗組（E01、E02、E03）樣品對電子鼻傳感器感應(yīng)值距離最大，說明添加了薩茲酒花的葡萄酒與未添加的在風(fēng)味上有很大差異。E01、E02、E03三種酒樣分布在圖1中不同位置，說明不同濃度的薩茲酒花葡萄酒在香氣上存在差異，這種差異由18個傳感器共同決定。E02、E03酒樣有交叉，說明這兩個濃度下的薩茲酒花葡萄酒風(fēng)味存在相似性。

圖1 不同濃度薩茲酒花葡萄酒電子鼻主成分分析結(jié)果Fig. 1 Principal component analysis results of wines with different concentration of Saaz-hops based on electronic nose

2.2.2 載荷分析

載荷值是各成分與各個變量（傳感器）的相關(guān)系數(shù)[20]，電子鼻不同傳感器響應(yīng)值載荷分析結(jié)果見圖2。

圖2 電子鼻不同傳感器響應(yīng)值載荷分析Fig. 2 Loading analysis of response value of different electronic nose sensors

由圖2可知，TA/2傳感器在第一主成分上有較大的載荷值（＞0.99），其他傳感器在第一主成分上的載荷值相對較小，說明TA/2傳感器對第一主成分的貢獻(xiàn)率較大，且呈正相關(guān)。在圖1中，沿第一主成分軸，樣品C00到E03的位置隨著薩茲酒花濃度的增加自右向左排列，TA/2傳感器（對乙醇等有機(jī)化合物敏感）的響應(yīng)值可能也隨之降低。第二主成分上P10/1傳感器的載荷值較大（＞0.99），與第二主成分呈正相關(guān)。

2.2 GC-MS對薩茲酒花葡萄酒揮發(fā)性成分分析

通過GC-MS對不同酒花質(zhì)量濃度葡萄酒酒樣揮發(fā)性成分進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和分析，得到總離子流色譜圖見圖3。經(jīng)NIST數(shù)據(jù)庫檢索和保留指數(shù)計算揮發(fā)性成分相對含量結(jié)果見表1。

圖3 各酒樣揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)GC-MS總離子流色譜圖Fig. 3 Total ion chromatogram of volatile flavor substances in wines analyzed by GC-MS

表1 不同濃度薩茲酒花葡萄酒揮發(fā)性成分GC-MS分析結(jié)果Table 1 Analysis results of volatile components in wines with different concentration of Saaz-hops by GC-MS

由圖3可知，添加了酒花的薩茲酒花葡萄酒酒樣與空白酒樣可以明顯區(qū)分。由表1可知，4種不同濃度的薩茲酒花葡萄酒的揮發(fā)性成分物質(zhì)共鑒定出24種，其中酯類12種、醇類7種、酮類1種、其他類4種。在酒樣C00中共檢測出16種揮發(fā)性物質(zhì)，包括6種酯（5.56%）、7種醇（57.28%）、1種酮（2.88%）、2種其他類（2.36%）；酒樣E01共檢測出14種揮發(fā)性物質(zhì)，包括7種酯（8.47%）、6種醇（62.80%）、1種其他類（0.17%）；酒樣E02共檢測出17種揮發(fā)性物質(zhì)，包括7種酯（5.83%）、7種醇（39.00%）、1種酮（0.52%）、2種其他類（0.11%）；E03共檢測出18種揮發(fā)性物質(zhì)，包括9種酯（10.31%）、7種醇（57.66%）、1種酮（0.73%）、1種其他類（0.20%）。對比空白組，薩茲酒花的加入提高了葡萄酒中醇類和酯類的百分含量。薩茲酒花葡萄酒的揮發(fā)性成分物質(zhì)以醇類為主，其次是酯類和酮類等。與空白組相比，添加了薩茲酒花的葡萄酒中特有揮發(fā)性物質(zhì)有乙酸戊酯、丙酸正丙酯、丙酸丁酯、丁酸甲酯、2-甲基丙酸丁酯、醋酸乙烯酯、丙烯醛、（E）-β-金合歡烯。

不同濃度的薩茲酒花葡萄酒的揮發(fā)性香氣成分在種類和含量上有一定的差異，但也存在相似的香氣物質(zhì)，包括乙酸異戊酯、丁二酸二乙酯、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯、1-戊醇、正己醇、芳樟醇、苯乙醇、α-松油醇、香茅醇等，其中有具有香蕉氣味的乙酸異戊酯、水果香的丁二酸二乙酯、舒適花香的乙酸苯乙酯、花果香的芳樟醇、玫瑰和花粉香的苯乙醇、樟腦味和辛辣味的α-松油醇、玫瑰香氣的香茅醇，由此可知，薩茲酒花葡萄酒香氣以花果香為主。由于芳樟醇、α-松油醇、香茅醇是酒花特征香味化合物中的萜醇類物質(zhì)及其衍生物，能賦予啤酒非常濃郁的酒花香氣，且芳樟醇數(shù)年來一直被認(rèn)為是酒花香氣中的“標(biāo)志性化合物”[21]。在添加了酒花的樣品中這三種化合物含量有明顯提升，說明酒花特有香味在葡萄酒中得到了保留，以E01酒樣最為明顯，此濃度下酒花香味能更好的融入到葡萄酒中。

2.3 薩茲酒花葡萄酒揮發(fā)性成分相對含量對比

圖4 不同濃度薩茲酒花葡萄酒各類揮發(fā)性物質(zhì)相對含量比較Fig. 4 Comparison of relative content of volatile substances in wines with different concentration of Saaz-hops

