蔣楠 祝國(guó)蓮 劉衛(wèi)霞

乳腺癌是一種常見(jiàn)的惡性腫瘤，在世界范圍內(nèi)乳腺癌具有較高的發(fā)病率和死亡率，對(duì)女性的身心健康產(chǎn)生嚴(yán)重的威脅。進(jìn)幾年臨床相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)乳腺癌患者的人數(shù)逐漸增加，嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量[1]。乳腺癌發(fā)病受多種因素影響，且發(fā)病機(jī)制尚未明確，大量學(xué)者研究指出，乳腺癌受機(jī)體多種系統(tǒng)調(diào)控，和機(jī)體細(xì)胞及組織結(jié)構(gòu)有緊密的聯(lián)系[2,3]。目前臨床中主要通過(guò)手術(shù)切除配合放療、化療的方式進(jìn)行治療，對(duì)患者產(chǎn)生的不良反應(yīng)較大，帶來(lái)極大的痛苦。褐藻多糖的主要功能是抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫、抗血栓等，對(duì)于多種腫瘤也有顯著的抑制作用[4]。褐藻多糖對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有促進(jìn)凋亡和完成自我吞噬的作用，同時(shí)可以誘導(dǎo)樹突細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、T細(xì)胞成熟和分化。在體外細(xì)胞研究中，褐藻多糖促進(jìn)細(xì)胞凋亡的途徑是通過(guò)內(nèi)源性和外源性凋亡機(jī)制來(lái)完成，同時(shí)能夠提高化療藥物的療效。PI3k/AKT信號(hào)通路在大部分腫瘤中均表達(dá)失調(diào)，在腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡過(guò)程中起到重要的調(diào)節(jié)作用[5]。郭威等[6]研究指出，PI3k/AKT信號(hào)通路作為治療腫瘤的有效靶點(diǎn)，引起廣泛的關(guān)注。目前，臨床中關(guān)于褐藻多糖治療乳腺腫瘤的相關(guān)研究較少，本文旨在研究褐藻多糖通過(guò)調(diào)控PI3k/AKT信號(hào)通路對(duì)乳腺腫瘤大鼠的影響，為褐藻多糖的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 研究動(dòng)物：選取60只雌性、健康Wistar大鼠，年齡6～10周，平均年齡(8.5±0.3)周，體重200～240 g,平均體重(212.3±10.8)g，由斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司提供，大鼠動(dòng)物合格證號(hào):11401500014592。所有大鼠在無(wú)病原菌的干凈籠子里喂養(yǎng)，飲用水和食物均進(jìn)行過(guò)消毒。本文研究均經(jīng)過(guò)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。主要試劑：褐藻多糖(購(gòu)自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司)；PI3k、Akt、PTEN、SHIP一抗和二抗(羊抗鼠一抗和羊抗鼠二抗，均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 乳腺腫瘤模型建立及分組:參考文獻(xiàn)[7]制作乳腺腫瘤模型，并進(jìn)行適當(dāng)修改，60只大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、低劑量褐藻多糖組和高劑量褐藻多糖組，每組15只。所有大鼠在建模前需要禁食和禁水12 h，采用10%水合氯醛進(jìn)行腹腔注射，所有大鼠采取仰臥位，將頭和四肢進(jìn)行固定，進(jìn)行常規(guī)消毒。模型組、低劑量褐藻多糖組和高劑量褐藻多糖組大鼠右側(cè)臀部皮下注射DMBA，劑量為100 mg/kg，正常組在同一位置注射等體積的0.9%氯化鈉溶液。褐藻多糖以5 mg/μl的質(zhì)量濃度儲(chǔ)存?zhèn)溆?。低劑量褐藻多糖組給予褐藻多糖灌胃干預(yù)劑量為100 μg/ml，高劑量褐藻多糖組給予褐藻多糖灌胃干預(yù)劑量為200 μg/ml。正常組和模型組大鼠給予等體積的無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液進(jìn)行干預(yù)，所有大鼠均需要連續(xù)干預(yù)2周。

