李華健,陳 韜,楊波若,李燕清,卞健科,舒國濤
(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,云南 昆明 650201)
中國是豬肉生產(chǎn)和消費(fèi)大國,2018年豬肉產(chǎn)量達(dá)5 404萬 t,約占世界豬肉總產(chǎn)量(1.13億 t)的48%[1],豬肉品質(zhì)的優(yōu)劣直接影響著我國肉類工業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。肉的持水性即肉類保持自身水分和人為加入水分的能力[2-3],是影響肉品質(zhì)量和企業(yè)經(jīng)濟(jì)效益的主要指標(biāo)之一,業(yè)內(nèi)常用汁液流失率來反映肉的持水性[4-5]。據(jù)估計(jì),肉的汁液流失率每增加1%就可能給一個大型肉類加工廠每天造成數(shù)千元的經(jīng)濟(jì)損失[6]。所以,汁液流失形成的機(jī)制和控制技術(shù)一直是肉類科學(xué)研究的熱點(diǎn)。其中,肌肉微結(jié)構(gòu)變化與持水性的關(guān)系是主要研究方向之一。Huff-Lonergan等[7-8]提出肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的改變可以控制肌細(xì)胞和肌肉中水分的保留或損失,其認(rèn)為宰后僵直過程中肌細(xì)胞間和肌束間空隙(又稱為汁液流失通道)的形成會導(dǎo)致較多的汁液流失;李俠等[9]觀察到豬肉貯藏過程中纖維束間隙增大,不易流動水逐漸態(tài)變?yōu)樽杂伤?,肉的持水性降低;Sch?fer等[10]的研究表明肌細(xì)胞外間隙面積的變化解釋了汁液流失率變異的39%。由于大多數(shù)研究采用光學(xué)顯微鏡觀測肌肉微觀結(jié)構(gòu),不能分清汁液流失通道形成于肌細(xì)胞內(nèi)還是肌細(xì)胞外,所以,汁液流失通道形成位置依然存在爭議。如Kristensen[11]和Bertram[12]等認(rèn)為汁液流失通道形成于肌細(xì)胞外,而Lawson等[13]的汁液流失通道形成假說則認(rèn)為汁液流失通道形成于肌細(xì)胞內(nèi)。近年來,低場核磁共振技術(shù)被廣泛應(yīng)用于肉與肉制品的水分狀態(tài)和含量的測定及相關(guān)研究中[14]。Han Minyi等[15]通過研究發(fā)現(xiàn)低場核磁共振的橫向弛豫時間(T2)和豬肉肌原纖維蛋白凝膠微觀結(jié)構(gòu)變化具有良好的相關(guān)性。因此,本研究結(jié)合透射電子顯微鏡和低場核磁共振技術(shù)測定肌原纖維與肌細(xì)胞膜之間的距離(肌細(xì)胞內(nèi)間隙)、肌細(xì)胞之間的距離(肌細(xì)胞外間隙)和不同狀態(tài)水分的相對含量,分析它們與汁液流失率的關(guān)系,以便更好地了解汁液流失形成的原因。
選擇品種相同、 飼養(yǎng)條件相同、 體質(zhì)量((105±5)kg)相似的商品肉豬在曲靖市某商業(yè)屠宰廠進(jìn)行屠宰。
體積分?jǐn)?shù)25%戊二醛、乙醇(均為分析純) 廣東西隴化工廠;丙酮(分析純) 湖北齊飛醫(yī)藥化工有限公司;環(huán)氧樹脂(Epon-618) 天門恒昌化工有限公司;檸檬酸鉛 湖北津樂達(dá)化工有限公司;醋酸鈾 北京中科光析化工技術(shù)研究所;四氧化鋨 山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司;二甲苯(分析純) 上海試劑廠;甲醛(分析純) 汕頭市達(dá)濠精細(xì)化學(xué)品有限公司。
H I 9 0 2 5 C 便攜式p H 計(jì) 意大利哈納公司;CR-400/410色差儀 日本美能達(dá)公司;JEM-1011透射電子顯微鏡 日本電子株式會社;R型超薄切片機(jī)切片德國徠卡公司;NMI20-Analyst核磁共振成像分析儀上海紐邁電子科技有限公司;1、2 cm雙片刀由實(shí)驗(yàn)室自制。
1.3.1 生鮮豬肉的處理及分組
按照Warner等[16]的方法,根據(jù)宰后45 min的pH值和肉色選擇出10 條疑似正常背最長肌肉和10 條疑似PSE(pale, soft, exudative)背最長肌肉。于宰后不同時間點(diǎn)用背最長肌測定相關(guān)指標(biāo),根據(jù)汁液流失率大小經(jīng)聚類分析,將樣品分為高汁液流失率組和低汁液流失率組。
