應(yīng)用二乙酰一肟分光光度法 準(zhǔn)確測(cè)定牛乳中尿素的含量

龐雨樵 王域潔 張國(guó)彤 王懷斌 沈曉麗

正常牛奶中的尿素含量約200-300mg/L，近年來(lái)，一些不法商家為了提高利潤(rùn)空間，在牛乳中加入尿素虛高蛋白質(zhì)含量，而高濃度尿素會(huì)造成泌尿系統(tǒng)排泄障礙，導(dǎo)致身體電解質(zhì)失衡，對(duì)人體造成損害。因此，測(cè)定牛乳中尿素的含量十分重要。

目前，尿素含量的檢測(cè)方法主要有二乙酰一肟比色法、流動(dòng)注射分析儀法、電化學(xué)發(fā)光法、液相色譜法等，對(duì)牛乳中尿素的定量檢測(cè)方法較少。筆者通過(guò)參考和借鑒游泳池水中尿素含量的測(cè)定及牛乳前處理的方法，對(duì)牛乳中尿素含量的測(cè)定進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)和探索論證，根據(jù)二乙酰一肟與尿素的反應(yīng)原理，對(duì)影響尿素顯色反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)條件做了選擇研究，最后對(duì)該方法的精密性、回收率及檢測(cè)限進(jìn)一步驗(yàn)證，最終確定該方法可應(yīng)用于牛乳中尿素含量的檢測(cè)。

一、材料與儀器

1.實(shí)驗(yàn)原料。實(shí)驗(yàn)用乳購(gòu)于超市中不同品牌的袋裝奶及農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)銷售的散裝奶。

2.主要儀器。SP-756P紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司），普利賽斯ES225SM-DR分析天平（瑞士普利賽斯公司）。

3.試劑。（1）尿素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（99.8%）：準(zhǔn)確稱取尿素純品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)100mg，溶于0.05mol/L硫酸中，輕輕振搖，使尿素完全溶解，并于100mL容量瓶中定容至刻度，使最終濃度為1000mg/L，混勻后將其轉(zhuǎn)入棕色瓶中，于-4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。?）尿素標(biāo)準(zhǔn)使用液：吸取10.0mL的尿素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液并用純水稀釋至100mL，使其濃度為100mg/L。（3）二乙酰一肟溶液（0.5%）：稱取5.0g二乙酰一肟并溶于水中，用容量瓶定容至1000mL。（4）三氯化鐵-氨基硫脲-硫酸混合試劑：將200mL的濃硫酸緩緩加入800mL水中，冷卻后加入0.1g三氯化鐵和1.0g氨基硫脲，用純水定容至1000mL。（5）亞鐵氰化鉀溶液（10.6%）：稱取10.6g亞鐵氰化鉀，加水溶解定容至100mL。（6）乙酸鋅溶液（22.0%）：稱取乙酸鋅22.0g，加水溶解并加入5.0mL冰乙酸，定容至100mL。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.實(shí)驗(yàn)原理。二乙酰一肟在酸性條件下水解轉(zhuǎn)化為雙乙酰，與尿素在強(qiáng)酸條件下縮合成為紅色的二嗪化合物。該化合物顏色的深淺與尿素含量成正比，在波長(zhǎng)525nm處有最大吸收峰。

2.測(cè)定方法。取混勻樣品10.0mL于100mL容量瓶中，加入亞鐵氰化鉀和乙酸鋅溶液各4.0mL，用純水定容，振搖均勻。放置30min后，取10.0mL上清液，加入2.0mL二乙酰一肟溶液，再加入三氯化鐵-氨基硫脲-硫酸混合試劑10.0mL，混勻。將上述各管在沸水浴中加熱14min，置流動(dòng)水中冷卻2min，并用純水稀釋至25mL。以純水作參比，用1cm比色皿，于525nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。

3.實(shí)驗(yàn)條件。（1）吸收波長(zhǎng)的確定。取適量標(biāo)準(zhǔn)溶液，在480nm-560nm范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果見(jiàn)圖1。

由圖1可知，吸光值在480nm-525nm范圍內(nèi)逐漸增加，且在525nm處達(dá)到最大，在525nm-560nm范圍內(nèi)又逐漸減小，由此確定最佳吸收波長(zhǎng)為525nm。

