姜鐵民，劉 斌，劉彥品，黃訓(xùn)文，李 貞，李建濤，陳歷俊*

（1 桂林理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院 廣西桂林541004 2 北京三元食品股份有限公司 北京市乳品工程技術(shù)研究中心 北京100163）

人體腸道菌群是一個復(fù)雜的高度多樣化生態(tài)系統(tǒng)，據(jù)估計由1014個細(xì)菌組成，健康個體的腸道微生物群落以放線菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門和疣細(xì)菌門5 個細(xì)菌門為主[1]。近來許多研究揭示了腸道微生物對人體健康的重要作用，參與人體的正常生長發(fā)育、免疫、代謝、疾病等各方面，肥胖、糖尿病、肝臟疾病、癌癥、神經(jīng)退行性疾病等許多疾病與腸道微生物密切相關(guān)，人體腸道微生物被視為多種疾病的潛在新型療法[1-4]。而飲食是影響人類腸道微生物結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)鍵因素，且飲食營養(yǎng)成分的變化能迅速改變腸道菌群組成，使飲食干預(yù)成為預(yù)防或治療各種醫(yī)學(xué)病癥的方法之一[5-7]。酸奶作為歷史悠久的發(fā)酵乳制品，越來越多研究表明酸奶對人體健康的作用，如維持健康的腸道微生物群，預(yù)防各種胃腸道疾病，降低肥胖、代謝綜合征、心血管疾病、腫瘤等慢性疾病發(fā)病率，然而，目前益生菌及其發(fā)酵產(chǎn)品的健康功效仍存在爭議，可能與觀察指標(biāo)、益生菌菌株及配方、干預(yù)時間等有關(guān)[8-13]，探索酸奶的健康效應(yīng)及其需要解決的研究缺口，成為食品界重要的研究內(nèi)容。燒酸奶是一種生牛乳經(jīng)高溫美拉德褐變反應(yīng)，后乳酸菌發(fā)酵的酸奶，具有與傳統(tǒng)酸奶不同的加工工藝，推測可能產(chǎn)生不同于傳統(tǒng)酸奶的改變腸道菌群的效果。為此，本研究通過隨機、開放試驗，追蹤觀察了燒酸奶及其不同干預(yù)方式下健康人群腸道菌群的變化情況，為評價不同加工工藝和配方酸奶對人體的健康作用提供依據(jù)，同時為科學(xué)飲用酸奶提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 研究人群與干預(yù)方式

采用隨機、開放研究方法，按“知情同意、自愿參加” 原則，2015年10月～11月在北京市招募到年齡20～55 歲，1 個月內(nèi)未使用過抗生素的健康志愿者40 人，簽署知情同意書后，按性別、年齡隨機納入NS，TS 組進(jìn)行燒酸奶干預(yù)，早晚各200 mL，連續(xù)4～10 周。其中，NS 組直接飲用燒酸奶，TS 組經(jīng)過2 周準(zhǔn)備期（不食用任何益生菌、益生元產(chǎn)品）后飲用燒酸奶，且10 人接受2 周洗脫再次干預(yù)2 周。整個研究期間，要求參與者保持平常的生活方式和飲食，但不得使用任何其它酸奶或含益生菌的食物，并定期進(jìn)行72 h 膳食回顧調(diào)查和糞便樣本采集。本研究經(jīng)洛陽北方企業(yè)集團有限公司職工醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 糞便樣本采集與腸道菌群16S rRNA 基因測序

NS 組人群分別在干預(yù)前（基線）、干預(yù)4 周、干預(yù)后2 周共3 個時間點采集糞便樣本，TS 組于干預(yù)前（基線）、準(zhǔn)備期2 周、第1 次干預(yù)4 周、洗脫期2 周、第2 次干預(yù)2 周共5 個點采集糞便樣本，采集量約5 g，放入帶有保護(hù)液的PSP 管中（Stratec，德國），-80 ℃保存，用于腸道微生物基因分析。

