劉文雄 莫善穎

瘧疾是一種在熱帶及亞熱帶地區(qū)廣泛流行，由于被雌性按蚊叮咬或輸入了帶有患者的血液而被瘧原蟲感染所致的蟲媒傳染性疾病，尤其處于疫區(qū)的幼兒、孕婦、老年人、機(jī)體免疫能力和抵抗能力差等人群均屬于易感人群。按蚊叮咬、血液傳播和母嬰傳播是感染瘧疾的主要途徑，瘧疾的發(fā)病過程是瘧原蟲進(jìn)入人體，入侵肝細(xì)胞后生長(zhǎng)發(fā)育，并進(jìn)入血液中的紅細(xì)胞持續(xù)繁殖，最終導(dǎo)致紅細(xì)胞破裂。瘧疾的常見表現(xiàn)為突發(fā)性寒戰(zhàn)、全身高熱、大量出汗并伴隨頭暈、頭痛、身體酸痛、疲乏、厭食、嘔吐等癥狀，病情嚴(yán)重者會(huì)出現(xiàn)昏迷、休克、代謝性酸中毒、急性腎功能衰竭或急性肺水腫等表現(xiàn)，導(dǎo)致人體器官組織受到嚴(yán)重?fù)p傷，也給人們的生命安全造成較大威脅［1-2］。瘧疾是一種世界范圍的傳染病，目前在亞洲和非洲地區(qū)仍然是威脅人類健康最嚴(yán)重的寄生蟲疾病之一［3］，且病例主要集中在非洲和東南亞地區(qū)［4］。目前全球104 個(gè)瘧疾流行國(guó)家和地區(qū)中已有19 個(gè)國(guó)家和地區(qū)正處于消除瘧疾前階段或消除瘧疾階段［5］。

近年來，瘧疾得到很好的控制，病例數(shù)大幅下降,但仍有部分病例因延誤診治而導(dǎo)致患者死亡。因此，尋求精確、快速的診斷方法是控制瘧疾傳播以及降低治療成本和病死率的關(guān)鍵。外周血涂制厚、薄血膜鏡檢法目前在世界范圍內(nèi)仍被廣泛應(yīng)用，已成為瘧疾實(shí)驗(yàn)室診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”［6］，但傳統(tǒng)的鏡檢法結(jié)果受諸多因素影響，容易造成誤診或漏診，作為“金標(biāo)準(zhǔn)”已越來越難以用于評(píng)價(jià)診斷效率［7］。因此，本文對(duì)近年來國(guó)內(nèi)外瘧疾診斷方法的研究進(jìn)展進(jìn)行簡(jiǎn)要概述。

1 病原學(xué)診斷

1.1 鏡檢法 使用鏡檢法理論上每μL 血液樣本中可檢出4 個(gè)瘧原蟲［8］，但該方法費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，對(duì)低原蟲血癥和混合感染容易漏診，但因操作簡(jiǎn)單，經(jīng)濟(jì)實(shí)用，仍是基層單位檢測(cè)瘧疾的主要手段。

1.2 吖啶橙包被的毛細(xì)管法（quantitative buffy coat technique，QBC） 該方法利用受感染的紅細(xì)胞比正常紅細(xì)胞輕，但比白細(xì)胞略重這一原理，使用含抗凝劑和吖啶橙熒光染液的毛細(xì)管采集末梢血，經(jīng)分層離心后，被染色的紅細(xì)胞富集于棕黃色層下。QBC法的優(yōu)點(diǎn)在于檢測(cè)速度快，敏感度和特異度均較高，但該方法對(duì)蟲株的鑒別和計(jì)數(shù)較困難，操作步驟多，耗材費(fèi)用高［9-10］。

1.3 苯并硫羥基嘌呤（benzothiocarboxypurine，BCP）染色法 對(duì)各發(fā)育期的瘧原蟲進(jìn)行染色，被感染的網(wǎng)織紅細(xì)胞可見獨(dú)特的點(diǎn)狀分布，白細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)呈亮綠色，存活的白細(xì)胞及血膜中的異物不著色，因此易于鏡檢者的觀察和區(qū)別。Makler 等［11］首次采用BCP 法對(duì)惡性瘧原蟲進(jìn)行熒光染色檢查，該方法的敏感度與姬姆薩染色法基本一致。隨后，張慶軍［12］研究結(jié)果顯示，BCP 法的檢測(cè)敏感度較高，且該方法操作簡(jiǎn)便、快速，且染色穩(wěn)定性高于姬姆薩染色法，不易過染，較易識(shí)別，鏡檢快速，對(duì)鏡檢者的技術(shù)要求低。

