miR-146a調(diào)控TGF-β/SMAD2信號(hào)通路對(duì)膝關(guān)節(jié)韌帶損傷的影響

王 振，杜異凡，袁贊安，鄺歡歡，位付濤

(聯(lián)勤保障部隊(duì)第九八八醫(yī)院骨科，河南 鄭州 450042)

膝關(guān)節(jié)是人體承受重力最多的關(guān)節(jié)，起著重要的支撐作用[1]。膝關(guān)節(jié)韌帶損傷是由膝關(guān)節(jié)和韌帶超負(fù)荷受力引起。近年來，膝關(guān)節(jié)損傷發(fā)生率有增加的趨勢(shì)。在膝關(guān)節(jié)韌帶損傷中內(nèi)側(cè)副韌帶損傷通常較嚴(yán)重，且傷后其愈合能力較低，若未進(jìn)行及時(shí)有效的治療會(huì)引起創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎等膝關(guān)節(jié)疾病，導(dǎo)致患者需要行內(nèi)側(cè)副韌帶移植[2-3]。但由于移植物來源及數(shù)量有限等缺點(diǎn)，故膝關(guān)節(jié)韌帶損傷的治療非常棘手。目前，轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)是較高效的促纖維化因子，創(chuàng)傷后一般可依靠TGF-β信號(hào)來促進(jìn)瘢痕增生[4]。應(yīng)力可調(diào)控TGF-β1的表達(dá)，又可激活下游的SMAD2，并調(diào)節(jié)韌帶干細(xì)胞的生長和遷移。TGF-β/SMAD2信號(hào)通路可調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄后的mRNA也可調(diào)控TGF-β/SMAD2信號(hào)傳導(dǎo)通路的相關(guān)基因[5-6]。有研究顯示，miR-146a可改善關(guān)節(jié)損傷，其高表達(dá)可減少骨組織破壞，但由于影響內(nèi)側(cè)副韌帶損傷的因素較多，miRNA對(duì)膝關(guān)節(jié)韌帶損傷的研究機(jī)制并不完善[7-8]。因此，本研究通過建立兔膝關(guān)節(jié)韌帶損傷模型，探究miR-146a是否通過調(diào)控TGF-β/SMAD2信號(hào)通路對(duì)膝關(guān)節(jié)韌帶損傷產(chǎn)生影響，以期為膝關(guān)節(jié)韌帶損傷的治療提供更有效的方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選擇兔齡12周左右的雄性新西蘭兔32只，體質(zhì)量2～2.2 kg，購自聯(lián)勤保障部隊(duì)第九八八醫(yī)院，在SPF級(jí)動(dòng)物房中分籠飼養(yǎng)，室溫維持在22oC左右，晝夜交替循環(huán)，自由攝食飲水。

1.2 試劑與儀器

石蠟切片機(jī)(德國LETIZ公司)；光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；蘇木素伊紅染色試劑(北京京試化學(xué)試劑公司)；戊巴比妥鈉(天津藥業(yè)焦作有限公司)；碘伏(北京京試化學(xué)試劑公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TakaRa公司)；miR-146 mimic(北京英格恩生物科技有限公司)。

1.3 動(dòng)物模型與分組

將32只兔平均分為假手術(shù)組、模型組、安慰劑組及miR-146 mimic組，各組兔禁食1 d后用于實(shí)驗(yàn)。造模前所有兔禁水10～16 h。假手術(shù)組只切開皮膚并縫合，但不損傷前交叉韌帶。對(duì)模型組、安慰劑組及miR-146 mimic組兔進(jìn)行交叉韌帶切斷術(shù)，首先于兔耳緣靜脈注射10%水合氨醛3 mL/kg進(jìn)行麻醉，在兔的右膝關(guān)節(jié)作2 cm的切口，暴露髕骨并脫離，使膝關(guān)節(jié)最大程度彎曲，暴露前交叉韌帶并全部剪斷，然后用生理鹽水反復(fù)清洗干凈，逐層縫合，建模成功。miR-146 mimic組在建模成功后3 d，關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射1 mg/kg的miR-146 mimic，連續(xù)注射4周。安慰劑組將關(guān)節(jié)腔注射液替換為等量生理鹽水，其余處理與miR-146 mimic組相同。術(shù)后所有兔均正常飼養(yǎng)，可自由活動(dòng)，每天肌肉注射1次頭孢唑啉(1.0 mg/kg)，連續(xù)注射3周。所有兔于術(shù)后第9周處死。