1.2.2 病理學(xué)觀察:褐藻多糖干預(yù)2周后，大鼠頸部脫臼處死后，提取正常組、模型組、低劑量褐藻多糖組、高劑量褐藻多糖組大鼠乳腺組織，4%的多聚甲醛進(jìn)行固定，之后脫水、浸蠟、包埋、制成4 μm厚的切片，之后采取乙醇進(jìn)行脫水，使用檸檬酸進(jìn)行抗原修復(fù)。脫蠟處理后，進(jìn)行HE染色。

1.2.3 腫瘤體積、瘤數(shù)量、潛伏期統(tǒng)計(jì):取完整處死大鼠腹部皮膚以及大鼠皮下乳腺組織，將包塊剔除后，并且對(duì)半切開(kāi)進(jìn)行觀察，統(tǒng)計(jì)大鼠包塊的數(shù)量，使用游標(biāo)卡尺(精確到1 mm)測(cè)量大鼠包塊的直徑、高度。計(jì)算腫瘤體積，公式=長(zhǎng)×寬×高×π/6。如果大鼠有多個(gè)腫瘤發(fā)生，則統(tǒng)計(jì)腫瘤體積之和。記錄以及潛伏期。

1.2.4 腫瘤細(xì)胞的增殖和周期等情況:提取大鼠乳腺腫瘤細(xì)胞，進(jìn)行消化，計(jì)數(shù)，選擇24孔板進(jìn)行接種，1×104/孔。細(xì)胞貼壁后，分別加入2 ml的100 μg/ml和200 μg/ml的褐藻多糖，每組濃度選擇18個(gè)復(fù)孔，每孔中加入2 ml的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)0 h、24 h、48 h，統(tǒng)計(jì)復(fù)孔中的細(xì)胞數(shù)量。將復(fù)孔中的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.2.5 TNF-α、IL-6、IL-5、VEGF炎性因子檢測(cè):采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)將50 mmol/L碳酸鹽包被緩沖液將抗原進(jìn)行溶解，濃度為10～20 μg/ml，在96孔酶標(biāo)板中加入100 μl/孔，4℃過(guò)夜保存。第2天舍棄包被液，采用PBST洗滌3次，每孔中加入1%的150 μl BSA，在37℃環(huán)境中封閉1 h。之后采用PBST洗滌3次，在每孔中加入100 μl不同倍比稀釋度的血清，加入對(duì)照樣品，37℃孵育2 h。采用PBST洗滌5次，加入100 μl,稀釋后的HRP標(biāo)記的二抗，37℃孵育1 h。PBST洗滌5次，之后，使用顯色劑顯色20 min后，在酶標(biāo)儀上讀取A405吸收值。分析TNF-α、IL-6、IL-5、VEGF水平。

1.2.6 Western blot檢測(cè)PI3k/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白:大鼠組織標(biāo)本研磨后加入蛋白緩沖液，進(jìn)行常規(guī)蛋白提取，采取BCA法進(jìn)行定量分析。50 μg的蛋白樣品上樣后SDS-PAGE電泳，通過(guò)蛋白電轉(zhuǎn)到PVDF膜，使用5%的脫脂奶粉TBST中進(jìn)行避光封閉1 h，洗滌之后加入一抗稀釋溶液(PI3k、Akt、PTEN、SHIP按照1∶1 000比例進(jìn)行稀釋)，在4℃的環(huán)境中過(guò)夜保存，洗滌后加入二抗稀釋溶液(PI3k、Akt、PTEN、SHIP按照1∶5 000比例進(jìn)行稀釋)，在溫床中孵育1 h后再次洗滌，加入發(fā)光液ECL，曝光2～3次，取重疊值。使用軟件分析蛋白條帶灰度值。GAPDH作內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1 病理學(xué)觀察 正常組乳腺組織結(jié)構(gòu)表現(xiàn)正常，腺管排列整齊；模型組大鼠乳腺組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)和層次被破壞，呈現(xiàn)細(xì)胞團(tuán)塊結(jié)節(jié)，大小不一，細(xì)胞核表現(xiàn)不一致，有明顯的核分裂，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。低劑量褐藻多糖組和高劑量褐藻多糖組乳腺組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)和層次恢復(fù)，其中高劑量褐藻多糖組恢復(fù)明顯，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)顯著降低，細(xì)胞排列整齊。見(jiàn)圖1。

