徐小云 劉發(fā)英 萬磊

[摘要] 目的 分離提純培養(yǎng)子宮腺肌?。ˋM）內(nèi)膜間質(zhì)細胞（ESc），檢測其細胞功能的差異，為進一步的細胞及分子水平研究奠定基礎(chǔ)。 方法 選取2013年1月至2016年12月份在本院治療的正常子宮內(nèi)膜和子宮腺肌病手術(shù)病例，在嚴格無菌條件下，收集臨床確診的AM患者在位子宮內(nèi)膜組織12例、異位子宮內(nèi)膜組織41例及正常對照內(nèi)膜組織13例，分別分離培養(yǎng)ESc，并通過免疫組織化學(xué)法對分離提純培養(yǎng)的細胞進行鑒定。分別檢測三種細胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡等細胞功能。 結(jié)果 正常人ESc 13例，AM患者在位12例、異位ESc原代分離41例均成功，成功率為100.00%。與正常在位ESc相比，在位、異位ESc在普通光鏡下，形態(tài)觀察無明顯差異，但是細胞功能方面，在位ESc生長曲線顯示增殖率明顯升高;異位ESc的遷移、侵襲率水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），三種細胞凋亡無明顯差異。 結(jié)論 采用間質(zhì)細胞原代培養(yǎng)方法可以成功培養(yǎng)AM ESc，并保持較高的細胞培養(yǎng)成功率。在位ESc增殖率最高，異位ESc的遷移、侵襲率水平升高，細胞凋亡均無明顯差異。

[關(guān)鍵詞] 子宮腺肌病;原代細胞;細胞培養(yǎng);細胞功能

[中圖分類號] R711.7? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2021）03-0032-06

Culture and functional identification of primary mesenchymal cells in adenomyosis

XU Xiaoyun1? ?LIU Faying2? ?WAN Lei1

1.Department of Quality Control， Jiangxi Maternal and Child Health Hospital， Nanchang? ?330006， China; 2.Central Laboratory， Jiangxi Maternal and Child Health Hospital， Nanchang? ?330006， China

[Abstract] Objective To isolate， purify and culture endometrial stromal cells （ESc） of adenomyosis （AM）， and to detect the difference of cell function， so as to lay a foundation for further research at the cellular and molecular levels. Methods The normal endometrial and adenomyosis surgical cases treated in our hospital from January 2013 to December 2016 were selected. Under strict aseptic conditions，12 cases of eutopic endometrial tissues，41 cases of ectopic endometrial tissues and 13 cases of normal control endometrial tissues of clinically diagnosed patients with AM were collected.ESc were isolated and cultured， and the isolated and purified cells were identified by immunohistochemistry. The proliferation， migration， invasion and apoptosis of the three types of cells were detected. Results 13 cases of normal human ESc， 12 cases of patients with eutopic AM and 41 cases of ectopic ESc were successfully isolated， with a success rate of 100.00%. Compared with normal eutopic ESc， the morphology of eutopic and ectopic ESc was not significantly different under ordinary optical microscope， but the proliferation rate of eutopic ESc was significantly increased in terms of cell function. The migration and invasion rates of ectopic ESc were significantly increased（P<0.01）， and there was no significant difference among the three types of apoptosis. Conclusion AM ESc can be successfully cultured by using the primary culture method of mesenchymal cells， and a high success rate of cell culture can be maintained. The proliferation rate of eutopic ESc is the highest， the migration and invasion rate of ectopic ESc increases， and there is no significant difference in apoptosis.