1.3.2 pH值和肉色的測定
采用王娟等[17]的方法,在宰后45 min和24 h分別測定背最長肌的pH值、亮度(L*)、紅度(a*)和黃度(b*)。每個樣品測量3 次取平均值。
1.3.3 低場核磁共振測定肌肉中水分分布
在宰后12 h和24 h取背最長肌,參照黃子信等[18]的方法測定,具體操作修改如下:重復(fù)掃描次數(shù)為8、重復(fù)采樣等待時間為3 500 ms、模擬增益為20、數(shù)字增益為3、回波個數(shù)為2 000、譜寬為100 kHz。油樣預(yù)熱儀器30 min后,沿肌纖維方向?qū)⑷鈽臃指畛? cm(長)×1 cm(寬)×1 cm(高)大小的肉樣(約2.0 g),放入核磁小管中并在管口用塑封膜包住,在32 ℃、19 MHz共振頻率下,使用弛豫時間編輯CPMG(Carr-Purcell-Meiboom-Gill)脈 沖 序 列 ( 9 0 ° 脈 沖 和1 8 0 ° 脈 沖 之 間 的 時 間τ=200 μs)進(jìn)行測定,反演得到不同狀態(tài)水的相對峰面積比例(相對含量),每個樣品測定3 次,取平均值。
1.3.4 透射電子顯微鏡觀測肌肉微觀結(jié)構(gòu)變化
宰后45 min,3、9、12 h和24 h在背最長肌上切取4 mm(長)×2 mm(寬)×2 mm(高)的肉樣放入體積分?jǐn)?shù)3.5%戊二醛溶液中固定,保藏在4 ℃環(huán)境中,用于透射電子顯微鏡觀測。樣品的處理參照Luo Xin等[19]的方法,即在4 ℃環(huán)境中,將固定好的各時間點(diǎn)樣品用0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.2)沖洗3 次,每次10 min。之后用體積分?jǐn)?shù)為1%的鋨酸后固定1.5 h,分別用體積分?jǐn)?shù)為50%、70%、80%、90%和100%的乙醇進(jìn)行逐級脫水,每次15 min。用Epon-618滲透包埋,采用超薄切片機(jī)切片,經(jīng)醋酸鈾、檸檬酸鉛雙染色后用透射電子顯微鏡放大4 000 倍對每個樣品拍攝5 張圖片,使用Image-Pro Plus 5.1軟件測定肌細(xì)胞內(nèi)外間隙的平均距離。
1.3.5 汁液流失率的測定
參照Honikel等[20]的方法測定汁液流失率,并略作修改:宰后24 h,在13肋處切取2.5 cm厚背最長肌一片,稱質(zhì)量m1,懸于塑料袋中,充氣,肉樣不能和塑料袋接觸,在4 ℃下吊掛24 h,取出稱質(zhì)量m2,汁液流失率按下式計(jì)算。
采用SPSS 19.0軟件計(jì)算數(shù)據(jù),以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,并進(jìn)行Duncan多重比較、獨(dú)立性T檢驗(yàn)、Pearson相關(guān)性分析和逐步回歸分析。P<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析之前先對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn),根據(jù)GB/T 4882—2001《數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)處理和解釋正態(tài)性檢驗(yàn)》[21],只有宰后45 min的肌細(xì)胞內(nèi)間隙不服從正態(tài)分布,經(jīng)lgx轉(zhuǎn)換后服從正態(tài)分布,使用轉(zhuǎn)換后的值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
根據(jù)樣品汁液流失率的大小進(jìn)行聚類分析。如圖1所示,當(dāng)歐氏距離增至10.5時,將20 個樣品分成高汁液流失率組(n=10)和低汁液流失率組(n=10),兩組汁液流失率的范圍分別為5.01%~6.36%和0.57%~3.98%。
圖1 樣品汁液流失率的聚類分析樹狀圖Fig. 1 Dendrogram obtained from cluster analysis of the drip loss rate of pork samples
如表1所示,宰后45 min,低汁液流失率組的pH值極顯著高于高汁液流失率組(P<0.01),L*值極顯著低于高汁液流失率組(P<0.01),此結(jié)果與何凡等[22]將不同品種羊肉分為不同滴水損失組所測得結(jié)果一致。Chmiel等[23]的研究也發(fā)現(xiàn),與正常肉相比,宰后24 h,汁液流失嚴(yán)重的PSE肉具有較低的pH值和較高的L*、a*和b*值。綜上,說明高低汁液流失率組之間的pH值和肉色存在一定的差異。