根據(jù)試劑盒操作說明，使用QIAamp 快速糞便DNA Mini 試劑盒 （Qiagen，GmbH，Hilden，德國），從100 mg 糞便樣品中提取基因組DNA。然后以10 ng DNA 為模板，進(jìn)行PCR 擴增V3-V4 區(qū)域 的16S rRNA 基因，30 μL 總反應(yīng)體系為：15 μL 高保真PCR 反應(yīng)混合液 （New England Biolabs），0.2 μmol/L 正向和反向引物 （314F-805R）。PCR 條件包括95 ℃，3 min；25 次循環(huán)：95 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，30 s。根據(jù)操作說明，使用NEB Ultra DNA 文庫制備試劑盒（NEB，美國）生成測序文庫，擴增子采用Illumina PE 2×250 bp HiSeq 2500 平臺（Illumina，美國）進(jìn)行測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

腸道細(xì)菌測序結(jié)果使用QIIME 1.9.0[14]合并、質(zhì)量篩選和demultiplex 原始下機測序數(shù)據(jù)。序列進(jìn)行聚類，并將具有97%的相似性的序列歸為操作分類單元（OTU），然后將OTU 序列根據(jù)Greengenes 16S rRNA 基因數(shù)據(jù)庫（Version 13.5）進(jìn)行物種注釋，分類為從門到屬的級別。下游數(shù)據(jù)使用Calypso 8.84 平臺分別進(jìn)行TSS 和CSS 方法歸一化后，采用Rank test，Kruskall-Wallis 檢驗（非參數(shù)）進(jìn)行差異統(tǒng)計分析，以FDR（False Discovery Rate）或BH（Benjamini-CHochberg）校正后的P 值確定差異顯著性，統(tǒng)計檢驗均為雙側(cè)檢驗，P＜0.05為有顯著性差異，微生物菌屬的含量以平均值表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 研究對象及飲食基本情況

根據(jù)入組標(biāo)準(zhǔn)，招募符合要求的40 人進(jìn)入試驗，按性別比例隨機分成2 組：NS 組直接干預(yù)4周；TS 組經(jīng)10 d 清空期后干預(yù)4 周，洗脫15 d 再干預(yù)2 周。最終全部完成不同周期干預(yù)的志愿者為35 人（73%），分別為NS 組17 人、TS 組18 人，除谷類、薯類主食外，兩組成員在性別、年齡和膳食攝入量方面不存在顯著差異（表1）。

表1 完成跟蹤觀察的人群組成及其每日飲食情況Table 1 The volunteers and their daily dietary intake who completed the follow-up study

2.2 干預(yù)對腸道菌群多樣性的影響

人體腸道菌群隨著膳食營養(yǎng)、飲食習(xí)慣、激素分泌水平及抗生素使用等因素不斷變化，飲食結(jié)構(gòu)與習(xí)慣不同可影響腸道微生物群的構(gòu)成，進(jìn)而改變機體能量和營養(yǎng)物質(zhì)代謝，間接參與肥胖、糖尿病等代謝性疾病的發(fā)生發(fā)展[2-3，15]。本研究在日常飲食結(jié)構(gòu)基本相同的情況下，觀察了燒酸奶攝入及攝入方式對健康成人腸道菌群多樣性的影響。α-多樣性分析表明，兩組研究人群入組時的腸道菌群結(jié)構(gòu)類似（ANOVA P＞0.05），經(jīng)過4～6 周酸奶干預(yù)，腸道微生物豐富度指標(biāo)Chao1，ACE，Richness 指數(shù)顯著升高，且TS 組樣本顯著高于NS 組（ANOVA P＜0.05，圖1a，b），表明干預(yù)后，尤其是TS 組腸道微生物物種種類增加。腸道微生物群落結(jié)構(gòu)β-多樣性PCoA（基于Bray-Curtis 距離）分析結(jié)果顯示2 組腸道菌群整體結(jié)構(gòu)在干預(yù)前后和組間均無顯著性差異（圖1c，d）。