[Key words] Adenomyosis; Primary cells; Cell culture; Cell function

子宮腺肌?。ˋdenomyosis，AM）是子宮內(nèi)膜中的腺體和間質(zhì)細胞侵入子宮肌層，并在其中彌漫或局限性生長的一種良性疾病，多發(fā)于育齡期女性，經(jīng)產(chǎn)婦多見，可能與剖宮產(chǎn)、人工流產(chǎn)等宮腔操作手術(shù)量的增加有關(guān)。AM的主要臨床表現(xiàn)為經(jīng)期延長、淋漓不盡、經(jīng)量增多、進行性加重的痛經(jīng)和生育能力降低，從而大大降低了這類女性的生活質(zhì)量，特別是有生育要求的婦女。近年來，AM發(fā)病率呈明顯的上升趨勢，且發(fā)病年齡年輕化，臨床對該病的重視程度也日益增加。AM的發(fā)病機制涉及面很廣，也尚未完全明朗，現(xiàn)廣泛認為其發(fā)生發(fā)展受多種因素影響和控制[1]。目前常見和研究較多的方向主要為子宮基底內(nèi)膜缺陷、局部免疫因素、血管生成能力、生長因子的作用、細胞凋亡功能的改變和甾體激素水平的變化[2-5]等。AM雖然表現(xiàn)為一種良性疾病，但卻具有惡性腫瘤的生長特點，有研究指出，與正常子宮內(nèi)膜細胞相比，AM異位內(nèi)膜細胞的增殖能力較強，而細胞凋亡減弱，這種細胞增殖能力與凋亡水平的失衡可能就是這種疾病的發(fā)病機制之一[6-7]。本課題旨在研究在AM患者在位、異位子宮內(nèi)膜組織中提取、分離出子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞（Endometrial stromal cells，ESc）;找出AM異位ESc與正常ESc在細胞功能學(xué)上的差異，以求從分子水平找到子宮腺肌病的發(fā)病機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 標本采集? 選取2013年1月至2016年12月在本院治療的正常子宮內(nèi)膜和手術(shù)后經(jīng)病理證實的子宮腺肌病患者在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜組織，按照課題設(shè)計的納入標準入選。

1.1.2 主要儀器? 倒置顯微鏡（Nikon有限公司）、熒光倒置顯微鏡（日本Olympus公司）、二氧化碳培養(yǎng)箱（美國SHEL LAB公司）、酶標儀（美國Bio-RAD公司）、96孔板（Costar 公司）、Transwell小室（美國BD公司）、800臺式低速離心機（上海醫(yī)療器械有限公司）、低溫離心機（美國Thermo Scientific公司）、LT電子天平（美國Mettler公司）、微量移液器（德國Eppendorf公司）、超低溫箱（-80℃，日本Sanyo公司）、液氮罐（四川亞西橡膠機器有限公司）、數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海浦光儀器廠）、SW-CJ-2FD型超凈化工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）、立式高壓蒸汽滅菌器（上海博迅實業(yè)有限公司）。

1.1.3 主要試劑? DMEM/F-12培養(yǎng)基（Hyclone公司）、胰蛋白酶消化液、RIPA液（Solarbio公司）、胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS，Hyclone公司）、磷酸緩沖鹽溶液（Phosphate buffer saline，PBS，索萊寶公司）、青霉素、鏈霉素混合液（Biopopped公司）、SDS（美國Sigma公司）、溴酚藍（美國Sigma公司）、Tris-base（Tocris Bioscience公司）、DAB顯色試劑盒（中杉金橋公司）、波形蛋白、角蛋白、山羊抗兔抗體（中杉金橋公司）、BD Pharmingen 556547Annexin V FITC APOPTOSIS Detection KIT Ⅰ（美國BD公司）、結(jié)晶紫、BD Matrigel（美國BD公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 入選及分組標準? 本研究選擇的子宮腺肌病組為2013年1月至2016年12月在江西省婦幼保健院行手術(shù)治療，術(shù)后病理診斷為子宮腺肌病患者，入選41例;患者平均年齡（40.75±2.95）歲，取月經(jīng)增殖期在位子宮內(nèi)膜組織12例及子宮腺肌病病灶組織41例。正常對照組為同期的卵巢良性腫瘤（經(jīng)病理檢查證實屬單純囊腫，畸胎瘤等）的患者，入選13例;患者平均年齡（45.55±3.52）歲，取月經(jīng)增殖期在位子宮內(nèi)膜組織。入選的所有患者均已排除了各類腫瘤、內(nèi)分泌疾病、結(jié)核、近半年甾體類激素治療等病史，且未處于哺乳期。所有標本采集申請經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核通過，并經(jīng)患者知情同意。

1.2.2 取材方法? 新鮮的子宮內(nèi)膜離體后，無菌存放，迅速以冰盒轉(zhuǎn)運，組織經(jīng)無菌PBS液沖洗干凈后，用無菌組織剪剪碎后分兩部分處理：①分裝至凍存管，經(jīng)液氮預(yù)處理，隨后保存于-80℃冰箱中;②進行一下步的分離ESc。