1.4 兔膝關(guān)節(jié)行為學(xué)觀察

參考改良的Lequesne MG膝關(guān)節(jié)級(jí)別評(píng)估方法，對(duì)各組兔進(jìn)行膝關(guān)節(jié)行為學(xué)評(píng)估(表1)。

表1 Lequesne MG評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.5 兔膝關(guān)節(jié)大體觀察

9周后停止對(duì)兔的干預(yù)，從每組兔中隨機(jī)取出6只處死，隨即進(jìn)行解剖，觀察兔膝關(guān)節(jié)的組織病理學(xué)表現(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 彭太平法組織病理學(xué)分級(jí)

1.6 內(nèi)側(cè)副韌帶取材及力學(xué)測試

內(nèi)側(cè)副韌帶取材：將兔處死后，取出膝關(guān)節(jié)部位及髕骨，保留好各處韌帶，用紗布包裹、密封，置于-20 ℃保存，備用。內(nèi)側(cè)副韌帶拉伸測試：測試前1 d取出樣本，于4 ℃解凍。測試時(shí)測量內(nèi)側(cè)副韌帶的長度、寬度和厚度，安裝防脫夾。生物材料在應(yīng)力作用下存在差異，實(shí)驗(yàn)前加上標(biāo)準(zhǔn)試樣、卸載重復(fù)15次，預(yù)調(diào)后進(jìn)行內(nèi)側(cè)副韌帶拉伸試驗(yàn)，并計(jì)算最大位移、最大應(yīng)力、最大應(yīng)變和強(qiáng)度模量[9]。

1.7 內(nèi)側(cè)副韌帶HE染色

用福爾馬林將內(nèi)側(cè)副韌帶組織固定72 h后進(jìn)行脫鈣處理，1周后進(jìn)行酒精梯度脫水，最后將組織浸泡在100%的酒精中1 h。脫水后的組織放入二甲苯溶液中浸泡1 h，隨后將組織置入石蠟中浸泡1 h并用石蠟包埋，切成厚度為5 μm的石蠟切片，再用熱水將組織燙平后烘干。將石臘切片置入二甲苯溶液中浸泡20 min，重復(fù)2次。再次酒精梯度脫水后用蒸餾水浸泡。伊紅染色后重新進(jìn)行梯度脫水，并再次放入二甲苯溶液中浸泡24 h，晾干后滴入中性樹脂并封固觀察。

1.8 Western blot檢測內(nèi)側(cè)副韌帶TGF-β和SMAD2蛋白表達(dá)

分離兔內(nèi)側(cè)副韌帶組織，剪成小塊，按照10∶1的比例加入裂解液并轉(zhuǎn)入EP管中，于4 ℃以14 000 r/min的速度離心10 min，離心后棄上清；隨后于95 ℃將蛋白熱浴變性10 min，后置于-80 ℃冰箱封存。將用BCA試劑盒定量后的蛋白樣品進(jìn)行電泳，電泳后將蛋白凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件為50 V、3 h。轉(zhuǎn)膜后將PVDF膜浸泡于TBST緩沖液中，搖晃1 h后孵育一抗，再用5%脫脂奶粉封閉1 h。再次用TBST漂洗10 min，反復(fù)3次。于36 ℃孵育二抗2 h后，使用TBST漂洗2次，TBS漂洗1次，每次10 min。使用ECL試劑檢測蛋白，在暗室進(jìn)行曝光，分析蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.9 qRT-PCR檢測內(nèi)側(cè)副韌帶TGF-β和SMAD2 mRNA的表達(dá)量

逆轉(zhuǎn)錄(RT)和定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)檢測各組兔內(nèi)側(cè)副韌帶組織中TGF-β及SMAD2的表達(dá)情況。按照RNase free dH2O 4.5 μL、5×RT反應(yīng)緩沖液2 μL、Randam primer 0.5 μL、Oligo dT 0.5 μL、反轉(zhuǎn)錄酶0.5 μL、RNA 2 μL進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。將cDNA樣品分成3份，每組總cDNA樣本稀釋20倍，取3 μL cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。引物序列見表3。

表3 qRT-PCR引物序列

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 兔膝關(guān)節(jié)行為學(xué)觀察結(jié)果

