程愛芳，張英杰，陶苗苗，徐鳴曙

(1.上海中醫(yī)藥大學，上海 201203;2.上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所，上海 200030)

卒中目前在我國處于高發(fā)態(tài)勢，其中缺血性卒中占全部卒中的70%左右[1]。缺血性卒中發(fā)生后患者不同程度地喪失其勞動及生活自理能力，給家庭和社會帶來巨大負擔。目前，對于缺血性卒中的預防更多地處于基礎(chǔ)研究階段，主要研究對象基于大腦中動脈阻塞模型(middle cerebral artery occlusion， MCAO)大鼠，主要預處理方式包括針刺預處理、藥物預處理、高壓氧預處理、遠隔缺血預處理等，研究表明預處理方式可在一定程度上誘導腦缺血耐受[2-4]。

電針療法作為綠色療法的一部分，被越來越多地應(yīng)用和研究[5]。有報道顯示，電針預處理大鼠“百會”可使大鼠腦缺血后神經(jīng)功能減退得到改善，腦梗死面積減小，并提出“電針預處理”的概念[6]。此后，有關(guān)電針預處理的報道不斷出現(xiàn)[7-8]。然而，對于電針預處理的腦保護機制仍不甚明確，本研究希望通過歸納現(xiàn)有文獻中有關(guān)電針預處理腦保護機制的研究，為今后電針預處理的臨床應(yīng)用提供科學依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 減輕炎癥反應(yīng)

對于機體而言，適度的炎癥反應(yīng)可以殺菌、清除和修復損傷組織，而過度的炎癥反應(yīng)則會加重患區(qū)的潰爛及功能衰減甚至喪失。有研究顯示，在 MCAO術(shù)后，再灌注損傷導致炎癥反應(yīng)發(fā)生，過度的炎癥反應(yīng)致使傷口難以愈合，并且加重了實驗中動物梗死的發(fā)生及神經(jīng)功能缺陷，而炎癥反應(yīng)又進一步加重了腦缺血再灌注損傷[9]。腦缺血后，白細胞、小膠質(zhì)細胞被激活并釋放大量的細胞因子，這些物質(zhì)在腦缺血再灌注損傷的過程中發(fā)揮了重要作用[10]。

1.1 白細胞及相關(guān)細胞因子

急性腦缺血后，早期免疫系統(tǒng)迅速啟動，免疫細胞激活，參與炎癥反應(yīng)。白細胞是人體最主要的免疫細胞，腫 瘤 壞 死 因 子 -α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1β， IL-1β)是缺血再灌注損傷后較早表達的炎癥細胞因子。腦缺血再灌注急性期白細胞被 IL-1β、TNF-α等炎性因子激活，之后在細胞黏附分子作用下黏附于缺血區(qū)微血管內(nèi)皮細胞上，阻塞微血管，使再灌注血流減少;并且隨著再灌注的發(fā)生，在趨化因子白介素-8(IL-8)的作用下，白細胞進入缺血區(qū)，釋放促炎因子，加重炎癥反應(yīng)?？梢姡瑴p少白細胞浸潤，抑制 IL-8、IL-1β、TNF-α等因子的產(chǎn)生和釋放對腦組織損傷能夠起到保護作用[9]。電針預處理能夠下調(diào)腦缺血再灌注大鼠血漿中的 IL-6、IL-1β及 TNF-α含量，從上游阻斷炎癥反應(yīng)的惡性循環(huán)，減輕神經(jīng)功能損傷，實現(xiàn)腦保護作用[11]。同時，電針預處理還可能通過調(diào)控嘌呤受體P2Y1R、P2X7R的表達，減少炎性因子TNF-α、IL-β含量，誘導腦缺血耐受[12]。

