劉 洋,張 汆,何小寧,陳志宏,何曉偉,趙維萍,,朱國(guó)美,查明方(.滁州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院,安徽滁州 29000;2.安徽大學(xué),現(xiàn)代生物制造協(xié)同創(chuàng)新中心,安徽合肥 2060;.滁州市農(nóng)業(yè)農(nóng)村技術(shù)推廣中心,安徽滁州 29000)

芡實(shí)(Euryaleferox)又名雞頭蓮,為一年生水生草本植物,屬于睡蓮科[1]。芡實(shí)是一種珍貴藥食兼用作物,有刺芡(北芡)和蘇芡(南芡)兩個(gè)品種[2]。芡實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富,如芡實(shí)米中富含淀粉、蛋白質(zhì)、維生素、礦物元素以及少量的脂類物質(zhì)[3],還含有多糖、多酚類等活性成分[4]。芡實(shí)皮渣是芡實(shí)加工過(guò)程中產(chǎn)生的主要副產(chǎn)物,易腐爛,不易保存,一直是做為廢棄物被丟棄。按照目前全國(guó)芡實(shí)米年產(chǎn)約10萬(wàn)噸進(jìn)行估算,預(yù)計(jì)可產(chǎn)生的芡實(shí)皮渣約為20～30萬(wàn)噸,這不僅是對(duì)資源的浪費(fèi),也會(huì)對(duì)環(huán)境造成一定的污染。

多糖存在于很多植物原料中,具有一定的生理活性或保健功能,其良好的抗氧化性使其在醫(yī)藥、化妝品方面有著極大的市場(chǎng)[5]。近年來(lái),許多學(xué)者從芡實(shí)種仁中進(jìn)行了多糖的提取、純化與抗氧化活性等方面的研究[6-7]。目前芡實(shí)來(lái)源的多糖研究主要針對(duì)的是芡實(shí)種仁,而對(duì)于芡實(shí)皮渣中多糖的提取、理化性質(zhì)和抗氧化活性方面的研究則未有報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究芡實(shí)皮渣的干燥曲線,確定其最佳干燥條件,延長(zhǎng)其貯藏期,并以干燥后的芡實(shí)皮渣為原料,使用熱水浸提醇沉法提取多糖。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定多糖提取最佳工藝,同時(shí)測(cè)定多糖的理化性質(zhì)、凝膠特性,利用高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)對(duì)多糖水解產(chǎn)物進(jìn)行分析。在此基礎(chǔ)上,以多糖的總還原力以及對(duì)羥基自由基、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基、超氧離子和亞硝酸鹽的消除率作為評(píng)價(jià)指標(biāo),評(píng)估多糖的體外抗氧化活性,研究結(jié)果可為芡實(shí)皮渣的綜合利用、多糖的制備及其在食品等領(lǐng)域的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

芡實(shí)新鮮果實(shí) 于2018年9月采于滁州市瑯琊區(qū)秋桐村芡實(shí)種植試驗(yàn)田;苯酚、無(wú)水乙醇、濃硫酸、硫酸鉀、硫酸銅、甲基紅、溴甲酚綠、碳酸鈉、硼酸、氫氧化鈉、鹽酸、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、鐵氰化鉀、三氯化鐵、抗壞血酸等 分析純,國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司。

CP224S型分析天平 德國(guó)Sartorius公司;L500型離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司;HH-4型恒溫水浴鍋 金壇市杰瑞爾電器有限公司;DHS16-A型水分測(cè)定儀 上海天美天平儀器有限公司;L3S型分光光度計(jì) 上海儀電分析儀器有限公司;TA. XTplus物性測(cè)試儀 英國(guó)Stable Micro System公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料預(yù)處理 取新鮮芡實(shí)果,手工剝開外表皮,獲取芡實(shí)皮渣,裝入塑料自封袋內(nèi),4 ℃冰箱中貯藏,備用。

1.2.2 芡實(shí)皮渣干燥曲線的繪制 取芡實(shí)皮渣解凍,稱取12份芡實(shí)皮渣置于恒重鋁盒中,每份稱取10 g。樣品從1～12編號(hào),置于烘箱進(jìn)行干燥,分別于0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10 h取出并稱重,再將樣品干燥至恒重,計(jì)算剩余含水率。分別研究計(jì)算40、50、60、70、80 ℃溫度條件下不同干燥時(shí)間的失水率和干燥速率[8],通過(guò)繪制失水率-時(shí)間曲線和干燥速率-時(shí)間的曲線,獲取最佳干燥溫度和時(shí)間。