1.4 吖啶橙（acridine orange，AO）染色法 AO 是一種非常敏感的核酸熒光染料，含DNA 和RNA 的細(xì)胞在染色后分別激發(fā)黃綠色熒光和橘紅色熒光，根據(jù)染色后所呈現(xiàn)的顏色對(duì)病原體進(jìn)行鑒別。早在20 世紀(jì)90 年代初期，Kawamoto［13］就設(shè)計(jì)了AO濾色系統(tǒng)和鹵素光源，使之可以在傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察，從而在臨床上得到廣泛應(yīng)用。黃亞銘等［14］研究表明，AO 染色法比傳統(tǒng)檢測(cè)方法的速度快，陽性率高。另外，AO 染液有毒性，檢驗(yàn)人員在操作時(shí)需戴手套和避光，AO 法還存在染色無特異性的缺點(diǎn)，因此鏡檢人員應(yīng)接受相關(guān)培訓(xùn)。

2 免疫學(xué)診斷

2.1 間接免疫熒光抗體法（indirect immunofluorescent antibody test，IFAT） IFAT 是在待測(cè)血清抗體與抗原結(jié)合后，加入熒光標(biāo)記的第二抗體，洗滌后在熒光顯微鏡下觀察特異性熒光。該方法具有較高的敏感度和特異度，且重復(fù)性較好，但有一定主觀性，標(biāo)本無法保存。房文等［15］研究顯示，隨著存放溫度的上升和存放時(shí)間的延長(zhǎng)，抗體量逐漸下降，需在熒光顯微鏡下觀察，且只有高滴度IFAT 才適用于無癥狀帶蟲者的確定和臨床診斷［16］。

2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA） 將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，以酶標(biāo)記的抗原或抗體與黏附在載體上相應(yīng)的抗體或抗原結(jié)合，用洗滌法將液相中的游離成分洗除，再與酶底物作用，根據(jù)底物顯色深淺定性、定量檢測(cè)抗原和抗體。該方法敏感性好，特異性強(qiáng)，穩(wěn)定性高，且由其衍生出斑點(diǎn)ELISA（Dot-ELISA）等一系列方法，均可用于臨床檢驗(yàn)。李全貞等［17］的研究表明，直接檢測(cè)患者血清中瘧原蟲抗體，可減少篩選的盲目性，而且簡(jiǎn)便、快速，適合于大規(guī)模瘧原蟲抗體的篩選。

2.3 免疫層析技術(shù)

2.3.1 惡性瘧原蟲富組氨酸蛋白2（histidine-rich protein-2，HRP-2）抗原檢測(cè) 該方法是一種直接檢測(cè)血液中惡性瘧原蟲HRP-2抗原(一種可溶性蛋白)的免疫吸附定性測(cè)試，ParaSight-F 浸條法和快速免疫色譜測(cè)試法（immunochromatographic test，ICT）是近年來應(yīng)用較多的兩種檢測(cè)瘧原蟲HRP-2 抗原的方法。楊亞明等［18］對(duì)ParaSight-F 浸條法與PCR 進(jìn)行比較，結(jié)果顯示ParaSight-F 浸條法操作簡(jiǎn)便，無需特殊設(shè)備，且檢測(cè)效果較好，7～10 min 即可獲得診斷結(jié)果。鄭香等［19］與張?jiān)倥d等［20］比較ICT 法與鏡檢法，結(jié)果顯示兩種方法的符合率高，操作快速方便。ParaSight-F 法只能檢測(cè)惡性瘧原蟲，而ICT法還可檢測(cè)間日瘧原蟲及混合感染。當(dāng)類風(fēng)濕因子（rheumatoid factor，RF）存在時(shí)，ParaSight-F 法與ICT 法會(huì)出現(xiàn)假陽性結(jié)果，且假陽性率隨著RF 滴度的增加而升高［21］。有學(xué)者使用膠體碳作為免疫層析的信號(hào)標(biāo)簽，與鏡檢法進(jìn)行比較，其敏感度、特異度、符合率均可達(dá)到95%以上，掃描檢測(cè)帶的灰度值能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)瘧原蟲的定量檢測(cè)［22］。免疫層析技術(shù)目前也應(yīng)用于很多其他感染性疾病的檢測(cè)，如流行性感冒、社區(qū)獲得性肺炎等［23］。

