基于智能手機(jī)同時(shí)檢測(cè)4種獸藥殘留的免疫芯片技術(shù)

吳 穎，范叢叢，蘇曉娜，沈玉棟，譚 庶，鐘翠麗，許小炫，曾道平，楊金易,*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.溫氏食品集團(tuán)股份有限公司，廣東 云浮 527499）

獸藥在防治動(dòng)物疾病、提高生產(chǎn)效率、改善畜產(chǎn)品質(zhì)量等方面起著十分重要的作用，但部分養(yǎng)殖人員在養(yǎng)殖過程濫用獸藥，甚至使用違禁藥物、假劣藥物，造成了嚴(yán)重的獸藥殘留問題[1-5]。動(dòng)物性食物獸藥殘留在人體內(nèi)不斷的蓄積會(huì)引起人體的多種急慢性反應(yīng)，如萊克多巴胺（ractopamine，RAC）和氯霉素（chloramphenicol，CAP）對(duì)人體有毒副作用，鹽酸克侖特羅（clenbuterol，CL）有致癌風(fēng)險(xiǎn)，氟苯尼考（florfenicol，F(xiàn)F）具有一定的免疫毒性和胚胎毒性[6-10]。動(dòng)物源性食品中獸藥的殘留不僅直接危害著人類生命健康，同時(shí)也極大危害著畜牧業(yè)的發(fā)展和生態(tài)環(huán)境，已引起國(guó)際有關(guān)組織及許多國(guó)家、地區(qū)的高度重視。

現(xiàn)階段，根據(jù)我國(guó)第176號(hào)農(nóng)業(yè)部公告，RAC禁止在飼料和動(dòng)物飲用水中使用；根據(jù)我國(guó)第235號(hào)農(nóng)業(yè)部公告，CL及CAP在動(dòng)物性食品中不得檢出，F(xiàn)F在豬肉組織中殘留量不得超過300 μg/kg。研究表明，RAC、CL、CAP和FF在豬、牛等動(dòng)物體內(nèi)易殘留、消除緩慢，主要經(jīng)尿液排出體外[11-14]。通過檢測(cè)尿液中排出的藥物濃度，可對(duì)屠宰前動(dòng)物體內(nèi)藥物的殘留情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)，對(duì)有效監(jiān)控食品安全有重要意義。

目前，國(guó)內(nèi)外報(bào)道的關(guān)于RAC、CL、CAP、FF及其代謝物氟苯尼考胺（florfenicol amine，F(xiàn)FA）的傳統(tǒng)檢測(cè)方法主要包括氣相色譜法、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法、超高效液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜法等。這些方法準(zhǔn)確度高、穩(wěn)定性好，被廣泛應(yīng)用于獸藥殘留檢測(cè)[15-22]。但上述方法多數(shù)需要配合大儀器，且操作繁瑣、檢測(cè)耗時(shí)較長(zhǎng)、前處理復(fù)雜，不適用于快速檢測(cè)分析。常用快速檢測(cè)方法主要有酶聯(lián)免疫分析（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法、化學(xué)發(fā)光免疫分析法、膠體金免疫層析（colloidal gold immunochromatography assay，GICA）法等[23-27]，這些方法或需專業(yè)人員操作、或只能檢測(cè)單一指標(biāo)，無法實(shí)現(xiàn)獸藥多殘留的簡(jiǎn)便快速檢測(cè)[28-29]。免疫蛋白芯片測(cè)定方法相對(duì)于以上各種方法具有低成本、高通量、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)[30-33]。本實(shí)驗(yàn)利用免疫蛋白芯片技術(shù)建立了同時(shí)檢測(cè)豬尿中RAC、CL、CAP、FF及其代謝物FFA的方法，同時(shí)基于智能手機(jī)開發(fā)了與免疫芯片匹配的檢測(cè)應(yīng)用程序（application，APP），適用于現(xiàn)場(chǎng)大量篩選分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