1.2.3 芡實(shí)皮渣多糖提取工藝流程 芡實(shí)皮渣的干燥和粉碎→粉末過(guò)60目篩→加熱浸提(攪拌)→離心分離(5000 r/min,5 min)→醇沉→離心分離(5000 r/min,5 min)→溶解→真空冷凍干燥→芡實(shí)皮渣多糖

1.2.4 芡實(shí)皮渣多糖含量和純度測(cè)定

1.2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 采用苯酚-硫酸法[9],在波長(zhǎng) 490 nm處測(cè)定吸光度,以吸光度為縱坐標(biāo),葡萄糖含量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4.2 多糖得率和純度測(cè)定 取5.0 mL多糖提取液,于100 mL容量瓶中定容,取稀釋液1.0 mL于比色管中,加入蒸餾水1.0 mL,6%苯酚溶液1.0 mL,濃硫酸5.0 mL后搖勻,以2.0 mL水作為空白對(duì)照液,在沸水浴中恒溫30 min,取出冷卻15 min后,在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定吸光度,根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算多糖得率與純度[9]。

式中:0.9為葡萄糖轉(zhuǎn)化為多糖的轉(zhuǎn)化因子;n為稀釋倍數(shù);C為提取液中葡萄糖濃度(mg/mL);V為提取液總體積(mL);m1為原料的質(zhì)量(g);m2為粗多糖的質(zhì)量(g)。

1.2.5 單因素實(shí)驗(yàn) 以多糖得率為指標(biāo),分別考察5個(gè)提取工藝參數(shù)對(duì)得率的影響。主要因素有料液比、醇沉濃度、浸提溫度、浸提時(shí)間、浸提次數(shù)。

1.2.5.1 料液比 稱取0.5 g芡果實(shí)皮渣粉,按照不同的料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 (g∶mL)加入蒸餾水,浸提溫度40 ℃,醇沉濃度80%,浸提時(shí)間30 min,提取3次,考察料液比對(duì)芡果實(shí)皮渣多糖得率的影響。

1.2.5.2 醇沉濃度 稱取0.5 g芡果實(shí)皮渣粉,按料液比1∶30 (g∶mL)加入蒸餾水,浸提溫度40 ℃,浸提時(shí)間30 min,提取3次,分別設(shè)定不同的醇沉濃度(70%、75%、80%、85%、90%),考察醇沉濃度對(duì)芡果實(shí)皮渣多糖得率的影響。

1.2.5.3 浸提溫度 稱取0.5 g芡果實(shí)皮渣粉,按料液比1∶30 (g∶mL)加入蒸餾水,醇沉濃度80%,提取時(shí)間30 min,提取3次,分別設(shè)定不同的浸提溫度(30、40、50、60、70 ℃),考察浸提溫度對(duì)芡果實(shí)皮渣多糖得率的影響。

1.2.5.4 浸提時(shí)間 稱取0.5 g芡果實(shí)皮渣粉,按料液比1∶30 (g∶mL)加入蒸餾水,設(shè)定浸提溫度60 ℃,醇沉濃度80%,提取3次,分別設(shè)定不同的浸提時(shí)間(10、20、30、40、50 min),考察浸提時(shí)間對(duì)芡果實(shí)皮渣多糖得率的影響。

1.2.5.5 浸提次數(shù) 稱取0.5 g芡果實(shí)皮渣粉,按料液比1∶30 (g∶mL)加入蒸餾水,浸提溫度60 ℃,醇沉濃度80%,浸提時(shí)間30 min,分別設(shè)定不同的浸提次數(shù)(1、2、3、4、5次),考察浸提次數(shù)對(duì)芡果實(shí)皮渣多糖得率的影響。

1.2.6 正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取料液比、浸提溫度、浸提時(shí)間、醇沉濃度四個(gè)因素,進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)表的設(shè)計(jì),優(yōu)化多糖提取條件,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 因素水平設(shè)計(jì)L9(34)Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment L9(34)