表1 高低汁液流失率組肉樣的肉質(zhì)指標(biāo)(n= 10)Table 1 Meat quality attributes of pork samples from high and low drip loss rate groups (n= 10)
利用低場核磁共振反演計(jì)算的各個峰面積比例可以反映樣品中不同狀態(tài)水分的比例,峰面積比例變化情況可以表征樣品中不同狀態(tài)水分的分布狀態(tài)和流動遷移情況[24]。圖2為低場核磁共振測定的T2反演圖譜,出峰位置位于T2b(0.1~10 ms)、T21(10~100 ms)和T22(100~1 000 ms),分別對應(yīng)結(jié)合水、不易流動水和自由水,將3 種狀態(tài)水的相對含量分別記為P2b、P21及P22。由于結(jié)合水與非水組分結(jié)合的牢固程度不同會導(dǎo)致結(jié)合水出現(xiàn)2 個信號峰[25]。對于該組分,根據(jù)陳琳莉等[25]的方法將兩個峰面積比例疊加后得到結(jié)合水相對含量P2b。
圖2 宰后12 h和24 h肉樣的T2弛豫時間分布Fig. 2 Distribution of T2 relaxation time in pork samples at 12 h and 24 h post-mortem
不同狀態(tài)水的相對含量如表2所示,在宰后12 h和24 h,結(jié)合水相對含量(P2b)在高、低汁液流失率組之間都沒有顯著差異(P>0.05);宰后24 h,高汁液流失率組的不易流動水相對含量(P21)極顯著低于低汁液流失率組(P<0.01),而自由水相對含量(P22)極顯著高于低汁液流失率組(P<0.01)。這與甄少波等[24]的研究結(jié)果一致,表明P21和P22與汁液流失率的關(guān)系較為密切,汁液流失率越高的肉,其P22越大,P21越小。
表2 肌肉中3 種狀態(tài)水分相對含量的變化Table 2 Changes in relative contents of three water states in muscle at different times post-mortem
從結(jié)構(gòu)上講,肌肉中的汁液流失與排水力(肌原纖維和細(xì)胞的收縮)、膜通透性、細(xì)胞骨架蛋白降解、汁液流失通道的形成以及蛋白質(zhì)之間的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)變化有關(guān)[4]。Mohan等[26]認(rèn)為宰后肌肉的僵直會對肌肉的超微結(jié)構(gòu)和品質(zhì)性狀(特別是質(zhì)構(gòu)、嫩度和持水性)產(chǎn)生顯著影響。由于僵直過程中肌原纖維橫向和縱向收縮,水從肌原纖維內(nèi)轉(zhuǎn)移到肌漿中,并由細(xì)胞膜維持在肌細(xì)胞內(nèi),使得肌細(xì)胞內(nèi)肌漿空間增大[4,27]。所以在本研究中觀察到肌細(xì)胞內(nèi)外間隙的增加。
如圖3所示,在宰后45 min,低汁液流失率組肉樣肌原纖維結(jié)構(gòu)排列緊密整齊,細(xì)胞膜附著在外肌原纖維上,只有輕微的分離(圖3A1);與此相反,高汁液流失率組肌細(xì)胞外間隙比低汁液流失率組大,肌原纖維之間相互分離,膜也呈現(xiàn)大面積分離(圖3A2);宰后12 h,低汁液流失率組肌細(xì)胞外間隙有所增加,肌細(xì)胞膜從外肌原纖維上分離(圖3B1),相對于低汁液流失率組,高汁液流失率組肌細(xì)胞膜與外肌原纖維呈現(xiàn)更大程度的分離,肌細(xì)胞外間隙也更大(圖3B2);宰后24 h,低汁液流失率組肌細(xì)胞膜呈現(xiàn)更大程度的分離,肌細(xì)胞外間隙也變得更大(圖3C1),高汁液流失率組肌細(xì)胞外間隙相對宰后12 h稍微變小,肌細(xì)胞膜依然呈現(xiàn)大面積的分離(圖3C2)。Veiseth-Kent等[28]對宰后13 d的牛肉微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察也發(fā)現(xiàn)肌束膜從肌纖維上脫離,肌纖維間產(chǎn)生空隙。Chmiel等[23]的研究結(jié)果表明,宰后24 h正常肉的肌肉組織還保持相對完整,而PSE肉的肌肉組織遭到破壞。說明宰后早期高汁液流失率肉樣比低汁液流失率肉樣的微觀結(jié)構(gòu)變化更明顯。