正常組模型組低劑量高劑量

2.2 褐藻多糖對(duì)腫瘤體積、瘤數(shù)量、潛伏期的影響 與正常組比較，模型組、低劑量褐藻多糖組、高劑量褐藻多糖組腫瘤體積、瘤數(shù)量、潛伏期較高(P<0.05)。與模型組比較，低劑量褐藻多糖組、高劑量褐藻多糖組腫瘤體積、瘤數(shù)量降低，潛伏期升高(P<0.05)；與低劑量褐藻多糖組比較，高劑量褐藻多糖組腫瘤體積、瘤數(shù)量降低，潛伏期升高差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 褐藻多糖對(duì)腫瘤體積、瘤數(shù)量、潛伏期的影響

2.3 褐藻多糖對(duì)乳腺腫瘤細(xì)胞增殖的影響 與正常組比較，24 h、48 h模型組、低劑量褐藻多糖組、高劑量褐藻多糖組乳腺腫瘤細(xì)胞增殖率較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，24 h、48 h低劑量褐藻多糖組、高劑量褐藻多糖組乳腺腫瘤細(xì)胞增殖率降低(P<0.05)，與低劑量褐藻多糖組比較，24 h、48 h高劑量褐藻多糖組增殖率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 褐藻多糖對(duì)乳腺腫瘤細(xì)胞增殖的影響

2.4 褐藻多糖對(duì)乳腺腫瘤細(xì)胞周期的影響 與正常組比較，模型組、低劑量褐藻多糖組、高劑量褐藻多糖組乳腺腫瘤細(xì)胞周期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，低劑量褐藻多糖組、高劑量褐藻多糖組乳腺腫瘤細(xì)胞周期較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與低劑量褐藻多糖組比較，高劑量褐藻多糖組G0/G1期低，S期和G2期高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 褐藻多糖對(duì)乳腺腫瘤細(xì)胞周期的影響

2.5 褐藻多糖對(duì)相關(guān)炎性因子水平的影響 與正常組比較，模型組、低劑量褐藻多糖組、高劑量褐藻多糖組TNF-α、IL-6、IL-5、VEGF水平較高(P<0.05)。與模型組比較，低劑量褐藻多糖組、高劑量褐藻多糖組TNF-α、IL-6、IL-5、VEGF水平降低(P<0.05)；與低劑量褐藻多糖組比較，高劑量褐藻多糖組TNF-α、IL-6、IL-5、VEGF水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 褐藻多糖對(duì)相關(guān)炎性因子水平的影響

2.6 褐藻多糖對(duì)PI3k/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與正常組比較，模型組、低劑量褐藻多糖組、高劑量褐藻多糖組PI3k、Akt、PTEN、SHIP表達(dá)較高(P<0.05)。與模型組比較，低劑量褐藻多糖組、高劑量褐藻多糖組PI3k、Akt、PTEN、SHIP表達(dá)降低(P<0.05)；與低劑量褐藻多糖組比較，高劑量褐藻多糖組PI3k、Akt、PTEN、SHIP表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表5，圖2。

表5 褐藻多糖對(duì)PI3k/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討論

DMBA屬于一種致癌劑，具有較強(qiáng)的代謝依賴性，主要作用機(jī)制是通過(guò)體內(nèi)代謝活化對(duì)DNA產(chǎn)生損傷，細(xì)胞發(fā)生突變，阻礙細(xì)胞分化，細(xì)胞異常增生，最終誘導(dǎo)腫瘤產(chǎn)生[8]。本文實(shí)驗(yàn)研究是通過(guò)對(duì)大鼠注射DMBA制劑，誘導(dǎo)大鼠乳腺腫瘤發(fā)生。曹加偉等[9]研究指出，DMBA誘導(dǎo)的乳腺癌模型，細(xì)胞分化較差且惡性程度高，腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為以及腫瘤的病理形態(tài)方面與人乳腺癌相似。