1.2.7 理化指標(biāo)檢測(cè)

1.2.7.1 色差 通過(guò)色差計(jì)對(duì)芡實(shí)皮渣多糖的L*、a*、b*值進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.7.2 水分 參照GB 5009.3-2016《食品中水分的測(cè)定》。

1.2.7.3 吸水性 稱取0.5 g多糖于離心管中,加入40 mL蒸餾水,充分混合,搖勻稱重。室溫下放置30 min,每間隔5 min振蕩1次,共振蕩3次。離心(4000 r/min,10 min)棄上清液,將離心管倒置5 min瀝干水后稱重。吸水指數(shù)計(jì)算公式:

式中:E-吸水指數(shù)(g/g);m-指的是樣品質(zhì)量(g);m1-離心后離心管(含吸水后的樣品)質(zhì)量(g);m2-離心管質(zhì)量(g)[10]。

1.2.7.4 吸油性 稱取0.5 g多糖于離心管中,加入20 mL植物油,搖勻稱重。室溫下放置30 min,每間隔5 min振蕩1次,共振蕩3次。離心(4000 r/min,10 min)棄去上層油脂,將離心管倒置5 min瀝干剩余植物油后稱重。吸油指數(shù)計(jì)算公式:

式中:W-吸油指數(shù)(g/g);m-樣品質(zhì)量(g);m3-離心后離心管(包含吸油后的樣品)質(zhì)量(g);m4-離心管質(zhì)量(g)[10]。

1.2.7.5 碘-碘化鉀反應(yīng) 制備2%的碘-碘化鉀溶液,向溶液中滴加濃度為1 mg/mL的芡實(shí)皮渣多糖溶液,以淀粉作為對(duì)照,觀察溶液是否變藍(lán),判斷多糖中是否存在淀粉[11]。

1.2.7.6 水解性及其水解產(chǎn)物測(cè)定 利用乙酸鋅和亞鐵氰化鉀對(duì)多糖溶液進(jìn)行除蛋白處理,然后用酸水解,水解結(jié)束后用堿液中和,取水解液進(jìn)行衍生化,衍生化試劑選擇PMP甲醇溶液。同時(shí)取葡萄糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、巖藻糖、鼠李糖、木糖配制成標(biāo)準(zhǔn)溶液,進(jìn)行衍生化[12]。采用高效液相色譜(HPLC)進(jìn)行檢測(cè),使用二極管陣列檢測(cè)器(DAD),檢測(cè)條件為波長(zhǎng)250 nm,帶寬4 nm,溫度30 ℃,進(jìn)樣量10 μL,流動(dòng)相為乙腈與KH2PO4,設(shè)定流速1 mL/min,通過(guò)樣品峰的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)單糖峰的保留時(shí)間作對(duì)比,確定多糖組分類別。

1.2.8 多糖凝膠質(zhì)構(gòu)特性檢測(cè)

1.2.8.1 黏度特性 配制5～30 mg/mL濃度的多糖溶液,在室溫下檢測(cè)多糖濃度和黏度的關(guān)系。采用黏度計(jì)4號(hào)轉(zhuǎn)子,轉(zhuǎn)速60 r/min,黏度單位Pa·s。

1.2.8.2 凝膠質(zhì)構(gòu)特性 配制10、20、30、40、50 mg/mL的多糖溶液,觀察凝膠形成的最佳濃度。以凝膠形成濃度配制一定量凝膠,置于4 ℃下冰箱中冷藏,采用物性測(cè)試儀對(duì)凝膠進(jìn)行檢測(cè),選用TPA模式,p36r探頭,測(cè)試距離為50%(樣品厚度百分?jǐn)?shù)),測(cè)試速度:3 mm/s[13]。

1.2.9 芡實(shí)皮渣多糖的體外抗氧化活性檢測(cè)

1.2.9.1 總還原力能力的測(cè)定 取1 mL不同濃度芡實(shí)皮渣多糖溶液于10 mL試管中,加入0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.6)2.5 mL和1.0%的K3Fe(CN)6溶液2.5 mL,50 ℃水浴20 min,冷卻后加入10%三氯乙酸溶液1 mL,3000 r/min離心10 min,取上清液2.5 mL,加入0.1% FeCl3溶液0.5 mL和蒸餾水2 mL,靜置5 min后測(cè)定700 nm處的吸光值,以相同方法測(cè)定抗壞血酸VC的吸光值作對(duì)照[14]。