驢抗山羊血清、HRP標(biāo)記羊抗鼠血清、HRP羊抗兔血清 廣州優(yōu)抗多生物技術(shù)有限公司；RAC單克隆抗體、RAC抗原、CL單克隆抗體、CL抗原、CAP單克隆抗體、CAP抗原、FF單克隆抗體、FF抗原 廣東省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；RAC（GR，100 mg/瓶）、CL（GR，100 mg/瓶）、CAP（GR，250 mg/瓶）、FF（GR，250 mg/瓶）、FFA（GR，100 mg） 德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司；紫色沉淀型單組分3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，TMB）顯色液湖州英創(chuàng)生物科技有限公司；P液：含10%蔗糖、0.4%魚明膠、0.5%酪蛋白的磷酸鹽緩沖液；T液：含8%蔗糖、0.4%魚明膠、0.5%酪蛋白的三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液；PBST：含0.1% Tween-20的磷酸緩沖液。

1.2 儀器與設(shè)備

免疫芯片反應(yīng)盒 廣東省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；硝酸纖維素膜（NC膜） 美國(guó)Millipore公司；M227fdw多功能一體機(jī) 中國(guó)惠普有限公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫芯片分析方法基本步驟

本免疫芯片測(cè)定獸藥殘留的基礎(chǔ)是目標(biāo)檢測(cè)物與抗原競(jìng)爭(zhēng)抗體的反應(yīng)。免疫芯片上固定有藥物抗原，檢測(cè)時(shí)在反應(yīng)格加入藥物的單克隆抗體和藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液或待測(cè)樣品，待抗原抗體反應(yīng)后洗滌，再加入HRP標(biāo)記二抗，反應(yīng)后洗滌并加入顯色液，最后通過顯色強(qiáng)度進(jìn)行藥物定量分析?；静襟E如下：

點(diǎn)樣包被：用碳酸鹽緩沖液（carbonate buffer solution，CBS）稀釋驢抗山羊血清作為質(zhì)控點(diǎn)樣液備用，稀釋RAC抗原、CL抗原、CAP抗原、FF抗原作為檢測(cè)點(diǎn)樣液備用。將孔徑為0.22 μm的NC膜裁剪成合適大小，粘貼于PVC板上后置于反應(yīng)盒中，吸取點(diǎn)樣液按照0.5 cm×0.5 cm的間距點(diǎn)樣，每個(gè)樣品點(diǎn)樣量為1 μL。將點(diǎn)樣芯片置于37 ℃恒溫水浴鍋中孵育1 h使蛋白質(zhì)固定在芯片上。

封閉：包被抗原或抗體后的NC膜上尚有未被抗原或抗體填充的空隙，需對(duì)NC膜進(jìn)行封閉處理，防止非特異性吸附。將上述芯片用PBST洗滌2 次，雙蒸水洗滌1 次，反應(yīng)格中加入500 μL含1%牛血清蛋白的封閉液，于37 ℃封閉30 min。

一抗孵育：將上述芯片用PBST洗滌2 次，雙蒸水洗滌1 次。反應(yīng)格中加入T液稀釋的單克隆抗體及標(biāo)準(zhǔn)品溶液或待測(cè)樣品液，置于搖床上反應(yīng)15 min。

二抗孵育：將上述芯片用PBST、雙蒸水各洗滌2 次。反應(yīng)格中加入200 μL用T液稀釋的HRP標(biāo)記羊抗鼠、HRP標(biāo)記羊抗兔混合液，置于搖床上反應(yīng)15 min。

顯色反應(yīng)：將上述芯片用PBST、雙蒸水各洗滌2 次。反應(yīng)格中加入200 μL TMB顯色液，反應(yīng)3 min，隨后將芯片取出置于潔凈濾紙，風(fēng)干后用掃描儀掃描，運(yùn)用Photoshop軟件獲取顯色斑點(diǎn)灰度值進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與智能手機(jī)檢測(cè)系統(tǒng)的建立