由圖4可知，薩茲酒花葡萄酒香氣成分中1-戊醇、芳樟醇等醇類物質(zhì)含量接近55%，說明醇類物質(zhì)是薩茲酒花葡萄酒主要香氣成分，其主要源于發(fā)酵、氨基酸的轉(zhuǎn)化及亞麻酸降解物的氧化[22-23]；而酯類物質(zhì)含量雖小，但閾值低，同樣屬于薩茲酒花葡萄酒中的特征香氣，主要是在葡萄酒釀造過程中酯化反應(yīng)生成[24]，其中含量較高的酯類主要有：辛酸乙酯、乙酸異戊酯、丁二酸二乙酯等，4種酒樣的酯類物質(zhì)種類和含量存在著一定的差異，空白組C00中酯類物質(zhì)含量較低，添加酒花的酒樣的總酯類含量相對較高，可能是薩茲酒花的添加對葡萄酒中酯類物質(zhì)的產(chǎn)生過程有促進(jìn)作用。

2.4 香氣成分建模驗證分析

參照沈靜等[25]的主成分建模方法對薩茲酒花葡萄酒香氣品質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步驗證分析。將所有檢測到的氣體分為醇類（X1）、醚類（X2）、酯類（X3）、醛類（X4）、酮類（X5）、萜烯類（X6）6種香氣類型。對這6種揮發(fā)性成分進(jìn)行主成分分析，各酒樣中的6類揮發(fā)性成分的特征值及方差貢獻(xiàn)率見表2，主成分因子載荷矩陣見表3，標(biāo)準(zhǔn)化后主成分綜合得分見表4。

表2 主成分的特征值及貢獻(xiàn)率Table 2 Eigenvalues and contribution rates of principal components

由表2可知，前三個主成分的累計方差貢獻(xiàn)率達(dá)100%，可以有效解釋所有變量的原有信息，故選用這3個主成分作為香氣數(shù)據(jù)分析的有效成分。第一主成分的方差貢獻(xiàn)率為55.5%，主要反應(yīng)酯類、萜烯類和醇類的變異信息；第二主成分的方差貢獻(xiàn)率占總變異信息的40.51%，主要反應(yīng)醚類和酮類的變異信息。

表3 主成分因子荷載矩陣Table 3 Load matrix of principal components factors

由表3可知，前3個主成分可以解釋不同酒樣香氣中100%的變異信息，根據(jù)3個主成分的特征向量，可以用F1、F2、F3這三個新的綜合指標(biāo)代替原來6種香氣成分，進(jìn)行香氣品質(zhì)綜合評價，得到香氣化合物的線性關(guān)系式：

式中：F1、F2、F3分別代表綜合主成分值

用F1、F2、F3的方差貢獻(xiàn)率作為權(quán)重數(shù)計算主成分因子的權(quán)重，計算公式如下：

計算得到主成分因子1、2、3的權(quán)重為0.555、0.405、0.040。得到綜合評價函數(shù)F的表達(dá)式為：F=0.555F1+0.405F2+0.040F3。

表4 標(biāo)準(zhǔn)化后主成分綜合得分Table 4 Synthetic scores of principal components after standardization

由表4可知，第一主成分得分最高的是E01處理的葡萄酒，其次是E03處理的葡萄酒，第二主成分得分最高的為C00空白樣品，第三主成分得分最高的是E02處理的葡萄酒。綜合評價得分中E01的酒花葡萄酒得分最高，其次為E03、C00、E02。結(jié)果表明，一定濃度的酒花能使葡萄酒產(chǎn)生更好的香氣品質(zhì)，但酒花濃度大小的影響并不呈現(xiàn)出規(guī)律性。

3 結(jié)論

通過對不同酒樣進(jìn)行電子鼻檢測，結(jié)果表明電子鼻對不同濃度酒花葡萄酒的樣品香氣差異可以進(jìn)行有效區(qū)分和識別，添加了薩茲酒花的酒樣在電子鼻PCA分析上明顯與空白樣品分布不同，說明添加了酒花的葡萄酒產(chǎn)生了不同于空白樣品的風(fēng)味。此外，酒樣間的差異可能是由于TA/2和P10/1傳感器的響應(yīng)值不同引起。GC-MS的定量分析結(jié)果表明，4個酒樣中檢測出24種香氣成分，薩茲酒花的加入整體提高了葡萄酒中酯類和醇類的百分含量，促進(jìn)了酯類物質(zhì)的合成，新增加酯類物質(zhì)有乙酸戊酯、丙酸正丙酯、丙酸丁酯、丁酸甲酯、2-甲基丙酸丁酯、醋酸乙烯酯。萜醇類物質(zhì)是啤酒酒花香氣最重要提供者，添加了酒花的酒樣中萜醇類物質(zhì)的百分含量增加明顯，說明酒花原有香氣特點在葡萄酒中得以保留，不同濃度的酒花葡萄酒酒樣保留程度存在差異。通過主成分及建模驗證分析，E01處理（添加0.5 g/L薩茲酒花）樣品的香氣成分質(zhì)量評價最高，進(jìn)一步驗證在E01處理薩茲酒花對葡萄酒的風(fēng)味起到了一定的積極作用。該結(jié)果為后期進(jìn)一步剖析酒花葡萄酒的骨架香氣體系奠定了基礎(chǔ)，同時也為釀造優(yōu)質(zhì)酒花葡萄酒的濃度選擇提供了一些參考依據(jù)。