1.2.9.2 對(duì)羥自由基(·OH)清除能力的測(cè)定 分別吸取6 mmol/L FeSO4溶液、6 mmol/L H2O2溶液和6 mmol/L水楊酸溶液各2 mL加入10 mL試管中,然后加入1 mL不同濃度的芡實(shí)皮渣多糖溶液,37 ℃條件下水浴15 min后冷卻,在510 nm測(cè)定吸光值A(chǔ)1,以蒸餾水代替芡實(shí)皮渣多糖溶液測(cè)定吸光值A(chǔ)0,同時(shí)以相同方法測(cè)定抗壞血酸VC的吸光值作對(duì)照[14-15]。計(jì)算芡實(shí)皮渣多糖對(duì)·OH的清除率:

1.2.9.3 對(duì)1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除能力的測(cè)定 配制0.1 mmol/L的DPPH溶液(無(wú)水乙醇為溶劑),移取1 mL不同濃度芡實(shí)皮渣多糖溶液于10 mL試管中,依次加入2 mL蒸餾水和2 mL DPPH溶液,搖勻后室溫放置20 min,517 nm下測(cè)吸光值A(chǔ)1,以無(wú)水乙醇代替DPPH溶液后測(cè)定吸光值A(chǔ)2,以去離子水代替芡實(shí)皮渣多糖溶液測(cè)定吸光值A(chǔ)0,同時(shí)以相同方法測(cè)定抗壞血酸VC的吸光值作對(duì)照[14,16]。計(jì)算芡實(shí)多糖對(duì)DPPH的清除率:

1.2.9.5 對(duì)亞硝酸鹽清除能力的測(cè)定 吸取5 μg/mL亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液2 mL和一定量的芡實(shí)皮渣多糖溶液、混合均勻,依次加入0.4%對(duì)氨基苯磺酸溶液2 mL和0.2%鹽酸萘乙二胺溶液1 mL,靜止15 min后定容至50 mL,測(cè)定538 nm處的吸光值A(chǔ)1。同時(shí)以蒸餾水代替亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液測(cè)定的吸光值記為A2,用蒸餾水代替多糖溶液作為空白,其吸光值記為A0。同時(shí)以相同方法測(cè)定抗壞血酸VC的吸光值作對(duì)照[17]。計(jì)算芡實(shí)皮渣多糖對(duì)亞硝酸鹽清除率:

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均獨(dú)立重復(fù)3次,取平均值,且每次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3組平行;數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用Excel 2016軟件,圖表繪制采用Origin 2017軟件,。

2 結(jié)果與分析

2.1 干燥曲線的繪制

新鮮的芡實(shí)皮渣不宜保存,干燥不僅可以縮小芡實(shí)皮渣的體積,節(jié)省保藏空間,同時(shí)也可利于長(zhǎng)時(shí)間保藏。熱風(fēng)干燥是一種常用的干燥方式,是以熱空氣為加熱介質(zhì),通過(guò)對(duì)流傳導(dǎo)等加熱方式,以脫除物料水分的干燥技術(shù)[18]。通過(guò)干燥曲線的繪制,可以找到合適的干燥溫度及時(shí)間,在保證干燥速率的同時(shí)節(jié)省干燥成本。如圖1所示,干燥前期,芡實(shí)皮渣的失水率迅速升高,一定時(shí)間后達(dá)到緩升期(即失水率緩慢升高的時(shí)間,h)。隨著溫度的升高,失水率到達(dá)緩升期的時(shí)間逐漸減少。50 ℃條件下,芡實(shí)皮渣失水率到達(dá)緩升期的時(shí)間為4 h,此時(shí)失水率為88.82%,失水速率為1.54 g/(g·h),水分含量在14%以下,可以長(zhǎng)期儲(chǔ)存。由于干燥過(guò)程中會(huì)發(fā)生美拉德反應(yīng),出現(xiàn)褐變等不良現(xiàn)象,干燥溫度越高,產(chǎn)生不良現(xiàn)象越明顯;干燥不充分也會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)品發(fā)生霉變,影響產(chǎn)品品質(zhì)[19],綜合考慮干燥溫度和時(shí)間對(duì)干燥能耗成本的影響,將干燥的最佳條件選擇為50 ℃,干燥4 h。