2.3.2 乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）抗原檢測(cè) 單克隆抗體免疫層析法（OptiMAL）原理是用LDH 單克隆抗體捕獲溶于血液中的LDH 抗原，由于血液中LDH 的水平與蟲體血癥存在相關(guān)性，可作為瘧原蟲檢測(cè)的標(biāo)志物。雷露等［24］研究中，單克隆抗體免疫層析法、鏡檢法和PCR 法在102 份瘧疾疑似病例血樣的檢測(cè)中陽性率分別為63.73%、54.90%、70.59%，單克隆抗體免疫層析法和PCR 法的陽性率均高于鏡檢法。在常規(guī)瘧疾檢測(cè)工作中，單克隆抗體免疫層析法或PCR 法均可作為鏡檢法的有效補(bǔ)充，能進(jìn)一步提高瘧疾病例的臨床診斷水平。焦炳欣等［25］還認(rèn)為OptiMAL 法可反映藥物治療后瘧原蟲數(shù)量的下降，能夠評(píng)估治療效果和鑒定抗藥瘧原蟲株的出現(xiàn)。

2.3.3 谷氨酸脫氫酶（glutamate dehydrogenase，GDH）抗原檢測(cè) GDH 以其獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)成為用于瘧疾診斷新的候選分子，李妍等［26］建立的GDH膠體金層析法檢測(cè)惡性瘧的敏感度為86.66%，特異度為96.43%。

3 聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）

3.1 普通PCR 該技術(shù)原理與細(xì)胞內(nèi)的DNA 復(fù)制相似，是一種體外快速擴(kuò)增靶基因或DNA 序列的方法。目前，PCR 技術(shù)已廣泛應(yīng)用于病原體診斷、基因表達(dá)、遺傳病檢測(cè)等生命科學(xué)研究領(lǐng)域［27］。華德等［28］應(yīng)用普通PCR 技術(shù)對(duì)保存1～5 年的血樣進(jìn)行檢測(cè)，PCR 結(jié)果與原鏡檢結(jié)果的總符合率為98.4%，表明長(zhǎng)期保存標(biāo)本不影響PCR 結(jié)果。

3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 該技術(shù)是在普通PCR 的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的核酸熒光定量技術(shù)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 的檢測(cè)敏感度可達(dá)到每μL 血液0.2～4.0 個(gè)瘧原蟲［29］。張國(guó)斌［30］采用鏡檢和實(shí)時(shí)熒光PCR分別檢測(cè)瘧原蟲陽性和陰性血樣各20 份，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 在檢測(cè)時(shí)具有快速、準(zhǔn)確度高、陽性檢出率高的特點(diǎn)。李素華等［31］將實(shí)時(shí)熒光PCR 與鏡檢和巢式PCR 進(jìn)行比較，熒光定量PCR 的陽性檢出率為93.7%，高于其他兩種方法，且敏感度和特異度更高，用時(shí)更短。

3.3 巢式PCR 該技術(shù)利用兩對(duì)PCR 引物進(jìn)行兩次PCR 擴(kuò)增，從而使靶序列得到兩輪擴(kuò)增，可增加PCR 檢測(cè)技術(shù)的敏感度和特異度。Yentur Doni 等［32］采用巢式PCR 和顯微鏡觀察兩種方法對(duì)153 例疑似瘧疾患者血樣進(jìn)行檢測(cè)和比較發(fā)現(xiàn)，巢式PCR檢出陽性標(biāo)本15 份（占9.8%），顯微鏡觀察檢出陽性標(biāo)本11 份（占7.2%），兩種方法的陽性符合率為73.3%。吳冬妮等［33］對(duì)瘧疾快速診斷試劑盒（rapid diagnostic tests，RDTs)、顯微鏡檢法和巢式PCR 3 種方法進(jìn)行比較分析，在惡性瘧原蟲的鑒定能力上，RDTs 最佳，符合率為100.00%；巢式PCR 次之，符合率為97.49%；鏡檢法的符合率為91.40%。