1.2.3 子宮內(nèi)膜間質(zhì)原代細胞分離培養(yǎng)? 在取得新鮮AM在位、異位及正常人子宮內(nèi)膜組織時需嚴格遵循無菌要求，立體后即刻放入冰盒轉(zhuǎn)運至實驗室（此過程需在30 min之內(nèi)完成）。在文獻[8]中提供的EMs原代細胞培養(yǎng)方法的基礎(chǔ)上，不斷實踐及改良，摸索出AM ESc原代分離的方法。具體分離操作：①將新鮮離體的子宮內(nèi)膜組織放入超凈臺，PBS沖洗干凈后用滅菌組織剪剪碎至大小為0.5～1.0 mm3的組織碎片;②將組織碎片加入以9∶1的比例配置DMEM/F-12和稀釋的Ⅳ型膠原酶的混合培養(yǎng)液;③上述混合物混勻后轉(zhuǎn)移至10 mL離心管，再置入恒溫水浴鍋（37℃，2～3 h）消化，間隔15～20 min混勻一次;④消化后的組織懸液分別過80目和300目滅菌篩網(wǎng)（注：過80目和200目篩網(wǎng)，200目篩網(wǎng)上的未濾過組織離心可獲得原代腺上皮細胞，因原AM代上皮細胞無法傳代，細胞數(shù)量無法達到功能學(xué)檢測的要求，故未贅述）;⑤過濾液離心（1000 r/min、6～8 min）2次，其間以PBS液吹勻;⑥離心完畢后組織加入含10% FBS DMEM/F-12培養(yǎng)液重懸，移入培養(yǎng)瓶，孵箱培養(yǎng)（37℃，5% CO2，3～4 h）;⑦24 h內(nèi)即可觀察到細胞貼壁，更換培養(yǎng)液得到ESc，一般原代培養(yǎng)ESc 5～7 d可長滿。

1.2.4 子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞性質(zhì)鑒定? 通過免疫組織化學(xué)方法檢測ESc中波形蛋白、角蛋白的表達，具體步驟為：①培養(yǎng)：將細胞接種至六孔板培養(yǎng)，劃分為三組：波形蛋白組、角蛋白組、空白對照組，細胞生長至80%時進行操作;②固定：4%多聚甲醛固定，4℃條件下避光處理30 min;③封閉：3% H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶，室溫下靜置10 min后PBS輕柔清洗;④孵育抗體：一抗：在三個組分別加入波形蛋白稀釋液（1∶70）、角蛋白稀釋液（1∶100）、PBS，量以鋪滿細胞為宜，孵箱孵育1 h;二抗：PBS沖洗后，加山羊抗兔（1∶500）孵箱孵育30 min;⑤顯色：DAB顯色10 min;⑥蘇木素復(fù)染0.5 min，自來水返藍后在熒光顯微鏡下觀察。

1.2.5 細胞功能檢測

1.2.5.1 CCK8法檢測細胞增殖功能? 備制單細胞懸液，細胞計數(shù)后，將細胞密度調(diào)整為1×104個/mL接種于96孔板內(nèi)，每種細胞接種5個復(fù)孔，并設(shè)置一調(diào)零孔，只加100 μL培養(yǎng)基，周圍用PBS填充，共接種4塊96孔板，孵箱孵育（37℃，5% CO2）;分別于12、24、48、72 h取出一塊96孔板，觀察細胞貼壁情況，每孔加入CCK8溶液10 μL后孵育4 h;酶標儀檢測以上各孔吸光率，即OD值（波長：450 nm）。共選擇正常、在位、異位細胞各10例進行重復(fù)試驗。

1.2.5.2 Transwell法檢測細胞的遷移和侵襲功能? 遷移功能的檢測使用Transwell chambers，將細胞消化后用無血清的DMEM培養(yǎng)基重懸，細胞懸液進行細胞計數(shù)。每個遷移試驗小室的下部以含20%胎牛血清的500 μL DMEM填充，每個小室的上部接種約1×105個細胞。孵箱孵育22 h后，用100%甲醇固定（室溫，10～30 min），0.5%結(jié)晶紫染15～30 min，在顯微鏡下觀察Transwell膜底部的細胞數(shù)量，每個小室隨機選擇9個視野，取平均值進行統(tǒng)計。侵襲功能也是通過這種方式進行，不同的是Transwell上室底部以Matrigel覆蓋，余步驟相同。共選擇正常、在位、異位細胞各10例進行重復(fù)試驗。