圖1 不同溫度下芡實(shí)皮渣的干燥曲線Fig.1 Drying curve of the pomace ofEuryale ferox pericarp residue at different temperatures 注:a.失水率-時(shí)間曲線;b.失水速率-時(shí)間曲線。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

如圖2所示,以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)(X),吸光值為縱坐標(biāo)(Y),進(jìn)行線性回歸,得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)應(yīng)方程為Y=0.0079X-0.0005,R2=0.9962,在0～100 μg/mL內(nèi)線性良好。

圖2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of glucose

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如圖3a所示,料液比為1∶10時(shí)得率最小,為26.23%,料液比為1∶40時(shí)得率最高,為27.78%,總體來(lái)看料液比對(duì)多糖得率的影響變化幅度不明顯;如圖3b所示,隨著醇沉濃度的升高,多糖得率不斷增加,在醇沉為80%時(shí)得率達(dá)31.92%,隨著醇沉濃度的繼續(xù)升高,提取率升高幅度也不明顯;如圖3c所示,隨著浸提溫度的提升,多糖得率不斷升高,60 ℃時(shí)得率可達(dá)31.57%,若浸提溫度過(guò)高可能會(huì)使部分多糖的活性降低;如圖3d所示,隨著浸提時(shí)間的增加,多糖得率不斷提高,當(dāng)浸提時(shí)間達(dá)到40 min時(shí),得率最高,為41.32%;如圖3e所示,隨著浸提次數(shù)的增加,多糖得率不斷提高,當(dāng)浸提次數(shù)為3次時(shí),多糖得率最高可達(dá)40.33%。因此料液比選擇1∶20、1∶30、1∶40 (g∶mL)，浸提溫度選擇55、60、65 ℃，浸提時(shí)間選擇26、30、40 min，醇沉濃度選擇75%、80%、85%作為正交實(shí)驗(yàn)的水平。

圖3 單因素水平對(duì)多糖得率的影響Fig.3 Effect of single factor level on the polysaccharide yield注:a.料液比;b.醇沉濃度;c.浸提溫度;d.浸提時(shí)間;e.浸提次數(shù)。

2.4 正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)優(yōu)化多糖提取工藝條件。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiment

由表2可以看出,各因素對(duì)芡實(shí)皮渣多糖得率的影響次序?yàn)镃>A>B>D,即浸提時(shí)間對(duì)多糖得率的影響最大,醇沉濃度對(duì)多糖得率的影響最小。各因素的最優(yōu)水平為A3B1C3D2,即料液比1∶40、浸提溫度55 ℃、浸提時(shí)間40 min、醇沉濃度80%,由于這一試驗(yàn)組合在正交表中7號(hào),且為得率最高,證明該工藝為最佳提取條件。

2.5 理化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果分析

2.5.1 理化性質(zhì) 從表3可以看出,多糖的顏色偏暗,色澤偏向紅黃,提取的芡實(shí)皮渣多糖純度可達(dá)82.67%,具有很強(qiáng)的吸水性和吸油性,吸水和吸油指數(shù)分別為(65.15±1.52)和(1.27±0.04) g/g。

表3 多糖的理化性質(zhì)Table 3 Physicochemical properties of polysaccharide

2.5.2 碘-碘化鉀反應(yīng)結(jié)果 芡實(shí)皮渣多糖的類別通過(guò)碘-碘化鉀反應(yīng)檢測(cè),結(jié)果未有藍(lán)色反應(yīng)發(fā)生,判斷芡實(shí)皮渣多糖為非淀粉類多糖。已有的研究表明,非淀粉類多糖(nonstarch polysaccharides,NSP)是由一系列理化性質(zhì)和生理功能不同的組分組成,具有降膽固醇、降血脂、防心血管疾病和增強(qiáng)免疫力等生理功效[20-21]。