1.2 小膠質(zhì)細胞及相關(guān)細胞因子

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，小膠質(zhì)細胞發(fā)揮著類巨噬細胞的作用，是最先針對損傷產(chǎn)生應(yīng)答的細胞，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)第一道免疫防線?；罨男∧z質(zhì)細胞分為經(jīng)典激活狀態(tài)(M1型)和選擇性激活狀態(tài)(M2型)兩種表型[13]。前者受 Toll樣受體 4(toll-like receptor4，TLR-4)和干擾素-γ (interferon-γ， IFN-γ)激活，可增加促炎因子的產(chǎn)生，加重炎癥反應(yīng)和組織損傷程度。后者主要由白介素-4(IL-4)或白介素-13(IL-13)誘導，通過發(fā)揮巨噬細胞的作用達到抑制過度炎癥反應(yīng)和修復組織損傷的效果。腦缺血損傷發(fā)生后，小膠質(zhì)細胞聚集在病灶周邊，發(fā)揮雙重調(diào)節(jié)作用。一方面，小膠質(zhì)細胞不停地吞噬及清除病原體、細胞碎片等毒性物質(zhì)充分發(fā)揮抗神經(jīng)損傷作用[14]。與此同時，小膠質(zhì)細胞過度活化產(chǎn)生多種過量的炎性介質(zhì)，加重神經(jīng)損害過程[15]。電針預處理可減少 MCAO大鼠腦內(nèi) TRL4、NF-κB蛋白表達，抑制小膠質(zhì)細胞 TRL4/NF-κB信號通路的活性，減輕炎性反應(yīng)，減輕MCAO大鼠神經(jīng)損傷[16]。電針預處理能夠調(diào)控小膠質(zhì)細胞活化狀態(tài)，在腦缺血再灌注損傷修復期，誘導小膠質(zhì)細胞由M1型向M2型轉(zhuǎn)化，進而發(fā)揮抗炎作用，達到腦保護的目的[17]。

2 抑制興奮性氨基酸毒性

興奮性氨基酸的興奮性毒性被認為是腦缺血損傷級聯(lián)反應(yīng)誘發(fā)的初始因素[18]。廣泛分布于神經(jīng)系統(tǒng)的谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)主要的興奮性氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)，正常狀態(tài)下，谷氨酸由突觸前膜釋放到突觸間隙，作用于突觸后膜上的受體，以完成一系列生理性活動。在突觸間隙中，谷氨酸的清除(再攝取)主要依賴谷氨酸轉(zhuǎn)運體(glutamate transporter-1， GLT-1)[19]。腦缺血狀態(tài)下谷氨酸轉(zhuǎn)運體功能紊亂，谷氨酸過度蓄積并刺激谷氨酸受體過度興奮，進而過度刺激神經(jīng)元，誘發(fā)神經(jīng)元興奮性損傷[20]。因此，腦缺血后，減輕氨基酸興奮性損傷可以從其轉(zhuǎn)運體及受體兩方面考慮。

2.1 調(diào)節(jié)谷氨酸受體

突觸(細胞)膜上谷氨酸受體主要有代謝型受體(metabotropic glutamate recrptors， mGluRs)和離子型受體 N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid receptor， NMDA)受體與α-氨基-3-羥基-5-甲基-異惡唑丙酸 (α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid recrptor， AMPA)受體[21]。NMDA受體主要由NR1、NR2、NR3 3種亞基組成。當NMDA受體被Glu激活后，會使細胞膜的通透性增加，主要是增加細胞內(nèi)的鈣離子(Ca2+)水平，從而加劇Glu興奮性毒性作用。AMPA的亞基受體GluR2可以限制細胞膜對Ca2+及其他陽離子的通透作用。腦缺血再灌注后，GluR2減少，形成以GluR1或GluR3為主、GluR2缺乏的新受體，使細胞內(nèi)Ca2+水平增加，加重腦損傷[22]。研究顯示，電針能抑制大鼠缺血腦組織 mGluRs的表達，緩解腦損傷[23]。電針預處理可使缺血腦區(qū)NR1的表達水平顯著降低，發(fā)揮神經(jīng)保護作用[24]。同時，電針預處理也通過調(diào)節(jié)大麻素受體1(cannabinoid receptor 1，CB1R)提高GluR2表達水平，以抑制突觸后膜對Ca2+的通透作用，減輕興奮性毒性，改善神經(jīng)功能[25]。

2.2 調(diào)節(jié)谷氨酸轉(zhuǎn)運體

谷氨酸再攝取最主要細胞類型是星型膠質(zhì)細胞[26]。在大鼠星型膠質(zhì)細胞內(nèi)表達的主要谷氨酸轉(zhuǎn)運體是 GLT-1，其對應(yīng)的人類同源體是興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運 體 2(excitatory amino acid transporter 2，EAAT2)。有研究顯示，電針可以提高腦內(nèi)谷氨酸轉(zhuǎn)運體GLT-1的表達和活性[27]，也可使缺血半暗帶的EAAT2下調(diào)水平被抑制[28]，缺血區(qū)細胞外谷氨酸濃度下降[29]，以減輕腦缺血后神經(jīng)細胞損傷，誘導腦缺血耐受。

