丹參DNA提取方法的優(yōu)化研究

吳慧

（1.山東衛(wèi)康醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)有限公司，淄博市精準(zhǔn)基因檢測(cè)關(guān)鍵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 淄博 255000；2.山東省遺傳性疾病基因檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用示范中心，山東 濟(jì)南 250000）

0 引言

目前，提取高質(zhì)量DNA的方法較多，但沒(méi)有一種是被國(guó)際認(rèn)可的高質(zhì)量提取方法[1-2]。本研究以盆栽陜西商洛一年生紫花丹參的葉片為研究對(duì)象，對(duì)比分析了四種高質(zhì)量丹參DNA提取方法的效果，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2019年6月至2019年9月，針對(duì)丹參DNA提取方法展開(kāi)了相應(yīng)研究，選取盆栽陜西商洛一年生紫花丹參的葉片為研究材料。

試劑：（1）SDS緩沖液：Tris-HCl緩沖液、NaCI各有100mmol/L（PH值為8.0），EDTA有50mmol/L（PH值為8.0），濃度為2%的SDS（g/100mL），常規(guī)滅菌后，備用。（2）CTAB緩沖液：Tris-HCl緩沖液有100mmol/L（PH值為8.0），NaCI有4mmol/L，EDTA有20mmol/L（PH值為8.0），濃度為2%的CTAB（g/100mL）。（3）l×TE緩 沖 液：Tris-HCl緩沖液有10mmol/L（PH值為8.0），EDTA有1mmol/L（PH值為8.0）。

1.2 方法

SDS法1與SDS法2：取適量新鮮丹參葉片，置入液氮低溫中進(jìn)行研磨，研磨完成后將葉片置入預(yù)冷離心管，將600μLSDS緩沖液預(yù)熱（已預(yù)熱至65℃），然后給予65℃的水?。?-2h），水浴期間輕搖數(shù)次，充分混勻后加入等體積酚/氯仿，離心分離10min，提取上清液，加入預(yù)冷異丙醇，充分混勻后，在-30℃環(huán)境下靜置10min，在4℃環(huán)境下離心3min。祛除上清液，使用濃度為70%的洗滌沉淀，連續(xù)2-3次后，自然干燥。SDS法1：加入50μLl×TE緩沖液在室溫下溶解。SDS法2：加入3μLLRNAase在37℃環(huán)境下保溫1h。然后加入等體積酚/氯仿，充分搖勻后，在4℃環(huán)境下離心10min。取上清液置入另一試管中，置入等體積氯仿，充分搖勻后，在4℃環(huán)境下離心10min。取上清液置入試管中，在試管中加入十分之一NaAc，給予2倍無(wú)水乙醇（冷），充分混勻后靜置，在4℃環(huán)境下離心3min。祛除上清液，使用濃度為70%的洗滌沉淀，連續(xù)2-3次后，自然干燥，加入50μLl×TE緩沖液在室溫下溶解[3-4]。

CTAB法與改良版CTAB法：將50mg研磨丹參葉片粉置入預(yù)冷離心管，在離心管添加600μLCTAB緩沖液（已預(yù)熱至65℃），然后給予65℃的水浴1h，水浴期間輕搖數(shù)次，充分混勻。在4℃環(huán)境下離心10min，取上清液置入另一離心管，加入等體積異戊醇，持續(xù)輕搖10min，在4℃環(huán)境下離心15min。CTAB法：提取上清液置入另一離心管，加入等體積異戊醇，持續(xù)輕搖10min，在4℃環(huán)境下離心10min，提取上清液置入另一離心管；改良版CTAB法：提取上清液置入另一離心管，添加2μLNAase，給予37℃的水浴，加入等體積異戊醇，持續(xù)輕搖10min，在4℃環(huán)境下離心1,5min，提取上清液置入另一離心管。在新管中添加3mL十分之一體積的NaAc與等體積異戊醇，充分混勻后在4℃環(huán)境下離心5min，祛除上清液，加入濃度為70%的洗滌沉淀，連續(xù)2-3次后，自然干燥，加入50μLl×TE緩沖液在室溫下溶解[5]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 四種DNA提取方法的電泳檢測(cè)結(jié)果比較

電泳圖顯示，CTAB法與SDS法1均存在DNA主帶，均能有效提取丹參核總DNA，但提取質(zhì)量存在一定差異。其中CTAB法的電泳圖有較為明顯的彌散，點(diǎn)樣孔比較亮，RNA較多，蛋白質(zhì)污染較多。而SDS法1的電泳圖彌散不明顯，點(diǎn)樣孔的亮度比較低，RNA、蛋白質(zhì)污染相較于CTAB法更少，且DNA主帶亮度更低。由此可見(jiàn)CTAB法的提取質(zhì)量劣于SDS法1。而SDS法2、改良版CTAB法提取的DNA無(wú)明顯彌散，點(diǎn)樣孔的亮度偏低，意味著兩種提取方法均可有效清除RNA、蛋白質(zhì)污染。但是，SDS法2是一種基于SDS法1的提取方法，依然無(wú)法有效祛除酚類氧化物質(zhì)污染，所以DNA產(chǎn)率偏低。而改良版CTAB法可避免RNAase的負(fù)面影響，在有效祛除DNA、蛋白質(zhì)污染的同時(shí)，可簡(jiǎn)化提取步驟，可提高DNA產(chǎn)率。因此，改良版CTAB法的DNA提取質(zhì)量大于SDS法2、CTAB法、SDS法1（P＜0.05）。

2.2 四種DNA提取方法的濃度、純度比較

四種DNA提取方法提取的丹參DNA濃度、純度存在明顯差異（P＜0.05），詳情見(jiàn)表1。

表1 四種DNA提取方法的濃度、純度比較

3 討論

DNA分子標(biāo)記是建立在提取高質(zhì)量DNA的前提下，因此需要有效、快速提取植物中的DNA，提取的DNA質(zhì)量也直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)構(gòu)[6]。高質(zhì)量DNA必須高純度、無(wú)降解、高分子量、無(wú)蛋白污染、無(wú)糖類污染、無(wú)鹽類污染等雜質(zhì)污染[7]。而AFLP分子標(biāo)記模板對(duì)DNA有更高的要求。主要是因?yàn)楦哔|(zhì)量DNA可進(jìn)行完全酶切，具有高特異性，高連接效率，高重復(fù)性，獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相對(duì)可靠準(zhǔn)確。臨床有研究[8-9]指出，相較于SDS法1，SDS法2的提取質(zhì)量（DNA產(chǎn)率高，污染少）更優(yōu)。也有研究[4]指出，改良版CTAB法提取丹參葉片DNA的濃度2.345、純度356與CTAB法的濃度2.118、純度706存在顯著差異。從本研究結(jié)果可看出，相較于SDS法2、CTAB法、SDS法1這三種DNA提取方法，改良版CTAB法提取丹參葉片DNA，質(zhì)量最好。

由上可知，改良版CTAB法可有效提取丹參DNA。