張瀟晗，鄭秋涵，支雅靜，楊夢(mèng)婷，牛麗穎,2,3，畢曉東,2,3

(1 河北中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，河北 石家莊 050200；2 河北省中藥配方顆粒技術(shù)創(chuàng)新中心，

薄層色譜法由于設(shè)備和操作十分簡(jiǎn)便，被廣泛用于中藥等復(fù)雜樣品的初步分離和定性分析中。通常樣品點(diǎn)在展開(kāi)劑的作用下在平面固定相上沿著一個(gè)固定方向展開(kāi)(即一維薄層)，在展開(kāi)劑和固定相之間的分配作用等相互作用下，分離成幾個(gè)樣品點(diǎn)[1-3]。二維薄層色譜法是在傳統(tǒng)的一維薄層色譜法的基礎(chǔ)上，通過(guò)引入具有正交性的固定相或者展開(kāi)劑，在一維分離方向的正交方向上進(jìn)行第二次的展開(kāi)(及二維展開(kāi))，可以彌補(bǔ)一維方向上分離不充分的缺點(diǎn)，同時(shí)提供一維和二維上的比移值(Rf)進(jìn)行雙重定性。相比與在一維方向上進(jìn)行二次展開(kāi)，二維展開(kāi)的展開(kāi)劑體系的選取更加靈活多樣[4-5]。

苦參苦，寒。歸心、肝、胃、大腸、膀胱經(jīng)，具有清熱燥濕，殺蟲(chóng)，利尿等功效，苦參中含有多種化學(xué)成分，主要以生物堿(苦參堿及氧化苦參堿)為主，其次為黃酮[6-7]。本研究以苦參中的生物堿為分析對(duì)象，建立二維薄層色譜分析的方法，提供多維度的分離信息，并采用離線的液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)綜合評(píng)價(jià)二維薄層的定性分離能力。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器與試劑

滴管、尺子、鉛筆、硅膠板切割刀、薄層色譜硅膠預(yù)制板(型號(hào)HSG，規(guī)格200×100，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)魯Q/YT257-58，涂層厚度0.01～0.05 mm，硅膠粉粒度HPTLC8±2 μm≥80%，TLC 10～40 μm，散射參數(shù)：SX=3)、TLC板式加熱器、展開(kāi)缸、點(diǎn)樣管、噴瓶、微型離心儀、吹風(fēng)機(jī)、家用微波爐、AB SCIEX液質(zhì)聯(lián)用儀器。

苦參堿、氧化苦參堿、苦參對(duì)照藥材購(gòu)置于中檢所，氯仿、甲醇、乙腈、純凈水、氨水、冰醋酸、碘化鉍鉀(分子式BiI3·4KI，分子量1253.70，含Bi量不少于16.0%，含碘量不少于69%)均為試劑純，顯色劑：碘化鉍鉀0.85 g+10 mL冰醋酸+40 mL水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

二維薄層色譜方法，包括切板、點(diǎn)樣、一維展開(kāi)、二維展開(kāi)和顯色，具體如下。

1.2.1 切 板

用硅膠板切割刀將薄層板切成長(zhǎng)寬相近的矩形，劃線(如圖1所示，兩線交叉處為點(diǎn)樣處，標(biāo)有1D的為一維展開(kāi)方向，標(biāo)有2D為二維展開(kāi)方向，一維與二維的展開(kāi)方向互相垂直)，待用。

圖1 二維薄層色譜板的劃線示意圖

1.2.2 點(diǎn) 樣

取用一根干凈的點(diǎn)樣管吸取待測(cè)樣品點(diǎn)約10 μL于二維薄層板的點(diǎn)樣處，控制點(diǎn)樣大小，每次點(diǎn)樣后用吹風(fēng)機(jī)烘干，反復(fù)多次直至點(diǎn)完所吸樣品溶液。

1.2.3 一維展開(kāi)

取用一個(gè)干凈干燥的展開(kāi)缸，向展開(kāi)缸內(nèi)加入一維展開(kāi)劑，蓋蓋，使其密閉達(dá)到飽和狀態(tài)，5 min后將點(diǎn)好樣的硅膠板放入其中按照一維展開(kāi)方向展開(kāi)，使硅膠板的底端劃線處浸入一維展開(kāi)劑中，蓋蓋，待硅膠板上的液體上升至距硅膠板頂端1 cm左右的位置，將其取出，置于TCL板式加熱器烘干。

1.2.4 二維展開(kāi)

取用一個(gè)干凈干燥的展開(kāi)缸，向展開(kāi)缸內(nèi)加入二維展開(kāi)劑，蓋蓋，使其密閉達(dá)到飽和狀態(tài)，5 min后將硅膠板放入其中按照二維展開(kāi)方向展開(kāi)，使硅膠板的底端劃線處浸入二維展開(kāi)劑中，蓋蓋，待硅膠板上的液體上升至距硅膠板頂端1 cm左右的位置，將其取出，置于TCL板式加熱器烘干。

1.2.5 顯 色

均勻噴灑顯色劑于硅膠板上，觀察實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象。

1.2.6 液質(zhì)聯(lián)用測(cè)試條件

液相條件：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；以乙腈-0.1%乙酸(3:97)為流動(dòng)相，流速：0.3 mL/min，進(jìn)樣量：1 μL。

質(zhì)譜條件：氣簾氣：35 psi；噴霧電壓：5500 V；溫度：550 ℃；氣路1:40 psi；氣路2:40 psi。采用MRM進(jìn)行測(cè)試，苦參堿離子對(duì)：249.2/148.0，氧化苦參堿離子對(duì)：265.1/148.0。