2.3 干預(yù)對優(yōu)勢腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

不同時間糞便樣本的菌群構(gòu)成分析顯示，健康成人腸道微生物主要檢測到9 個菌門、70 個菌屬。其中，厚壁菌門（Firmicutes，35.2%～58.4%）、擬桿菌門（Bacteroidetes，30.0%～54.3%）、變形桿菌門（Proteobacteria，3.1%～8.1%）為主要優(yōu)勢菌門，占腸道微生物群總相對豐度的95%（見圖2）；在屬水平分類上，平均相對豐度在5%以上的有擬桿菌屬（Bacteroides）、普雷沃氏菌屬（Prevotella）、未分類瘤胃球菌科（unclassed.Ruminococcaceae）、未分類梭菌目（Unclassified.Clostridiales）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、糞桿菌屬（Faecalibacterium），與報道的健康人體腸道優(yōu)勢菌群一致[16-18]，且存在所有觀察點樣本中（見表2）。但擬桿菌門及其普雷沃氏菌屬（14.5%）、瘤胃球菌屬（5.75%）、雙歧桿菌屬 （Bifidobacterium，0.85%）、Akk 菌屬（Akkermansia，2.4%）等主要優(yōu)勢菌和益生菌相對豐度不同于Nishijima 等[19]分析的中國人腸道菌群結(jié)果，乳桿菌屬（Lactobacillus，0.2%）、糞桿菌屬（5.09%）與其結(jié)果接近。

圖2 燒酸奶干預(yù)對腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響Fig.2 Effects of burned yogurt intervention on the structure of intestinal microbiota

相較于干預(yù)前，燒酸奶攝入4 周可降低變形菌門、放線菌門豐度（Actinobacteria），促進(jìn)擬桿菌門富集，且停用2 周（洗脫期）內(nèi)具有持續(xù)效果，而再次干預(yù)2 周則降低擬桿菌門豐度，同時促進(jìn)變形桿菌門、疣微菌門（Verrucomicrobia）富集（圖2），但干預(yù)后所有優(yōu)勢菌門的相對豐度與基線比較均沒有顯著差異。在屬水平上，燒酸奶可降低普雷沃氏菌屬、擬桿菌屬、瘤胃球菌屬、考拉桿菌屬（Phascolarctobacterium）等優(yōu)勢菌豐度，促進(jìn)糞桿菌屬、Akk 菌屬、嗜血桿菌屬（Haemophilus）、未分類梭菌目、巨單胞菌屬（Megamonas）富集，但主要與干預(yù)方式有關(guān)（表2）。對于雙歧桿菌和乳桿菌益生菌，干預(yù)期呈下降趨勢，其中雙歧桿菌干預(yù)4周末豐度為干預(yù)前的1/3（0.5%），但隨著再次干預(yù)上升到0.72%，與Burton 等[11]報道的酸奶干預(yù)效果相似。與基線比較，NS 和TS 組干預(yù)終點樣本中的未分類梭菌目、考拉桿菌屬、巨單胞菌屬、AKK菌屬相對豐度存在顯著差異，但FDR 調(diào)整后無顯著差異，說明長期飲食習(xí)慣在塑造腸道菌群結(jié)構(gòu)中發(fā)揮重要作用。值得注意的是，鏈球菌屬（Streptococcus）豐度在再次干預(yù)2 周時非顯著性高于基線值，但分析所有階段間差異菌群時發(fā)現(xiàn)，鏈球菌屬是唯一存在顯著性差異的腸道菌群（BH調(diào)整后P=0.009），于干預(yù)期第21 天達(dá)到最大值3.41%，推測與燒酸奶發(fā)酵生產(chǎn)用唯一菌種嗜熱鏈球菌有關(guān)。

表2 健康人群燒酸奶干預(yù)前、后優(yōu)勢腸道菌群豐度aTable 2 Changes of intestinal microbiota after burned yogurt intervention in healthy adultsa

（續(xù)表2）

2.4 干預(yù)方式對優(yōu)勢腸道菌結(jié)構(gòu)的影響

利用稀疏偏最小二乘-判別法（sparse partial leat square-discriminant analysis，sPLS-DA）分析了2 種干預(yù)方式（TS 和NS）人群的腸道菌群結(jié)構(gòu)差異，結(jié)果顯示2 組無顯著性差異（見圖3a）。采用線性判別分析效應(yīng)量法[linear discriminant analysis （LDA）effect size method （LEfSe）]分析了前30 種優(yōu)勢菌屬在NS 與TS 組間具有統(tǒng)計學(xué)差異的微生物，發(fā)現(xiàn)瘤胃球菌屬、雙歧桿菌屬、布勞特氏菌屬、薩特氏菌屬及未分類理研菌科、梭菌目等在TS 組占顯著優(yōu)勢，普雷沃氏菌屬、厚壁菌門的考拉桿菌屬、梭桿菌屬（Fusobacterium）為NS 組的顯著優(yōu)勢菌（圖3b）。