以確定的最佳工作質(zhì)量濃度、最佳反應(yīng)條件制備免疫芯片，以6 個(gè)不同質(zhì)量濃度的藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)質(zhì)量濃度重復(fù)3 次，使用廣東省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的智能手機(jī)APP“天眼測(cè)”獲取芯片顯色斑點(diǎn)灰度值與空白值（CBS點(diǎn)樣）的差值ΔI，以藥物質(zhì)量濃度（ng/mL）為橫坐標(biāo)，灰度值差值ΔI作為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在檢測(cè)軟件中添加獸藥殘留檢測(cè)項(xiàng)目，導(dǎo)入RAC、CL、CAP、FF獸藥殘留檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線。檢測(cè)時(shí)配合實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的圖片采集暗箱裝置，運(yùn)行檢測(cè)APP識(shí)別芯片顯色斑點(diǎn)，軟件即可顯示獸藥殘留濃度并做出陰陽(yáng)性判斷。

1.3.3 基于智能手機(jī)檢測(cè)獸藥多殘留免疫芯片分析方法的驗(yàn)證評(píng)價(jià)

選取經(jīng)HPLC確證未被RAC、CL、CAP及FF污染的20 份豬尿樣品，離心取上清液后向其中分別添加3 種質(zhì)量濃度的RAC、CL、CAP、FF/FFA藥物標(biāo)準(zhǔn)品，采用基于智能手機(jī)免疫芯片的分析方法進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算檢測(cè)限（limit of detection，LOD），分析其添加回收率與批內(nèi)、批間變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）。

1.3.4 與其他快速檢測(cè)方法比較實(shí)驗(yàn)

采集30 份豬尿樣品，經(jīng)前處理后向豬尿中添加不同質(zhì)量濃度的RAC、CL、CAP、FF/FFA標(biāo)準(zhǔn)品，采用基于智能手機(jī)的免疫芯片的分析方法進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)與市售膠體金免疫層析檢測(cè)卡、ELISA試劑盒檢測(cè)進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 NC膜孔徑、點(diǎn)樣液、抗體稀釋液的選擇及反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化

NC膜固定蛋白質(zhì)的能力與其孔徑大小相關(guān)，對(duì)于低分子質(zhì)量的蛋白，NC膜孔徑越小，膜結(jié)合越牢固；點(diǎn)樣稀釋液、抗體稀釋液的選擇影響抗體、抗原在液體中的分散均勻性、顯色效果，從而影響芯片檢測(cè)靈敏度；抗原包被時(shí)間影響蛋白質(zhì)固定效果及有效性；顯色反應(yīng)時(shí)間影響顯色效果，反應(yīng)時(shí)間太短則顯色不明顯，反應(yīng)時(shí)間太長(zhǎng)易產(chǎn)生背景干擾。

選用孔徑大小分別為0.22、0.45 μm的NC膜作為固定蛋白質(zhì)的載體制備檢測(cè)單種獸藥殘留的免疫蛋白芯片，選用CBS和PBS作為點(diǎn)樣稀釋液稀釋驢抗羊血清與抗原，選用P液、T液、PBS作為抗體稀釋液稀釋單克隆抗體，選擇0.5、1、2、8 h作為包被時(shí)間固定蛋白質(zhì)，選擇1、3、5、10、20 min作為顯色時(shí)間進(jìn)行顯色反應(yīng)，觀察芯片顯色效果與檢測(cè)靈敏度。結(jié)果顯示，當(dāng)使用0.22 μm的NC膜作為蛋白固定載體、CBS作為點(diǎn)樣稀釋液、T液作為抗體稀釋液時(shí)，顯色反應(yīng)后芯片背景干擾較少、點(diǎn)樣斑點(diǎn)形狀較規(guī)則、顯色較均勻、靈敏度較高；當(dāng)包被時(shí)間為1 h（37 ℃）時(shí)芯片對(duì)蛋白固定量最大，斑點(diǎn)顯色最深；顯色反應(yīng)時(shí)間3 min時(shí)斑點(diǎn)顯色明顯，背景干擾較少。