本文研究結(jié)果顯示，模型組大鼠腫瘤體積大、瘤數(shù)量較多，潛伏時(shí)間短，經(jīng)過(guò)褐藻多糖干預(yù)，大鼠腫瘤體積降低、瘤數(shù)量減少，潛伏時(shí)間延長(zhǎng)。說(shuō)明褐藻多糖能夠顯著的減小腫瘤體積和質(zhì)量，從而抑制乳腺腫瘤的生長(zhǎng)惡化。張婷等[10]研究指出，褐藻糖膠能夠降低乳腺腫瘤大鼠腫瘤發(fā)生率和平均瘤重量，延長(zhǎng)腫瘤潛伏期。本文研究結(jié)果與其保持一致。褐藻多糖可作用于多種腫瘤，例如肝癌、乳腺癌、黑色素瘤、肺癌等，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡和自我吞噬，同時(shí)褐藻多糖能夠促進(jìn)人單核樹突細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、T細(xì)胞分化和成熟[11]。本文研究結(jié)果顯示，高劑量褐藻多糖組乳腺腫瘤細(xì)胞增長(zhǎng)率降低，說(shuō)明高劑量的褐藻多糖對(duì)乳腺腫瘤細(xì)胞增殖有抑制作用。高劑量褐藻多糖組G0/G1期細(xì)胞數(shù)量低，說(shuō)明高劑量的褐藻多糖能夠阻滯乳腺腫瘤細(xì)胞的G0/G1期。

TNF-α屬于多功能炎性細(xì)胞因子，主要由嗜酸性粒細(xì)胞以及單核細(xì)胞產(chǎn)生，具有抗感染和抗腫瘤的作用。TNF-α通過(guò)介導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞在炎癥部位聚集，刺激產(chǎn)生IL-6、IL-8等因子，從而使機(jī)體產(chǎn)生持續(xù)存在的炎性反應(yīng)[12]。VEGF屬于一種誘導(dǎo)能力較強(qiáng)的因子，作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，刺激細(xì)胞的增殖、遷移以及誘導(dǎo)血管的生長(zhǎng)，在腫瘤的血管形成過(guò)程中起到重要的參與作用[13,14]。Liang等[15]研究顯示，VEGF在乳腺癌患者體內(nèi)呈現(xiàn)高表達(dá)。本文研究結(jié)果顯示，模型組大鼠TNF-α、IL-6、IL-5、VEGF水平較高，經(jīng)過(guò)褐藻多糖干預(yù)，大鼠TNF-α、IL-6、IL-5、VEGF水平降低，其中高劑量褐藻多糖組TNF-α、IL-6、IL-5、VEGF水平改善明顯，說(shuō)明褐藻多糖能夠有效的抑制乳腺大鼠炎性反應(yīng)，并且成濃度依賴。褐藻多糖同過(guò)降低TNF-α、IL-6、IL-5、VEGF水平，抑制乳腺腫瘤新生血管的產(chǎn)生，腫瘤的內(nèi)部血液供應(yīng)起到抑制效果，從而抑制乳腺腫瘤增長(zhǎng)。

圖2 PI3k/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白Western blot圖

褐藻多糖的來(lái)源較為豐富，目前臨床中集中在抗凝血、抗病毒、降血脂研究上，關(guān)于在乳腺腫瘤的研究較少[16]。王鴻等[17]研究指出，在抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等方面具有多種生物活性，通過(guò)其內(nèi)源、外源凋亡機(jī)制能夠提高化療藥物的作用。PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)腫瘤細(xì)胞啟動(dòng)程序性死亡有抑制作用，促進(jìn)細(xì)胞存活，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，同時(shí)對(duì)正常細(xì)胞凋亡也有明顯的抑制能力[18]。劉娟妮等[19]研究顯示，PI3K/Akt信號(hào)通路參與乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展，通過(guò)調(diào)控相關(guān)蛋白表達(dá)，促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲和遷移。本文研究結(jié)果顯示，通過(guò)Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，高劑量褐藻多糖組PI3k、Akt、PTEN、SHIP表達(dá)降低，說(shuō)明高劑量褐藻多糖對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白的抑制作用顯著，通過(guò)抑制其活化，降低大鼠體內(nèi)的炎性反應(yīng)，從而起到抑制乳腺腫瘤發(fā)生。本文研究結(jié)果與王紅兵等[20]研究保持一致。

綜上所述，褐藻多糖通過(guò)調(diào)控PI3k/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，阻滯G0/G1期，改善炎性因子水平，對(duì)乳腺腫瘤起到顯著的抑制作用。