圖3 宰后45 min(A)、12 h(B)和24 h(C)不同汁液流失率肉樣的透射電子顯微鏡圖Fig. 3 Transmission electron micrographs of muscle samples with different drip loss rate at 45 min (A), 12 h (B) and 24 h (C) post-mortem
為量化宰后豬肉肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化,使用圖像分析軟件Image-Pro Plus 5.1對肌細(xì)胞內(nèi)間隙和肌細(xì)胞外間隙進(jìn)行測量。如表3所示,低汁液流失率組的肌細(xì)胞內(nèi)外間隙在宰后逐漸增大,宰后12 h和24 h沒有顯著差異,但都顯著大于宰后45 min的肌細(xì)胞內(nèi)外間隙(P<0.05)。高汁液流失率組肌細(xì)胞內(nèi)外間隙宰后的變化不同于低汁液流失率組,高汁液流失率組的肌細(xì)胞內(nèi)間隙在宰后12 h達(dá)到最大,而后呈減小趨勢,肌細(xì)胞外間隙在宰后12 h達(dá)到最大,在宰后24 h顯著減?。≒<0.05)。Sch?fer等[10]的研究也發(fā)現(xiàn)肌纖維束之間的空隙面積在3~9 h逐漸增大,在9~24 h減小??赡苁怯捎诠羌艿鞍捉到廨^快使得肌原纖維間連接遭到破壞產(chǎn)生橫向膨脹[4,11],導(dǎo)致汁液流失率高的肉肌細(xì)胞內(nèi)外間隙減小。
高汁液流失率組的肌細(xì)胞內(nèi)間隙在宰后45 min顯著大于低汁液流失率組(P<0.05)。高汁液流失率組的肌細(xì)胞外間隙在宰后9 h 顯著大于低汁液流失率組(P<0.05)。表明宰后高汁液流失率組的肌原纖維收縮更快,形成的空隙更大。這與Hughes等[27]認(rèn)為汁液流失率高的肉肌原纖維結(jié)構(gòu)收縮更快,細(xì)胞外空隙面積更大的觀點(diǎn)一致。較大的空隙會導(dǎo)致肌細(xì)胞外毛細(xì)管力減弱,使得肌細(xì)胞外自由水容易形成汁液流失[29]。采用低場核磁共振觀察到高汁液流失率組的P22高于低汁液流失率組(表2)也證實(shí)了這一現(xiàn)象。
表3 兩組肉樣肌細(xì)胞內(nèi)外間隙的差異(n=10)Table 3 Intra- and extracellular spaces in muscle samples from low and high drip loss groups (n= 10)
表4 肌細(xì)胞內(nèi)外間隙、不同狀態(tài)水分相對含量和汁液流失率間的相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis of intra- and extracellular spaces of myocytes with relative contents of three water states and drip loss rate
魏秀麗等[30]的研究結(jié)果表明結(jié)合水與不易流動水呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01),不易流動水與自由水呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01),不同狀態(tài)水之間存在相互“態(tài)變”。本研究結(jié)果與之相似(表4),在宰后12 h,P2b與P21呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05),P21與P22呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)。在宰后24 h,P2b與P22呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05),P21與P22呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)。結(jié)果表明3 種狀態(tài)水確實(shí)如魏秀麗等[30]所述,結(jié)合水會“態(tài)變”為不易流動水,不易流動水與自由水可以發(fā)生相互“態(tài)變”。
