孫婷婷 張 航

（長(zhǎng)春市食品藥品檢驗(yàn)中心，吉林長(zhǎng)春 130012）

狗骨為犬科動(dòng)物的干燥骨骼。將狗處死后，剝?nèi)テと猓」?，剔凈殘余的筋、肉，陰干。狗骨中富含的蛋白質(zhì)在一定條件下充分水解成多種氨基酸，根據(jù)不同氨基酸的極性大小，用合適的展開劑在薄層色譜板上進(jìn)行分離，并噴以顯色劑加熱使斑點(diǎn)清晰明顯，易于觀察。薄層色譜法可以很好地分離氨基酸，使之呈現(xiàn)一定的特征色譜圖[1-2]。因狗骨藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)缺失，暫時(shí)沒有完善的國家標(biāo)準(zhǔn)能夠?qū)ζ溥M(jìn)行有效的質(zhì)量控制，嚴(yán)重制約該品種的深入開發(fā)，完善該藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，控制藥材質(zhì)量為狗骨藥材的開發(fā)和廣泛應(yīng)用提供質(zhì)量保證。本文參照中國藥典薄層色譜法對(duì)其進(jìn)行鑒別研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明所建立方法易于操作，結(jié)果準(zhǔn)確，重現(xiàn)性良好，可作為狗骨藥材鑒別的質(zhì)控方 法。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

狗骨藥材部分為自行購買，購自延吉、吉林，部分為藥廠提供。豬骨、牛骨購自長(zhǎng)春。

通過考察提取溶劑，超聲時(shí)間，溶劑體積，供試品取樣量來確定供試品的制備方法。采用11 種常見氨基酸，蘇氨酸、精氨酸、亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、酪氨酸、谷氨酸對(duì)照品和自制的對(duì)照藥材作為對(duì)照組，進(jìn)行顯色斑點(diǎn)的比較，來確定合適的對(duì)照品和對(duì)照藥材。通過考察展開劑點(diǎn)樣量來確定薄層板的色譜條件。最后考察狗骨與易混淆品豬骨、牛骨的區(qū)別，驗(yàn)證此方法的專屬性，并考察溫濕度和不同廠家薄層板的影響，驗(yàn)證此方法的耐用性。

1.2 方法

取本品粉末1 g，加70%乙醇5 mL，超聲處理15 min，濾過，濾液作為供試品溶液。另取狗骨對(duì)照藥材1g，同法制成對(duì)照藥材溶液。再取纈氨酸對(duì)照品，加70%乙醇制成每1 mL 含0.25 mg 的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（《中國藥典》2015 年版四部通則0502）試驗(yàn)，分別吸取供試品溶液和對(duì)照藥材溶液各5μL，對(duì)照品溶液4μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水（3 ∶1 ∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以茚三酮試液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑 點(diǎn)。

供試品制備的考察方法：按上述方法，稱取供試品，分別考察提取溶劑為70%乙醇5 mL，超聲15 min，甲醇5 mL，超聲15 min，6 mol/L 鹽酸10 mL，加熱回流1 h 時(shí)供試品的水解程度；分別考察超聲10 min、15 min、20 min 時(shí)供試品的水解情況；分別考察溶劑體積為3 mL，5 mL，8 mL時(shí)供試品的水解程度；分別考察供試品取樣量為0.5 g，1 g，1.5 g 時(shí)斑點(diǎn)的大小及分離情況。

對(duì)照品與對(duì)照藥材的考察：按上述方法，稱取供試品，與10 種常見氨基酸，蘇氨酸、精氨酸、亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、酪氨酸、谷氨酸對(duì)照品和自制的對(duì)照藥材，點(diǎn)于同一硅膠G 板上，觀察薄層色譜分離情況[3-4]。

薄層方法的考察：按上述方法，分別選擇硅膠G 薄層板與硅膠H 薄層板按上述方法進(jìn)行考察，均來自青島海洋化工廠分廠；參考有關(guān)文獻(xiàn)，選擇了三種展開劑采用上述方法進(jìn)行考察，分別為正丙醇-氨水（2 ∶1）；異戊醇-冰醋酸-水（18 ∶5 ∶3）；正丁醇-冰醋酸-水（3 ∶1 ∶1）；考察不同點(diǎn)樣量下分離的效果，分別量取不同的點(diǎn)樣量，對(duì)照品點(diǎn)樣量分別為2μL、5μL、10μL，對(duì)照藥材點(diǎn)樣量分別為2μL、5μL、10μL，供試品點(diǎn)樣量分別為2μL、5μL、10μL，觀察薄層色譜分離情況。

專屬性考察（豬、牛骨）：分別取樣品和易混淆品豬骨、牛骨，另取對(duì)照藥材，按上述方法操作，通過觀察色譜斑點(diǎn)的區(qū)別來考察方法的專屬性。

耐用性考察：采用上述方法，對(duì)三家不同廠家的硅膠預(yù)制薄層板（青島海洋化工廠分廠，批號(hào)：20150909；煙臺(tái)市化學(xué)工業(yè)研究所，批號(hào)：20160920；青島海浪硅膠干燥劑有限公司，批號(hào)：20130308）的展開效果進(jìn)行考察。對(duì)不同展開溫度（9℃、18℃、30℃）和相對(duì)濕度（18%、38%、75%）進(jìn)行考察，以確定方法的耐用性。