2.5.3 多糖水解產(chǎn)物分析 通過(guò)HPLC分析芡實(shí)皮渣多糖的水解產(chǎn)物,結(jié)果如圖4所示,水解產(chǎn)物僅有一個(gè)較為明顯的峰,根據(jù)對(duì)照組單糖出峰時(shí)間,確定芡實(shí)皮渣多糖是由單一組分葡萄糖組成。芡實(shí)皮渣多糖的組成和芡實(shí)多糖的組成有所差異,陳蓉等對(duì)芡實(shí)多糖理化性質(zhì)進(jìn)行了相關(guān)研究,結(jié)果顯示芡實(shí)多糖的單糖組成為葡萄糖和鼠李糖[22]。

圖4 多糖水解產(chǎn)物的HPLC檢測(cè)圖Fig.4 HPLC detection chart of polysaccharide hydrolysate注:a.水解產(chǎn)物;b.葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品。

2.5.4 多糖凝膠及其質(zhì)構(gòu)特性 如圖5所示,芡實(shí)皮渣多糖的黏度隨著濃度的增加而增加。隨著多糖濃度的增大,多糖溶液逐漸形成了凝膠。當(dāng)濃度為10 mg/mL時(shí),溶液很黏,但仍是溶液狀態(tài);在20 mg/mL的濃度時(shí),溶液黏度繼續(xù)增加,但仍未有凝膠形成;當(dāng)濃度增到30 mg/mL,多糖溶液無(wú)法流動(dòng),緊緊的吸附在離心管壁上,形成了凝膠。30 mg/mL的芡實(shí)皮渣多糖凝膠質(zhì)構(gòu)特性結(jié)果如表4所示,多糖凝膠的粘性很大,彈性較低,回復(fù)能力弱。

表4 多糖凝膠的質(zhì)構(gòu)特性Table 4 Gel texture characteristics of polysaccharide

圖5 多糖濃度與黏度的關(guān)系Fig.5 Relationship between polysaccharide concentration and viscosity

2.6 抗氧化活性分析

2.6.1 總還原力 抗氧化劑的還原力與其抗氧化性之間存在一定的關(guān)系,抗氧化劑是通過(guò)自身的還原作用給出電子而清除自由基,還原力越強(qiáng),抗氧化性越強(qiáng)。因此,可通過(guò)測(cè)定還原力來(lái)說(shuō)明其抗氧化活性的大小[23]。如圖6所示,芡實(shí)皮渣多糖和抗壞血酸VC的還原能力均隨著濃度的增加而增加,同等條件下,芡實(shí)皮渣多糖的總還原力要低于抗壞血酸VC。

圖6 多糖的總還原力Fig.6 Total reducing power of polysaccharides

2.6.2 對(duì)羥基自由基、DPPH自由基、超氧離子和亞硝酸鹽的清除能力 自由基是人體某些疾病和衰老發(fā)生的重要原因,當(dāng)人體內(nèi)自由基產(chǎn)生過(guò)多或清除過(guò)慢,會(huì)引起細(xì)胞氧化性損傷,加速衰老并誘發(fā)疾病[24]。通常,活性物質(zhì)的抗氧化作用歸因于其供氫能力,Wang等研究發(fā)現(xiàn),多糖中糖醛酸基團(tuán)的存在可以觸發(fā)異頭碳的氫原子,發(fā)生抗氧化反應(yīng)[25]。

羥基自由基(·OH)是生物系統(tǒng)中與細(xì)胞膜磷脂中的多不飽和脂肪酸分子發(fā)生反應(yīng)并對(duì)細(xì)胞造成損傷的最活躍的一種活性氧,被認(rèn)為是活性最強(qiáng)、毒性最大的自由基,是造成機(jī)體過(guò)氧化損傷的重要因素[26-27]。由圖7a可知芡實(shí)皮渣多糖對(duì)羥基自由基的清除能力呈現(xiàn)出良好的量效關(guān)系,多糖濃度為1.0 mg/mL時(shí),對(duì)羥基自由基清除率可達(dá)到35.56%。但同樣濃度下芡實(shí)皮渣多糖對(duì)羥基自由基的清除率要弱于VC。