3.4 多重PCR 多重PCR 又稱多重引物PCR 或復(fù)合PCR，是以傳統(tǒng)PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)，可同時(shí)檢測(cè)兩對(duì)以上瘧原蟲的引物，對(duì)多個(gè)DNA 模板或不同區(qū)域片段進(jìn)行擴(kuò)增，從而減少操作步驟，且省時(shí)省力［34］。黃雨婷等［35］對(duì)間日瘧原蟲、惡性瘧原蟲、卵形瘧原蟲和三日瘧原蟲進(jìn)行單一及混合瘧原蟲DNA 模板檢測(cè)，結(jié)果顯示，4 種瘧原蟲單一感染檢出的最低濃度均接近每μL 血液中1 個(gè)瘧原蟲。魏曉光等［36］用多重PCR 法和熒光定量PCR 法對(duì)55 例臨床瘧疾病例標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，其中多重PCR 法檢出瘧原蟲42 份，陽性率為76.36%，熒光定量PCR 法檢出瘧原蟲41 份，陽性率為74.55%,兩種PCR 方法的敏感度、特異度均較高，有較高推廣應(yīng)用價(jià)值。上述研究結(jié)果均提示，多重PCR 方法具有敏感度和特異度高、操作簡(jiǎn)便快速、檢測(cè)結(jié)果易于判斷的優(yōu)點(diǎn)，一次反應(yīng)即可確定4 種人體瘧原蟲。

3.5 多重?zé)晒舛縋CR 該技術(shù)由實(shí)時(shí)熒光PCR與多重PCR 優(yōu)化發(fā)展而來，通過將幾種不同的探針熒光基團(tuán)混合，可同時(shí)檢測(cè)基因序列不同的瘧原蟲。何曉翔等［37］研究表明，惡性瘧疾可檢測(cè)到每mL 102個(gè)拷貝，間日瘧原蟲、三日瘧原蟲、卵形瘧原蟲可檢測(cè)到每mL 103個(gè)拷貝。多重?zé)晒舛縋CR 檢測(cè)4 種瘧原蟲的特異度較高，重復(fù)性較好，且敏感度較高，可用于瘧原蟲快速篩查及分型鑒定。

4 結(jié)語

目前以傳統(tǒng)鏡檢法為基礎(chǔ)的病原學(xué)診斷方法仍是瘧疾診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，具有價(jià)格低廉、對(duì)設(shè)備要求低、易于基層開展等優(yōu)點(diǎn)，但其敏感度低，且費(fèi)時(shí)費(fèi)力，需要有相當(dāng)經(jīng)驗(yàn)的人員才能做出正確的診斷。另外，低瘧原蟲血癥和混合感染也使傳統(tǒng)的診斷方法不能適應(yīng)現(xiàn)代瘧疾監(jiān)控的要求。

近年來，瘧疾診斷技術(shù)在免疫學(xué)和PCR 技術(shù)方面均有較大的發(fā)展。在免疫學(xué)方面，免疫層析技術(shù)操作簡(jiǎn)單、快速，使實(shí)驗(yàn)室外的患者自我檢測(cè)成為可能，較適合現(xiàn)場(chǎng)人群篩查，但其敏感度較低，檢測(cè)無癥狀帶蟲者時(shí)易出現(xiàn)假陰性結(jié)果。在PCR 技術(shù)應(yīng)用方面，PCR 對(duì)瘧原蟲診斷及蟲種鑒定均具有較高的敏感度和特異度，特別是對(duì)于低密度瘧原蟲感染的病例較容易檢測(cè)到［5］；但PCR 檢測(cè)技術(shù)需要特殊的設(shè)備，且儀器體積較大，不易移動(dòng)，不利于現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用，檢測(cè)操作較費(fèi)時(shí)，成本較高，因此該技術(shù)適用于醫(yī)療設(shè)備條件好且技術(shù)人員充足的大型醫(yī)院，而在基層單位的推廣仍面臨很大困難。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突