2 結(jié)果

結(jié)果表明，提取溶劑為70%乙醇，超聲提取15 min，提取溶劑體積為5 mL，供試品稱樣量為1 g 時(shí)，提取效果較好，斑點(diǎn)清晰，故選擇提取溶劑為70%乙醇[5-6]，選擇超聲時(shí)間為15 min，選擇溶劑體積為5 mL，選擇稱樣量為1 g。供試品在與纈氨酸對(duì)應(yīng)的位置顯顏色相同的斑點(diǎn)，且分離效果較好，斑點(diǎn)清晰，其余氨基酸斑點(diǎn)有重疊或不清晰，故選擇纈氨酸作為對(duì)照品。并加入對(duì)照藥材作為對(duì)照[7]。采用硅膠G 薄層板分離效果更好，斑點(diǎn)更清晰，故選擇硅膠G 薄層板。展開劑為正丁醇-冰醋酸-水（3 ∶1 ∶1） 時(shí)，展開效果最好，斑點(diǎn)清晰，故選擇展開劑為正丁醇-冰醋酸-水（3 ∶1 ∶1）。對(duì)照品點(diǎn)樣量、對(duì)照藥材點(diǎn)樣量、供試品點(diǎn)樣量分別為5μL 時(shí)，展開效果最好，斑點(diǎn)清晰，故選擇對(duì)照品點(diǎn)樣量、對(duì)照藥材點(diǎn)樣量、供試品點(diǎn)樣量分別為5μL。專屬性考察色譜中斑點(diǎn)清晰且區(qū)別明顯，分離效果較好，該方法專屬性強(qiáng)，可用于鑒別狗骨與易混淆品豬骨、牛骨。高效板的分離效果最好，其余兩家薄層板斑點(diǎn)較清晰，也可達(dá)到分離效果，不同溫濕度條件下，均可得到清晰斑點(diǎn)，該方法耐用性較好。

取10 批樣品各1 g，加70%乙醇5 mL，超聲處理15 min，濾過，濾液作為供試品溶液。另取狗骨對(duì)照藥材1 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。取纈氨酸對(duì)照品，加70%乙醇制成每1 mL 含0.25 mg 的溶液，作為對(duì)照品溶液[8]。照薄層色譜法（中國藥典2015 年版四部通則0502）試驗(yàn)，吸取上述溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水（3 ∶1 ∶1）為展開劑，展開、取出、晾干、噴以茚三酮試液，以105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果表明，10 批樣品均可得到清晰圓整的斑點(diǎn)，色譜分離情況較好。

3 討論

根據(jù)方法學(xué)驗(yàn)證研究，分別對(duì)可能影響薄層色譜結(jié)果的條件進(jìn)行考察，包括供試品制備的條件，薄層方法的條件，對(duì)照品與對(duì)照藥材的選擇，專屬性和耐用性的考察，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，用70%乙醇超聲提取的方法制備供試品，操作容易較簡(jiǎn)便，能將狗骨中含有的蛋白質(zhì)充分水解成不同種類的氨基酸，并利用其極性大小的不同，在薄層板上呈現(xiàn)不同的Rf 值，通過展開劑為正丁醇-冰醋酸-水（3 ∶1 ∶1）的薄層方法在薄層硅膠G 板上清晰分離，噴以茚三酮試液，加熱使斑點(diǎn)清晰明顯，以便觀察，呈現(xiàn)一定的特征色譜圖，來用于狗骨藥材的鑒別。各種氨基酸在此條件下進(jìn)行展開，有些是相互重疊的，因此參考相關(guān)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，選擇纈氨酸作為對(duì)照品。其中易混淆品豬骨、牛骨，雖然在性狀上具有相似的特征，但在薄層色譜鑒別條件下不具有狗骨的特征斑點(diǎn)，此方法可更好地用來鑒別不同動(dòng)物骨。另外，狗骨的來源除了農(nóng)村家養(yǎng)外，尚有養(yǎng)狗場(chǎng)提供肉狗，資源較豐富，因此使用其他非肉狗類狗骨如寵物狗、警犬等的可能性較少。需要注意的是，為防止已被煎煮過的狗骨混雜其中，影響藥材蛋白質(zhì)含量，使薄層色譜分離效果變差，建議在收購時(shí)宜整架收購，或直接去屠宰場(chǎng)收購。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：狗骨藥材薄層鑒別方法簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，耐用性好，專屬性強(qiáng)，并且樣品中的油脂等其他成分不影響測(cè)定結(jié)果，可作為狗骨藥材鑒別的準(zhǔn)確方法。該方法的研究十分有利于狗骨藥材的深入開發(fā)，為制訂狗骨藥材的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)奠定基礎(chǔ)，并完善該藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，控制藥材質(zhì)量，更好的保證中成藥的質(zhì)量、保障人民用藥安全，同時(shí)也為狗骨藥材的開發(fā)和廣泛應(yīng)用提供質(zhì)量保 證。

本實(shí)驗(yàn)還表明，狗骨蛋白質(zhì)含量較高，具有一定的藥用價(jià)值。中醫(yī)中藥研究表明：狗骨具有補(bǔ)腎壯骨，祛風(fēng)止痛，止血止痢，斂瘡生肌。治風(fēng)濕痛，腰腿無力，四肢麻木，久痢，瘡瘺，凍瘡的功效。并且炮制后使藥物純凈，酒制去除腥臭味，增強(qiáng)藥用功效。煅制狗骨使藥物質(zhì)地疏脆，易于粉碎，便于調(diào)劑、制劑。關(guān)于狗骨的炮制品鑒別研究還有待進(jìn)一步深入。