肌細(xì)胞內(nèi)間隙在宰后45 min與宰后12 h和24 h的P21呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05,P<0.01)(表4)。肌細(xì)胞外間隙在宰后45 min與宰后12 h的P21呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05),在宰后9 h與宰后24 h的P21呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)(表4)。宰后9 h的肌細(xì)胞外間隙解釋了宰后24 hP21變異的15.7%(表5),相關(guān)系數(shù)=標(biāo)準(zhǔn)偏回歸系數(shù)=-0.449。說明宰后9 h的肌細(xì)胞外間隙對宰后24 h的不易流動水影響最大,肌細(xì)胞外間隙越大,不易流動水含量越少。
宰后45 min的肌細(xì)胞內(nèi)間隙與宰后12 h和24 h的P22呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)(表4),解釋了宰后24 hP22變異的24.8%(表5)。說明在肌細(xì)胞內(nèi)外間隙中,宰后45 min的肌細(xì)胞內(nèi)間隙對P22的直接影響較大,宰后45 min的肌細(xì)胞內(nèi)間隙越大自由水含量越多。
表5 肌細(xì)胞內(nèi)外間隙解釋宰后24 h的P21和P22變異的逐步回歸模型Table 5 Stepwise regression models for explaining variation in P21 and P22with intra- and extracellular spaces of myocytes
肌細(xì)胞內(nèi)間隙在宰后45 min和3 h與汁液流失率呈顯著正相關(guān)(P<0.05,P<0.01),肌細(xì)胞外間隙在宰后9 h與汁液流失率呈顯著正相關(guān)(P<0.05)(表4)。宰后45 min的肌細(xì)胞內(nèi)間隙解釋了汁液流失率變異的45.3%(表6)。說明宰后45 min的肌細(xì)胞內(nèi)間隙對汁液流失率的貢獻(xiàn)較大,且標(biāo)準(zhǔn)偏回歸系數(shù)和相關(guān)系數(shù)都為正,表明宰后45 min的肌細(xì)胞內(nèi)間隙越大,汁液流失率越高。
P2b在宰后12 h和24 h與汁液流失率均沒有顯著相關(guān)性(P>0.05),P21與汁液流失率呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.0 1),P22與汁液流失率呈顯著正相關(guān)(P<0.05,P<0.01)(表4)。表明結(jié)合水與汁液流失率關(guān)系不大,不易流動水和自由水會對汁液流失率產(chǎn)生顯著影響,這與王娟[17]、魏心如[31]和Bertram[32-33]等的研究結(jié)果一致。繼續(xù)將宰后12 h和24 h時3 種狀態(tài)水的相對含量與汁液流失率建立逐步回歸模型(表6),結(jié)果只有宰后24 h的P22進(jìn)入模型,解釋了汁液流失率變異的39.5%,標(biāo)準(zhǔn)偏回歸系數(shù)達(dá)0.655,相關(guān)系數(shù)為0.646。表明3 種狀態(tài)水中自由水對汁液流失率的影響最大,自由水越多,汁液流失率越高。
表6 肌細(xì)胞內(nèi)外間隙和不同狀態(tài)水分相對含量解釋汁液流失率變異的逐步回歸模型Table 6 Stepwise regression models for explaining variation in drip loss rate with intra- and extracellular spaces of myocytes and relative contents of different water states
生鮮豬肉在僵直過程中,肌原纖維的收縮會導(dǎo)致肌細(xì)胞內(nèi)和肌細(xì)胞外都形成汁液流失通道。高汁液流失率樣品的肌細(xì)胞內(nèi)間隙形成較早,高、低汁液流失率組的肌細(xì)胞內(nèi)間隙在宰后45 min已有明顯差異,而肌細(xì)胞外間隙在宰后9 h才有差異。宰后45 min的肌細(xì)胞內(nèi)間隙可以較好地解釋自由水含量和汁液流失率的變異,宰后45 min的肌細(xì)胞內(nèi)間隙越大,后期肌肉中自由水含量越多,汁液流失率越高,持水性越差。