1.2.7 液質(zhì)分析樣品制備

將苦參提取液的二維展開(kāi)板(未顯色)的目標(biāo)區(qū)刮下，加入2 mL的90%乙醇溶液，再加入5 μL的冰醋酸，超聲2 min，離心，取上層清液，用0.22 μm濾膜過(guò)濾后，進(jìn)行液質(zhì)分析。將苦參提取液用0.22 μm濾膜過(guò)濾后，進(jìn)行液質(zhì)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 二維展開(kāi)劑系統(tǒng)的篩選

選取不同的展開(kāi)劑組合成二維展開(kāi)體系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(所選展開(kāi)劑見(jiàn)表1)，考察一維和二維展開(kāi)情況，當(dāng)一維展開(kāi)劑使用氯仿:甲醇= 4:1，二維展開(kāi)劑使用乙腈:水=9:1(氨水飽和)時(shí)，苦參提取液在一維和二維均能夠展開(kāi)。采用篩選出來(lái)的二維展開(kāi)體系，測(cè)試苦參提取物、苦參堿和氧化苦參堿的標(biāo)準(zhǔn)品供試液，對(duì)比二維展開(kāi)結(jié)果。

實(shí)驗(yàn)所用薄層色譜板的材料為硅膠，表面具有硅羥基，是極性較強(qiáng)的分離介質(zhì)，通常可以用于正相色譜分析，也可以用作親水相互作用色譜分析。因此一維展開(kāi)采用分析生物堿的常用展開(kāi)劑可以分離出生物堿，而二維展開(kāi)劑采用高比例的乙腈，在親水相互作用模式下可以對(duì)一維粗分離得到的斑點(diǎn)進(jìn)行進(jìn)一步分離。

2.2 二維薄層色譜分析結(jié)果

采用篩選出來(lái)的二維展開(kāi)劑體系，測(cè)定苦參提取液、苦參堿和氧化苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品。見(jiàn)圖2～圖4。各二維薄層的比移值見(jiàn)表2。經(jīng)過(guò)Rf值的初步對(duì)比分析，苦參提取液在二維展開(kāi)后得到的斑點(diǎn)1為氧化苦參堿，斑點(diǎn)2未知，未見(jiàn)苦參堿的斑點(diǎn)。

圖2 苦參提取物的二維薄層色譜圖

二維薄層色譜可以在第二維對(duì)第一維無(wú)法分離的斑點(diǎn)提供進(jìn)一步分離，相比二次展開(kāi)，展開(kāi)劑選擇更為廣泛，不必考慮對(duì)其他斑點(diǎn)的影響。此外，二維薄層色譜為每一個(gè)斑點(diǎn)提供2個(gè)Rf值作為定性比對(duì)的基礎(chǔ)，采用雙Rf值對(duì)比，可以提供更準(zhǔn)確的定性分析結(jié)果。

圖3 苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品的二維薄層色譜圖

圖4 氧化苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品的二維薄層色譜圖

表2 二維薄層色譜的Rf值

2.3 液質(zhì)聯(lián)用分析

將苦參提取液的二維展開(kāi)板(未顯色)的斑點(diǎn)1和斑點(diǎn)2的區(qū)域(以下稱氧化苦參堿區(qū))，以及苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品的對(duì)應(yīng)區(qū)域(以下稱苦參堿區(qū))刮下(刮板情況見(jiàn)圖5)，按照2.4.2項(xiàng)下方法進(jìn)行提取處理，然后進(jìn)行液質(zhì)分析。

圖5 苦參提取液的二維薄層刮板情況

苦參提取液、二維展開(kāi)后的苦參堿區(qū)、氧化苦參堿區(qū)的液質(zhì)分析結(jié)果見(jiàn)圖6～圖7。苦參提取液中含有苦參堿和氧化苦參堿。苦參堿區(qū)雖然沒(méi)有觀察到生物堿的顯色斑點(diǎn)，但仍有苦參堿的離子對(duì)信號(hào)。氧化苦參堿區(qū)除了氧化苦參堿的離子對(duì)之外，還存在苦參堿的離子對(duì)信號(hào)，由于該區(qū)域并不是苦參堿的二維展開(kāi)區(qū)，因此該信號(hào)(即斑點(diǎn)2)可能為苦參堿的同分異構(gòu)體，可能為槐定堿。

圖7 苦參堿的液質(zhì)圖

圖6 苦參提取液的液質(zhì)圖

由于液質(zhì)聯(lián)用的檢測(cè)限遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于薄層顯色，因此二維薄層的不同區(qū)在液質(zhì)聯(lián)用中的純度并不高，主要原因是薄層顯色僅為濃度高的區(qū)域，而硅膠底部的低濃度區(qū)無(wú)法顯色，但仍然能夠被質(zhì)譜檢測(cè)到，其他原因還可能是苦參提取液的濃度不夠高、斑點(diǎn)2為苦參堿的同分異構(gòu)體。

圖8 氧化苦參堿的液質(zhì)圖

3 結(jié) 論

本研究充分利用薄層色譜硅膠板的性質(zhì)，建立的二維薄層色譜分析方法，并用于苦參提取物的分析，二維薄層色譜可以在第二維對(duì)第一維無(wú)法分離的斑點(diǎn)提供進(jìn)一步分離，并且能夠每一個(gè)斑點(diǎn)提供2個(gè)Rf值作為定性比對(duì)的基礎(chǔ)。采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)薄層展開(kāi)斑點(diǎn)區(qū)進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，對(duì)二維薄層色譜方法的優(yōu)缺點(diǎn)的客觀評(píng)價(jià)提供了強(qiáng)有力的證據(jù)。