3 減少細胞凋亡與自噬

機體內(nèi)細胞程序性死亡的兩種主要形式是細胞凋亡和細胞自噬。細胞凋亡是一種主動過程，涉及到一系列基因的激活、表達以及調(diào)控等程序。細胞自噬是細胞自身溶酶體降解細胞內(nèi)自身物質(zhì)，尤其是長壽蛋白和受損細胞器的過程。生理情況下，細胞凋亡和細胞自噬共同維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。

3.1 減少神經(jīng)細胞凋亡

缺血性腦損傷與神經(jīng)細胞凋亡關(guān)系密切。腦缺血后，由于急驟缺血缺氧，缺血中心區(qū)的神經(jīng)細胞發(fā)生不可逆的損傷，迅速死亡。而在缺血半暗帶區(qū)，神經(jīng)細胞損傷具有可逆性，若損傷未能得到及時修復，則會導致缺血半暗帶的神經(jīng)細胞凋亡。因此抑制腦缺血后神經(jīng)細胞凋亡的發(fā)生，是發(fā)揮腦神經(jīng)保護機制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。細胞凋亡是由特定的基因和蛋白調(diào)控的[30]。其中細胞凋亡蛋白酶(caspase)家族中的天冬氨酸蛋白水解酶3(caspase-3)是缺血半暗帶區(qū)介導細胞凋亡至關(guān)重要的蛋白酶[31]。組織缺氧等應(yīng)激變化，可誘導p53蛋白激活，而被激活的p53蛋白能夠調(diào)節(jié)細胞周期，調(diào)控細胞分化和促進細胞凋亡[32]。另外，抗凋亡基因(Bcl-2)與促凋亡基因(Bax)亦相互作用來影響腦缺血再灌注損傷的細胞凋亡[33]。研究顯示，電針預處理能夠抑制腦缺血后缺血半暗帶皮質(zhì)區(qū)域caspase-3、p53及Bax表達上調(diào)，促進Bcl-2表達上調(diào)減少缺血后細胞凋亡[34]。

3.2 調(diào)節(jié)細胞自噬

腦缺血后，細胞自噬在缺血腦組織內(nèi)發(fā)揮“雙刃劍”作用。一方面自噬適度激活可保護神經(jīng)細胞，發(fā)揮腦保護作用。另一方面，過度激活自噬可導致自噬細胞的裂解、死亡。另外自噬不足，受損的細胞器和蛋白不能及時被清除，也會影響細胞的功能，加重腦損傷[35]。已有研究證實電針可通過調(diào)節(jié)自噬相關(guān)蛋白 LC3A/B適度激活自噬，進而改善神經(jīng)功能[36]。電針預處理能夠抑制AMPK-Beclin1/Vps34通路以減少自噬激活[37]。

4 抗氧化應(yīng)激

氧化應(yīng)激因體內(nèi)的活性氧、氧自由基增加，以及抗氧化應(yīng)激防御系統(tǒng)的減少而發(fā)生。氧化應(yīng)激能夠激活細胞內(nèi)的凋亡信號通路，導致細胞死亡。線粒體是細胞的“能量工廠”，參與氧化應(yīng)激反應(yīng)。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase， SOD)是一種抗氧化劑，可清除體內(nèi)氧自由基，丙二醛(malondialdehyde， MDA)是自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物，兩者是反應(yīng)氧化應(yīng)激程度的重要指標。腦缺血再灌注后缺血組織會產(chǎn)生大量活性氧和自由基，引發(fā)線粒體功能障礙，導致腦組織內(nèi)氧化與抗氧化系統(tǒng)失衡，造成腦損傷。有研究顯示，電針預處理可減輕MCAO大鼠腦組織中線粒體結(jié)構(gòu)損傷，同時上調(diào) SOD水平，下調(diào) MDA水平[38]，實現(xiàn)對缺血組織神經(jīng)元的保護作用。