2.2 抗原、抗體最佳工作質(zhì)量濃度的優(yōu)化

抗原、抗體的工作質(zhì)量濃度影響芯片顯色效果與檢測(cè)靈敏度，隨著點(diǎn)樣抗原與抗體質(zhì)量濃度的增高，芯片斑點(diǎn)顯色越深，灰度值越高，藥物與抗原競(jìng)爭(zhēng)抗體的反應(yīng)越不明顯，靈敏度越低。使用棋盤法優(yōu)化本實(shí)驗(yàn)中抗原、抗體的最佳工作質(zhì)量濃度，各抗原、抗體稀釋倍數(shù)如表1所示。

表1 各抗原、抗體稀釋倍數(shù)的確定Table 1 Determination of optimal dilution factors of coating antigens and monoclonal antibodies

在綜合檢測(cè)斑點(diǎn)顯色強(qiáng)度、競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)靈敏度、原料用量的基礎(chǔ)上，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果最終確定RAC抗原、CL抗原、CAP抗原、FF抗原最佳稀釋倍數(shù)為1∶1 000、1∶500、1∶2 500、1∶100，RAC抗體、CL抗體、CAP抗體、FF抗體最佳稀釋倍數(shù)分別為1∶30 000、1∶400 000、1∶300 000、1∶200 000。在最優(yōu)反應(yīng)條件下，免疫芯片對(duì)RAC、CL、CAP、FF的檢測(cè)靈敏度分別為2、2、0.5、50 ng/mL。免疫芯片檢測(cè)不同質(zhì)量濃度RAC的結(jié)果如圖1所示（CL、CAP、FF檢測(cè)結(jié)果圖類似不再列出）。

圖1 免疫芯片分析RAC殘留的檢測(cè)靈敏度Fig. 1 Sensitivity of immunochip assay for RAC

2.3 抗體特異性與交叉反應(yīng)評(píng)價(jià)

當(dāng)4 種檢測(cè)項(xiàng)目集成于同一免疫芯片時(shí)，4 種檢測(cè)對(duì)象的抗原-抗體-藥物之間特異性影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。根據(jù)間接競(jìng)爭(zhēng)的原理，對(duì)抗原-抗體-藥物之間的特異性進(jìn)行評(píng)價(jià)。以確定的最優(yōu)條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將免疫芯片裁剪成2.5 cm×0.5 cm，吸取質(zhì)控、檢測(cè)點(diǎn)樣液按照5×1（驢抗山羊血清、RAC抗原、CL抗原、CAP抗原、FF抗原）陣式點(diǎn)樣，其余步驟如1.3.1節(jié)，其中一抗孵育時(shí)1～4號(hào)點(diǎn)樣芯片所在反應(yīng)格中分別加入RAC單克隆抗體、CL單克隆抗體、CAP單克隆抗體、FF單克隆抗體和緩沖溶液，5～8號(hào)點(diǎn)樣芯片所在反應(yīng)格中加入4 種藥物單克隆抗體的混合液及RAC、CL、CAP、FF單種藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液。

從圖2a可知，使用包被了驢抗羊血清及多種藥物抗原的免疫芯片進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，當(dāng)一抗孵育只加入一種單克隆抗體及緩沖液時(shí)，只有質(zhì)控區(qū)及該單克隆抗體對(duì)應(yīng)的抗原包被區(qū)顯現(xiàn)斑點(diǎn)，其余抗原包被區(qū)不顯現(xiàn)斑點(diǎn)，說明該實(shí)驗(yàn)中一種單克隆抗體只與驢抗羊血清及其所對(duì)應(yīng)的抗原產(chǎn)生特異性結(jié)合，不與其余3 種藥物抗原發(fā)生明顯特異性結(jié)合。從圖2b可看出，當(dāng)一抗孵育只加入混合抗體及單種藥物標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)，只有該藥物對(duì)應(yīng)檢測(cè)區(qū)不顯現(xiàn)斑點(diǎn)，說明一種藥物只特異性抑制對(duì)應(yīng)藥物抗原與其單克隆抗體的結(jié)合，對(duì)其余3 種藥物抗原與其對(duì)應(yīng)抗體的結(jié)合無明顯抑制。由此可知，各抗體對(duì)其抗原的特異性較好，同時(shí)檢測(cè)4 種獸藥殘留時(shí)各對(duì)象的檢測(cè)無明顯干擾。