圖3 不同干擾方式對優(yōu)勢腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響Fig.3 Effects of different interference modes on the structure of dominant microbiota

ALDEX2 差異分析表明，擬桿菌門（Pa＜0.001）及其普雷沃氏菌（Pa＜0.001）、厚壁菌門的考拉桿菌屬（Pa＜0.001）、瘤胃球菌屬（Pa=0.008）、糞桿菌屬（Pa=0.032）及放線菌門（Pa＜0.001）與雙歧桿菌屬（Pa＜0.001）、梭桿菌門（Pa＜0.001）與梭菌屬（Pa=0.002）存在顯著差異（見表3）。其中，普雷沃氏菌屬、考拉桿菌屬、糞桿菌屬、梭菌屬豐度在NS 組顯著高于TS 組，瘤胃球菌屬、雙歧桿菌屬顯著低于TS 組，說明干預(yù)方式可顯著影響腸道菌群組成，尤其是厚壁菌門菌屬種類。此外，AKK 菌屬和乳桿菌屬在2 組樣本中沒有統(tǒng)計學(xué)差異，TS 組豐度高于NS 組。

表3 NS 與TS 組優(yōu)勢菌的差異分析aTable 3 Difference analysis of dominant microbiota between NS and TS groupa

3 討論

宏基因組測序技術(shù)已發(fā)現(xiàn)，擬桿菌門和厚壁菌門是人類腸道的核心微生物群，變形桿菌門、放線菌門和疣微菌門豐度較低[16]，但人類腸道微生物群呈現(xiàn)高度動態(tài)變化狀態(tài)，受抗生素、年齡、宿主遺傳、飲食模式和其它環(huán)境暴露因素的影響[20-23]。其中飲食是重塑腸道菌群結(jié)構(gòu)和功能最為重要也是最為迅速的因素，但確切改變時間和程度與食物種類、干預(yù)時間、個體差異相關(guān)，如補充膳食纖維情況下，有的個體1 d 就觀察到腸道菌群結(jié)構(gòu)變化，有的12 周后也沒有影響，且停止食用后可恢復(fù)[6]，只有長期的飲食習(xí)慣才能引起腸道菌群組成的重大變化[1，7]。本研究中受試者準(zhǔn)備期、干預(yù)期、洗脫期各階段腸道菌群腸的變化充分說明了飲食結(jié)構(gòu)或習(xí)慣短期內(nèi)對腸道菌群的影響（結(jié)果未示），而干預(yù)前后結(jié)果顯示，布朗旎燒酸奶干預(yù)4～6 周腸道微生物結(jié)構(gòu)多樣性顯著高于干預(yù)前（特別是TS 組，P＜0.05，圖1），厚壁菌門（未分類梭菌目、糞桿菌屬、鏈球菌屬）、擬桿菌門（擬桿菌屬、普雷沃氏菌屬）、變形菌門（嗜血桿菌屬）、放線菌門（雙歧桿菌屬）、疣微菌門（Akk 菌屬）等主要優(yōu)勢微生物（相對豐度＞1%）含量發(fā)生了不同程度的變化，其中未分類梭菌目、考拉桿菌屬、巨單胞菌屬、AKK 菌屬相對豐度在干預(yù)終點與干預(yù)前樣本中存在顯著差異（Rank test），鏈球菌屬在各觀察時間段之間具有顯著差異（ALDEX2），說明燒酸奶在增加健康人群腸道菌群結(jié)構(gòu)多樣性基礎(chǔ)上，對個體優(yōu)勢腸道菌群相對含量的調(diào)節(jié)效果在所選擇的觀察點有限，但不排除燒酸奶攝入所導(dǎo)致的腸道菌群結(jié)構(gòu)變化迅速，進(jìn)而通過改變腸道內(nèi)環(huán)境或代謝調(diào)節(jié)腸道菌群平衡[18，24]。