1.2.5.3 Annexin V-PI雙染色法檢測細胞凋亡? 取105個細胞，離心（1000 r/min，5 min），每管加入100 μL Binding Buffer，重懸，按分組分別加入以下試劑：①空白對照：無染料加入;②對照a：加入5 μL Annexin V-FITC;③對照b：加入5 μL PI;④樣本管：加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI。室溫下避光孵育15 min，分別加入400 μL的Binding Buffer，吹打混勻后在1 h內(nèi)上機，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。共選擇正常、在位、異位細胞各10例進行重復(fù)試驗。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。采用方差分析后多重比較來分析各類間質(zhì)細胞數(shù)量，計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用F檢驗，檢驗水準α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AM子宮內(nèi)膜間質(zhì)原代細胞分離培養(yǎng)

收集培養(yǎng)的三組組織均分離培養(yǎng)成功，成功率可達100.00%。在普通光學(xué)顯微鏡下觀察可見ESc貼壁生長，形態(tài)呈長梭形，細胞核圓形，基本居中。

2.2 AM子宮內(nèi)膜間質(zhì)原代細胞波形蛋白鑒定

分離的每株細胞均進行細胞鑒定，分別用波形蛋白抗體、角蛋白抗體、空白對照液體對ESc進行鑒定，DAB顯色。細胞鑒定結(jié)果（封三圖1）顯示：波形蛋白抗體組AM細胞的胞質(zhì)呈棕黃色改變（封三圖1a），角蛋白抗體組（封三圖1b）和空白對照組（封三圖1c）的AM細胞胞質(zhì)不顯色。

2.3 AM異位ESCs和正常對照ESCs細胞功能學(xué)的差異

2.3.1 細胞增殖檢測? CCK8法以細胞生長時間及對應(yīng)的OD值做細胞生長曲線，在各組細胞試驗中，除1次出現(xiàn)細胞污染，其余組別均試驗成功，先取其中一次結(jié)果顯示（表1，封三圖2），在位ESc組>異位ESc組>正常對照。將獲取的各組細胞在五個不同時間點的OD值，采用單因素方差分析，進行組內(nèi)比較后在進行多重比較，探討其統(tǒng)計學(xué)意義，結(jié)果顯示，三組細胞在5個時間點兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2～6。

2.3.2 細胞遷移檢測? 10組細胞的Transwell重復(fù)試驗結(jié)果一致，均顯示間質(zhì)細胞的遷移能力：子宮腺肌病異位ESc組>子宮腺肌病在位ESc組>正常對照組（封三圖3，其中a為正常對照組，b為子宮腺肌癥在位Esc組，c為子宮腺肌病異位ESc組），三組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖1，表7。

2.3.3 細胞侵襲檢測? 10組細胞的Transwell重復(fù)試驗結(jié)果一致，顯示間質(zhì)細胞的侵襲能力：異位ESc組>在位ESc組>正常對照組，經(jīng)統(tǒng)計差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見封三圖4，圖2，表8。

2.3.4 細胞凋亡的檢測? 10組細胞凋亡試驗重復(fù)試驗結(jié)果一致，流式細胞儀檢測細胞凋亡結(jié)果比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖3）。

3 討論

子宮肌腺病是由于子宮內(nèi)膜中的成分入侵子宮肌層，彌漫性或局限性生長而導(dǎo)致的。此病在育齡期婦女較為常見，保守治療效果不佳且發(fā)病率逐年升高，日漸引起了人們的關(guān)注。既往研究認為AM在疾病發(fā)生、發(fā)展上與子宮內(nèi)膜異位癥（Endometriosis，EMs）有很多相似之處[9]，但是隨著對這兩種疾病研究的不斷深入，研究發(fā)現(xiàn)AM與EMs除了發(fā)病部位外，還有很多的不同，所以現(xiàn)在AM已經(jīng)漸漸的與EMs區(qū)分開來，進行單獨的研究。AM的發(fā)病機制涉及因素較多，研究并不深入，目前可查閱的國內(nèi)外文獻報道中主要涉及以下因素：①子宮內(nèi)膜的侵入學(xué)說;②甾體激素，尤其是雌激素的影響最為深入也研究的最多[4，10];③細胞功能的改變：如增殖和凋亡調(diào)控的失常;④整體和局部的免疫異常;⑤基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinase，MMPs）的表達異常[11];⑥腺苷酸依賴的蛋白激酶（Adenylate dependent protein kinase，AMPK）的高表達[13]。