假手術(shù)組、模型組、安慰劑組及miR-146 mimic組Lequesne MG評(píng)分分別為0分、(6.0±1.10)分、(6.1±1.23)分和(1.1±0.47)分。模型組、安慰劑組Lequesne MG評(píng)分顯著高于假手術(shù)組和miR-146 mimic組(P<0.05)，但模型組與安慰劑組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。假手術(shù)組兔膝關(guān)節(jié)無明顯疼痛，可正常活動(dòng)；模型組和安慰劑組兔膝關(guān)節(jié)有明顯收縮情況，且行走不穩(wěn)；miR-146 mimic組兔膝關(guān)節(jié)活動(dòng)度有明顯好轉(zhuǎn)，能正?；顒?dòng)。

2.2 兔膝關(guān)節(jié)大體觀察結(jié)果

假手術(shù)組兔膝關(guān)節(jié)軟骨正常，無明顯變化，且色澤光亮，軟骨無缺失，關(guān)節(jié)液清澈透明，滑膜為淡紅色，無充血和水腫情況發(fā)生；與假手術(shù)組兔比較，模型組及安慰劑組兔軟骨裂痕明顯，關(guān)節(jié)腔內(nèi)液體增多，充血嚴(yán)重；與模型組、安慰劑組比較，miR-146 mimic組兔關(guān)節(jié)腔內(nèi)液體、骨髓組織出血及結(jié)構(gòu)紊亂情況明顯減少/輕，膝關(guān)節(jié)活動(dòng)度明顯好轉(zhuǎn)，接近于假手術(shù)組(圖1)。

a：假手術(shù)組；b：模型組；c：安慰劑組；d：miR-146 mimic組圖1 兔膝關(guān)節(jié)大體觀察

2.3 內(nèi)側(cè)副韌帶拉伸試驗(yàn)結(jié)果

miR-146 mimic組的最大應(yīng)力和最大應(yīng)變較其他組更強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組、安慰劑組比較，假手術(shù)組和miR-146 mimic組最大位移明顯較長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但miR-146 mimic組和假手術(shù)組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與模型組、安慰劑組比較，假手術(shù)組和miR-146 mimic組強(qiáng)度模量較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表4。從結(jié)果可知，模型組和安慰劑組膝關(guān)節(jié)韌帶拉伸力學(xué)變化最大，miR-146 mimic組明顯好轉(zhuǎn)，提示miR-146a可有效改善這種拉伸力學(xué)特性。

表4 兔膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)副韌帶拉伸實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)比較

2.4 兔內(nèi)側(cè)副韌帶HE染色結(jié)果

假手術(shù)組兔HE染色顯示軟骨組織完整，表面平整，細(xì)胞排列有序；模型組和安慰劑組情況相似，軟骨表面有明顯的磨損，組織破壞嚴(yán)重，細(xì)胞較少且排列紊亂；miR-146 mimic組軟骨表面較為平整且完整，軟骨細(xì)胞排列規(guī)則，潮線較深且連續(xù)，見圖2。

2.5 Western blot檢測兔內(nèi)側(cè)副韌帶TGF-β和SMAD2蛋白表達(dá)

模型組及安慰劑組TGF-β和SMAD2蛋白表達(dá)明顯低于假手術(shù)組(P<0.05)，其中模型組相對(duì)于假手術(shù)組TGF-β蛋白含量減少60.5%，SMAD2蛋白含量減少78.3%。miR-146 mimic組TGF-β蛋白和SMAD2蛋白表達(dá)明顯高于模型組及安慰劑組(P<0.05)，其中miR-146 mimic組相對(duì)于安慰劑組TGF-β和SMAD2蛋白含量分別增加了59.8%和73.2%，均接近于假手術(shù)組，見圖3。

2.6 qRT-PCR檢測兔內(nèi)側(cè)副韌帶TGF-β和SMAD2 mRNA表達(dá)

與假手術(shù)組比較，模型組、安慰劑組兔內(nèi)側(cè)副韌帶TGF-β和SMAD2 mRNA表達(dá)明顯較少(P<0.05)；與模型組、安慰劑組比較，miR-146 mimic組TGF-β和SMAD2 mRNA表達(dá)明顯較多(P<0.05)，見圖4。

a：假手術(shù)組；b：模型組；c：安慰劑組；d：miR-146 mimic組圖2 兔膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)副韌帶HE染色(×400)

a:各組TGF-β和SMAD2蛋白表達(dá)電泳圖;b:各組TGF-β和SMAD2蛋白表達(dá)定量分析 *：與假手術(shù)組比較，P<0.05；#：與miR-146 mimic組比較，P<0.05圖3 兔內(nèi)側(cè)副韌帶TGF-β和SMAD2蛋白表達(dá)