SCFAs 是腸道微生物群的主要代謝產(chǎn)物，對維持腸道正常內(nèi)環(huán)境、功能和機體健康具有重要作用，其中丁酸是維持腸道穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵分子[18]。發(fā)酵奶干預(yù)研究顯示，健康成年人在酸奶干預(yù)后腸道微生物群發(fā)生了變化，主要包括韋榮球菌屬、羅氏菌屬、糞桿菌屬、毛螺菌屬、糞球菌屬、乳桿菌屬、鏈球菌屬等重要產(chǎn)丁酸細(xì)菌豐度的增加，以及擬桿菌屬、嗜膽菌屬（Bilophila）等機會致病菌的降低，從而有利于人體健康[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn)燒酸奶具有對健康成人腸道菌群不完全一致的干預(yù)效果，如糞桿菌屬、毛螺菌屬、乳桿菌屬、鏈球菌屬、擬桿菌屬變化趨勢與報道類似，但糞球菌屬、羅氏菌屬、韋榮球菌屬呈降低趨勢，且與干預(yù)方式密切相關(guān)（表2、表3）。此外，燒酸奶干預(yù)還能促進(jìn)Akk菌屬、嗜血桿菌屬、未分類的梭菌目、巨單胞菌屬富集，降低普雷沃氏菌屬、考拉桿菌屬等優(yōu)勢菌豐度（表2），但除鏈球菌屬外均無統(tǒng)計學(xué)差異。而對于雙歧桿菌，有報道顯示健康人攝入含益生菌酸奶可顯著增加糞便中雙歧桿菌含量，且與性別及最初糞便中含量相關(guān)[8，25]，但也有研究發(fā)現(xiàn)，健康成年人腸道菌群的變化與酸奶干預(yù)后益生菌的攝入沒有關(guān)聯(lián)，甚至導(dǎo)致雙歧桿菌水平的下降，說明酸奶中其它成分可能也是導(dǎo)致特定微生物變化的原因[11，26]。本研究中雙歧桿菌水平干預(yù)降低，其中干預(yù)4 周末豐度為干預(yù)前的1/3（0.5%），隨著再次干預(yù)上升到0.72%。健康成人腸道菌群對燒酸奶這種差異反應(yīng)可能與燒酸奶所采用的單一發(fā)酵劑、特殊生產(chǎn)工藝所導(dǎo)致的營養(yǎng)與活性組分不同有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究采用短期小樣本干預(yù)試驗和16S 基因組學(xué)技術(shù)，獲得了性別、年齡、種族、飲食結(jié)構(gòu)基本相似的健康成人的腸道微生物結(jié)構(gòu)特征，其中厚壁菌門、擬桿菌門、變形桿菌門為主要優(yōu)勢菌門，占腸道微生物群總相對豐度的95%；擬桿菌屬、普雷沃氏菌屬、未分類的瘤胃球菌科、未分類的梭菌目、瘤胃球菌屬、柔嫩梭菌屬為主要優(yōu)勢菌屬。同時證實飲食結(jié)構(gòu)能調(diào)節(jié)健康成人腸道微生物組成，燒酸奶攝入可顯著增加腸道菌群種類多樣性和鏈球菌相對豐度，且食用習(xí)慣（干預(yù)方式）對腸道菌群結(jié)構(gòu)影響更顯著，食用時間越長越有助于保持雙歧桿菌、Akk 菌、鏈球菌等有益菌的含量。由于日常飲食動態(tài)變化和機體自身調(diào)節(jié)作用，健康人群營養(yǎng)干預(yù)更難得到準(zhǔn)確的試驗結(jié)果，需采用系統(tǒng)流行病學(xué)方法，結(jié)合基因組學(xué)、代謝組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等技術(shù)，綜合研究健康人群的營養(yǎng)干預(yù)效果，為改善健康和制定個性化的精準(zhǔn)營養(yǎng)方案提供依據(jù)[27]。此外，健康成人腸道微生物組對布朗旎燒酸奶反應(yīng)變化不同于以往報道的酸奶（含和不含益生菌）干預(yù)結(jié)果，造成這種差異的原因與機理還有待進(jìn)一步深入研究。