5 維持血腦屏障完整性

血腦屏障(blood-brain barrier， BBB)由連接緊密的毛細血管內(nèi)皮細胞、完整的基底膜以及星形膠質(zhì)細胞終足共同組成的神經(jīng)膠質(zhì)膜結(jié)構(gòu)[39]，作為一種彌散屏障用于維持中樞系統(tǒng)功能。腦缺血后，BBB完整性被破壞，導致腦水腫，引起神經(jīng)細胞的損傷及凋亡[40]?；|(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9，MMP-9)是基質(zhì)金屬蛋白酶家族中與腦微血管疾病關(guān)系最為密切的酶[41]，在缺血后血腦屏障損傷和血管源性腦水腫的發(fā)生中起關(guān)鍵作用[42]。電針預處理后，MCAO大鼠缺血腦組織中 MMP-9的表達及活性明顯降低[43]，腦水腫癥狀減輕[44]，可見，電針預處理能夠通過降低MMP-9的表達以維持血腦屏障完整性。

6 討論

綜上所述，電針預處理能夠調(diào)節(jié)白細胞和小膠質(zhì)細胞及相關(guān)細胞因子以減輕神經(jīng)元的炎性反應(yīng)，并通過抑制興奮性氨基酸毒性來減少神經(jīng)元變性;電針預處理還通過平衡腦組織內(nèi)氧化與抗氧化系統(tǒng)、調(diào)控神經(jīng)細胞凋亡和自噬相關(guān)蛋白及通路，從而降低神經(jīng)元的大面積死亡程度;電針預處理通過維持血腦屏障完整性，以及抑制再灌注后血管源性腦水腫的發(fā)生和出血性轉(zhuǎn)化來實現(xiàn)缺血性卒中的腦保護效應(yīng)，電針預處理具有顯著的誘導腦缺血耐受效應(yīng)[5，10，14，29，38]。電針預處理誘導腦缺血耐受的過程，是通過調(diào)控機體內(nèi)多種途徑的各類分子、不同細胞、相關(guān)蛋白，進而調(diào)節(jié)腦血流、腦代謝、神經(jīng)血管活動得以實現(xiàn)的，電針預處理是具有多水平、多靶點、多途徑特色的一種干預手段。

當前的實驗研究多選擇 MCAO大鼠缺血側(cè)腦組織進行研究，對于健側(cè)腦相關(guān)區(qū)域的研究較少。缺血性腦損傷患者不僅存在病灶本身的變化，也存在一系列繼發(fā)性改變，包括缺血半暗帶區(qū)域以及健側(cè)大腦半球。有研究報道，腦缺血急性期時健側(cè)大腦半球激發(fā)者預后更佳[45]，且鍛煉健側(cè)的康復方法在臨床上也較有成效[46]。在今后的研究中，可以考慮以健側(cè)為目的區(qū)域，科學全面地觀察電針預處理對腦缺血耐受作用。現(xiàn)有關(guān)電針誘導腦缺血耐受的研究，實驗方案不統(tǒng)一，針刺方法種類多樣、穴位選擇標準不一、干預時機未能明確。在未來的研究中，進一步優(yōu)化實驗方案，確定針對性的針刺方法(如不同年齡的MCAO大鼠采用不同的針刺方式)，選擇循證醫(yī)學支持下較為統(tǒng)一的穴位配伍方式(如五腧穴、經(jīng)穴、阿是穴)，明確干預周期及干預時間，以期獲得更大、更穩(wěn)定的研究價值。目前對于電針預處理誘導腦缺血耐受的機制研究中，在實驗的時效方面，未能及時監(jiān)測干預時相關(guān)腦區(qū)的即時活動狀態(tài)，即電生理技術(shù)的使用尚欠充分。近年來，功能性磁共振成像作為一種對機體無損的技術(shù)，已被廣泛應(yīng)用于視覺、思維、情感、認知等方面的研究[47]。小動物磁共振的使用日益廣泛，光遺傳技術(shù)的應(yīng)用和成熟也為電針預處理卒中研究帶來了新的技術(shù)方案。在今后的實驗中，可以考慮利用先進技術(shù)進行針灸腦科學領(lǐng)域的應(yīng)用與研究，以明確腦功能區(qū)對電針預處理的反應(yīng)，即時觀察針刺的神經(jīng)機制，從而促進針灸與現(xiàn)代醫(yī)學融合。另外，目前電針預處理誘導腦缺血耐受的方式在臨床上應(yīng)用范圍較局限，之后可嘗試單獨或配合其他預處理方式對冠心病、高血壓等具有卒中危險因素的對象進行臨床干預，以擴大電針預處理的臨床適用范圍。