3 討論

膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶是纖維軟骨與內(nèi)側(cè)副韌帶的結(jié)合，其中內(nèi)側(cè)副韌帶最薄，是常見的韌帶損傷部位[10-12]。內(nèi)側(cè)副韌帶損傷主要分為部分?jǐn)嗔押屯耆珨嗔?，部分?jǐn)嗔褳轫g帶實(shí)質(zhì)部的局部斷裂、局部血腫，會(huì)影響膝關(guān)節(jié)活動(dòng)；而完全斷裂為橫斷、斜面或縱形斷裂，會(huì)導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)失去聯(lián)系，喪失穩(wěn)定性[13]。膝關(guān)節(jié)韌帶的重塑一直是韌帶損傷修復(fù)關(guān)注的問題。研究顯示，調(diào)控miRNA對(duì)于韌帶損傷具有一定治療作用[14]，但具體調(diào)控機(jī)制尚不清楚。本研究通過建立兔膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)副韌帶損傷模型，觀察miR-146a轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子在膝關(guān)節(jié)韌帶中的凋亡和分化作用，發(fā)現(xiàn)TGF-β/SMAD2信號(hào)通路能對(duì)膝關(guān)節(jié)韌帶損傷的恢復(fù)起到一定的促進(jìn)作用。

有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在創(chuàng)傷后的修復(fù)中發(fā)揮著重要作用，相關(guān)靶基因通過調(diào)節(jié)miRNA促進(jìn)細(xì)胞的增殖，從而對(duì)韌帶損傷起到一定的修復(fù)作用[15]。本研究結(jié)果顯示，與模型組、安慰劑組比較，miR-146 mimic組兔患肢輕度痙攣、稍腫脹、能正常活動(dòng)；miR-146 mimic組最大應(yīng)變和最大位移明顯增加；膝關(guān)節(jié)韌帶拉伸力學(xué)明顯好轉(zhuǎn)，可見miR-146a可有效改善這種拉伸力學(xué)特性，對(duì)內(nèi)側(cè)副韌帶損傷的恢復(fù)有一定的促進(jìn)作用。有研究顯示miR-146a是先天性炎癥反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子，與細(xì)胞凋亡有關(guān)[16]；也有研究表明miR-146a在骨關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)軟骨損傷等多種骨關(guān)節(jié)疾病中起保護(hù)作用[17-18]。因此，本研究推測miR-146a對(duì)內(nèi)側(cè)韌帶損傷的保護(hù)作用可能通過直接或間接的方式抑制炎癥因子活性。

a:各組TGF-β mRNA的表達(dá)定量分析;b:各組SMAD2 mRNA表達(dá)定量分析 *：與假手術(shù)組比較，P<0.05；#:與miR-146 mimic組比較，P<0.05圖4 兔內(nèi)側(cè)副韌帶熒光檢測TGF-β和SMAD2 mRNA表達(dá)

本研究HE染色結(jié)果顯示，模型組、安慰劑組骨髓組織出血嚴(yán)重、結(jié)構(gòu)紊亂；與模型組比較，miR-146 mimic組骨髓組織出血及結(jié)構(gòu)紊亂情況明顯好轉(zhuǎn)。qRT-PCR及Western blot檢測結(jié)果顯示，模型組、安慰劑組TGF-β和SMAD2 mRNA和蛋白表達(dá)明顯較少，miR-146 mimic組TGF-β和SMAD2 mRNA和蛋白表達(dá)明顯增加，表明miR-146a對(duì)于韌帶損傷具有修復(fù)作用。Kim等[19]的研究發(fā)現(xiàn)，在TGF-β刺激細(xì)胞后，SMAD2蛋白形成三聚體復(fù)合物并廣泛激活下游靶基因，從而促進(jìn)膝關(guān)節(jié)韌帶損傷的恢復(fù)。而最新的研究發(fā)現(xiàn)，剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的miR-146a增多還可以通過靶向膠原蛋白促進(jìn)血管生成[20]，在一定程度上對(duì)韌帶損傷修復(fù)后血供的恢復(fù)有一定的幫助，同時(shí)也證實(shí)了本研究的結(jié)論。

綜上所述，miR-146a可促進(jìn)TGF-β和SMAD2蛋白表達(dá)，加強(qiáng)韌帶拉伸效果，促進(jìn)膝關(guān)節(jié)韌帶損傷的修復(fù)。