圖7 芡實(shí)皮渣多糖對(duì)(a)羥基自由基、(b)DPPH自由基、(c)超氧離子和(d)亞硝酸鹽的清除能力Fig.7 Effects of polysaccharides on scavenging hydroxyl radical(a),DPPH radical(b),superoxide ion(c)and nitrite(d)reducing-antioxidant power

如圖7b所示,在芡實(shí)皮渣多糖濃度為0.2～1.0 mg/mL之間,其對(duì)DPPH自由基有明顯的清除作用,且隨著濃度升高,清除率不斷升高。當(dāng)濃度為1.0 mg/mL時(shí),芡實(shí)皮渣多糖對(duì)DPPH自由基的清除率可達(dá)到85.64%,和同濃度下的VC相當(dāng)。芡實(shí)皮渣多糖對(duì)DPPH自由基清除率IC50為0.307±0.008 mg/mL。

如圖7c所示,芡實(shí)皮渣多糖對(duì)超氧離子也有明顯的清除作用,且隨著濃度升高,清除率越高,當(dāng)多糖濃度為1.0 mg/mL時(shí),對(duì)超氧離子的清除率為34.88%。但同樣濃度下芡實(shí)皮渣多糖對(duì)超氧離子的清除率要弱于VC。

如圖7d所示,當(dāng)芡實(shí)皮渣多糖濃度為1.0 mg/mL時(shí),對(duì)亞硝酸鹽的清除率為20.63%,呈現(xiàn)出其對(duì)亞硝酸鹽具有一定的清除能力,但同等濃度下對(duì)亞硝酸鹽的清除率要弱于VC。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以芡實(shí)皮渣為研究對(duì)象,通過(guò)對(duì)芡實(shí)皮渣的干燥條件進(jìn)行研究,確定其最佳的干燥條件,延長(zhǎng)其貯藏期。通過(guò)對(duì)芡實(shí)皮渣多糖的分離提取、理化性質(zhì)、黏性和凝膠性展開研究,獲取其最佳的提取工藝,明確其理化性質(zhì)。通過(guò)測(cè)定多糖的總還原力,以及多糖對(duì)羥基自由基、DPPH自由基、超氧離子和亞硝酸鹽的清除能力,綜合評(píng)價(jià)了芡實(shí)皮渣多糖的體外抗氧化特性。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,芡實(shí)皮渣在50 ℃條件下干燥4 h,能夠有效的將含水量控制在14%以內(nèi),易于長(zhǎng)期保存,且該條件下的干燥所需能耗最低,可節(jié)約干燥成本。利用干燥的芡實(shí)皮渣作為研究對(duì)象,從中提取多糖,并經(jīng)過(guò)單因素和正交試驗(yàn)獲得最佳提取工藝為料液比1∶40、浸提溫度55 ℃、浸提40 min、醇沉濃度80%,提取3次,此時(shí)得率可達(dá)45.94%,純度82.67%。

碘-碘化鉀反應(yīng)顯示該多糖屬于非淀粉類多糖,可能具有一定的預(yù)防疾病和增強(qiáng)免疫力等方面的應(yīng)用潛力,多糖的基本結(jié)構(gòu)單元為單一組分葡萄糖,和芡實(shí)種仁多糖的組分有所差異。該多糖具有很強(qiáng)的吸水性和吸油性,分別達(dá)(65.15±1.52)和(1.27±0.04) g/g,因此可以在化妝品等領(lǐng)域具有一定的應(yīng)用潛力。同時(shí)該多糖還表現(xiàn)出一定的總還原力以及對(duì)羥基自由基、DPPH自由基、超氧離子和亞硝酸鹽的清除能力,可在食品添加劑和保健醫(yī)藥領(lǐng)域發(fā)揮應(yīng)用價(jià)值。

我國(guó)的芡實(shí)種植面積廣泛,芡實(shí)資源豐富,而芡實(shí)皮渣作為一種芡實(shí)加工過(guò)程中的廢棄物,廉價(jià)易得,本研究為芡實(shí)加工副產(chǎn)物的綜合開發(fā)利用提供了新的思路,既可以為芡實(shí)皮渣多糖在食品添加劑、化妝品和保健醫(yī)藥等應(yīng)用領(lǐng)域的開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ),又能為芡實(shí)加工產(chǎn)業(yè)鏈的延伸提供可能性。