（2）反應(yīng)溫度的選擇。由于該反應(yīng)在常溫下顯色反應(yīng)進(jìn)行得很慢，故考慮在加熱的水浴中進(jìn)行反應(yīng)，分別將水浴鍋的溫度設(shè)置為60℃、70℃、80℃、90℃、100℃，觀察其顯色反應(yīng)，做出反應(yīng)溫度與吸光度的關(guān)系圖，詳見(jiàn)圖2。

由圖2可以看出，樣品吸光度受溫度影響較大，隨著溫度的升高而不斷增大，在溫度接近100℃時(shí)，吸光度達(dá)到最高，所以選擇沸水浴加熱為最佳的溫度條件。

（3）反應(yīng)時(shí)間的選擇。取8支比色管，加入標(biāo)準(zhǔn)溶液后分別置于沸水浴中，按照6min、8min、10min、12min、14min、16min、18min、20min的反應(yīng)時(shí)間，考察最后吸光值的變化情況，結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖3可知，在6-13min，溶液的顏色較淺，顯色不完全，吸光度也較小，隨著水浴時(shí)間的延長(zhǎng)，尿素顯色反應(yīng)吸光值呈逐漸上升趨勢(shì)，增加較明顯；在14-18min，溶液的吸光度比較穩(wěn)定，可顯色完全，吸光值基本達(dá)到最大值。為了提高效率，沸水浴時(shí)間定為14min。

（4）標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。取8支25mL具塞比色管，分別加入100mg/L的尿素標(biāo)準(zhǔn)使用液0mL、0.50mL、1.00mL、2.00mL、4.00mL、6.00mL、8.00mL、10.00mL。在上述各管中分別加入2.0mL二乙酰一肟溶液，再加入三氯化鐵-氨基硫脲-硫酸混合試劑10.0mL，混勻后用純水稀釋至25mL。分別配制成0mg/L、2mg/L、4mg/L、8mg/L、16mg/L、24mg/L、32mg/L、40mg/L的尿素標(biāo)準(zhǔn)系列，相當(dāng)于每個(gè)管中相當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的質(zhì)量為0.00mg、0.05mg、0.10mg、0.20mg、0.40mg、0.60mg、0.80mg、1.00mg。將上述各管在沸水浴中加熱14min，置流動(dòng)自來(lái)水中冷卻2min。以純水作參比，用1cm比色皿，在525nm處測(cè)定各管吸光度值，以尿素含量對(duì)吸光度做回歸分析。根據(jù)最佳實(shí)驗(yàn)條件，對(duì)尿素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行吸光度的檢測(cè)，得到不同濃度的尿素和吸光度的關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)而得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程為：y=0.7629x+0.0331，相關(guān)系數(shù)：r=0.9992。詳見(jiàn)表1和圖4。

三、討論

利用二乙酰一肟分光光度法來(lái)測(cè)定牛乳中尿素的含量，該方法標(biāo)準(zhǔn)曲線線性相關(guān)r=0.9992，檢出限為0.020mg/L，樣品測(cè)定的精密度為RSD=1.9%（n=9），低濃度和高濃度加標(biāo)回收均達(dá)到97%。該方法操作簡(jiǎn)單快速，可以很好地應(yīng)用于日常對(duì)牛乳中尿素含量的檢測(cè)。

運(yùn)用該法對(duì)超市及農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)銷售的12種不同袋裝奶及散裝奶中尿素含量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，尿素含量最低的是10#樣品（159mg/L），含量最高為11#樣品（645mg/L），大部分測(cè)定結(jié)果在200-400mg/L左右。杜彥山、張志國(guó)等人曾測(cè)得牛奶中尿素含量為224.7mg/L，和本實(shí)驗(yàn)中的幾個(gè)數(shù)據(jù)較為接近，但5#、9#、11#樣品的尿素含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于300mg/L，很有可能是摻假牛乳。

作者簡(jiǎn)介：龐雨樵（1981-），男，漢族，主管檢驗(yàn)師，碩士，主要研究方向?yàn)槭称贰⑺幤钒踩珯z驗(yàn)檢測(cè)。

*通訊作者：沈曉麗（1983-），女，漢族，實(shí)驗(yàn)師，碩士，主要研究方向?yàn)槭称?、藥品安全檢驗(yàn)檢測(cè)。