子宮腺肌癥因既往歸類于子宮內(nèi)膜異位癥，其單獨的細胞功能學(xué)研究可查閱的資料有限。近年來，研究已證實MMPs在AM中起著非常重要的作用，MMPs是細胞外基質(zhì)降解和重建過程中最關(guān)鍵的一組蛋白酶，在它的作用下初期向子宮肌層侵潤的細胞是子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞，繼而是內(nèi)膜腺細胞侵潤。郭鳳羽等[12]發(fā)現(xiàn)，不論是mRNA水平還是蛋白水平，孕激素受體的表達在腺肌癥小鼠子宮中低于正常小鼠，雌激素受體和MMP-2的表達高于正常小鼠，這些結(jié)果與腺肌癥形成中對雌激素敏感，對孕激素耐受，侵襲性增加密切相關(guān)，可能是腺肌癥發(fā)病機制的分子基礎(chǔ)。黃毓菲等[14]研究發(fā)現(xiàn)在AM的在位內(nèi)膜中，M2型丙酮酸激酶（M2 Pyruvate kinase，PKM2）的蛋白和mRNA水平均高于正常的子宮內(nèi)膜組織。這種高表達的AMPK蛋白水平可能導(dǎo)致AM在位內(nèi)膜組織糖酵解水平增高，為異位內(nèi)膜組織提供能量，易于其細胞的增殖和黏附，從而促進了疾病的發(fā)生發(fā)展，這也有可能是腺肌癥致病的一個途徑。在中醫(yī)藥領(lǐng)域，某些中藥與抗腫瘤藥物的結(jié)構(gòu)相似，也能夠輔助機體產(chǎn)生抗腫瘤免疫反應(yīng)。莪術(shù)醇為新的抗腫瘤中藥單體之一，主要通過誘導(dǎo)細胞凋亡、減少細胞增殖來發(fā)揮作用，對子宮頸癌、胃癌、肝膽管癌RBE細胞、人膠質(zhì)瘤U87細胞、人腦膠質(zhì)瘤U251細胞和鼻咽癌等腫瘤細胞的增殖有抑制作用[15]。趙靜等[16]用不同質(zhì)量濃度莪術(shù)醇作用于AM異位內(nèi)膜細胞，結(jié)果顯示，與對照組比較，各種濃度的莪術(shù)醇藥物干預(yù)組24、48 h后，AM異位細胞增殖率、遷移率均降低，凋亡率均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這也提示莪術(shù)醇可能對子宮腺肌癥有一定的治療作用。

在前期準備工作的基礎(chǔ)上，本實驗通過改良AM原代細胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞，取得了比較好的分離培養(yǎng)的效果。在此基礎(chǔ)上總結(jié)出了AM原代細胞分離培養(yǎng)困難的關(guān)鍵點：①取材：離體組織的新鮮程度是成功的關(guān)鍵，在盡量短的時間內(nèi)進行冰盒轉(zhuǎn)運、分離培養(yǎng);全程無菌操作是成功的保證。②分離：剪碎組織的過程要快速、剪成糊狀最好，這樣可以縮短消化時間，同時也能減少各類因素對細胞的破壞。③培養(yǎng)：培養(yǎng)基內(nèi)可加入雙抗（青霉素、鏈霉素混合液）以減少細胞污染率。本實驗在以往子宮內(nèi)膜原代細胞的分離、培養(yǎng)方法上進行研究改進.摸索出一種高效的AM原代細胞培養(yǎng)方法。其優(yōu)點在于：①本實驗細胞傳代消化采用10：9的比例配置0.25%的Ⅳ型膠原酶-胰蛋白酶-EDTA與PBS的混合液作為消化液混合液作為細胞消化液，這個比例可以快速消化細胞，并且不損傷細胞傳代后生長的能力，提高了組織消化后的細胞存活效率。②經(jīng)分離提純的原代AM間質(zhì)細胞科穩(wěn)定傳代6～10代，并且能保持較高分離培養(yǎng)成功率，為后期的實驗提供實驗基礎(chǔ)。本課題研究發(fā)現(xiàn)：①AM異位ESc的增殖能力遠高于在位Esc和正常人子宮內(nèi)膜ESc;②AM異位ESc的細胞遷移和侵襲水平均高于AM在位和正常人子宮內(nèi)膜的ESc，且具有有統(tǒng)計學(xué)意義;③細胞凋亡水平未見明顯差異，后期會再提高細胞數(shù)量，嚴格控制實驗點在細胞對數(shù)期范圍內(nèi)再次進行驗證。此一系列結(jié)果為后期從分子水平上對AM相關(guān)發(fā)病機制的研究提供了前期的基礎(chǔ)和實驗的平臺。

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（收稿日期：2020-09-09）