圖2 抗體特異性分析（a）和各分析物交叉反應(yīng)（b）結(jié)果Fig. 2 Evaluation of antibody specificity (a) and cross-reactivities between analytes (b)

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以藥物質(zhì)量濃度（ng/mL）為橫坐標(biāo)、灰度值差值ΔI作為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線方程及免疫芯片檢測(cè)4 種獸藥殘留的分析參數(shù)如表2所示，該方法對(duì)RAC、CL、CAP、FF的檢出限（20 份空白樣品平均值與3 倍標(biāo)準(zhǔn)差的和）分別為0.146、0.137、0.035、3.7 3 n g/m L，線性范圍（I C20～I(xiàn) C80）分別為0.35 3 ～1.0 17、0.309～0.897、0.082～0.249、9.424～35.594 ng/mL，相關(guān)系數(shù)大于0.99。

表2 免疫芯片檢測(cè)4 種獸藥殘留的分析參數(shù)Table 2 Figures of merit of the immunochip assays for the detection of four veterinary drugs

使用本方法測(cè)出FFA的IC50，計(jì)算交叉反應(yīng)率（交叉反應(yīng)率/%=IC50（FF）/IC50（FFA）×100）。結(jié)果顯示IC50（FFA）為22.465 ng/mL，交叉反應(yīng)率為81.5%。說明該方法可同時(shí)檢測(cè)FF與FFA。

2.5 基于智能手機(jī)檢測(cè)獸藥多殘留免疫芯片分析方法的準(zhǔn)確度、精密度

使用20 份豬尿樣品進(jìn)行藥物添加檢測(cè)，回收率與CV如表3所示，添加回收率在85.69%～110.66%之間，批內(nèi)CV不高于12.53%，批間CV小于15%。由此可見，本方法具有良好的回收率，可同時(shí)檢測(cè)豬尿樣品中RAC、CL、CAP、FF/FFA的殘留量。

表3 豬尿中各藥物回收率和CV值Table 3Recoveries and inter-batch and intra-batch coefficients of variation of four veterinary drugs spiked into pig urine samples

2.6 與其他快速檢測(cè)方法比較結(jié)果

使用基于智能手機(jī)的免疫芯片法、GICA、ELISA法檢測(cè)豬尿中RAC、CL、CAP、FF/FFA殘留量，檢測(cè)結(jié)果如表4所示，免疫芯片法與市售膠體金免疫層析法檢測(cè)結(jié)果的符合率為99.2%、與ELISA法檢測(cè)結(jié)果的符合率為98.3%，說明本方法與常用快速檢測(cè)方法相比有較高的符合性，可用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)豬尿中RAC、CL、CAP、FF/FFA的殘留量。

表4 免疫芯片法與GICA法、ELISA試劑盒法檢測(cè)結(jié)果對(duì)比Table 4 Comparison of results of detection using immunochip assay,GICA and ELISA

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)研制了基于智能手機(jī)檢測(cè)多種獸藥的免疫芯片，能同時(shí)檢測(cè)豬尿中RAC、CL、CAP、FF及其代謝物FFA。該方法對(duì)RAC、CL、CAP、FF的檢出限分別為0.146、0.137、0.035、3.73 ng/mL，線性范圍分別為0.353～1.017、0.309～0.897、0.082～0.249、9.424～35.594 ng/mL。豬尿中藥物添加回收率為85.69%～110.66%，批內(nèi)CV不高于12.53%，批間CV小于15%，與GICA和ELISA兩種傳統(tǒng)快速檢測(cè)方法相比檢測(cè)符合率大于98%，是一種方便快速、高通量、低成本檢測(cè)多種獸藥殘留的方法，適用于現(xiàn)場(chǎng)大量篩選分析。