姚淑敏， 劉合鳳， 高 飛， 張雅倩， 孔雪玉， 楊重驛

(曲阜師范大學生命科學學院，273165，山東省曲阜市)

酒曲是釀造甜酒釀的糖化劑、發(fā)酵劑，酒曲中含有豐富的微生物和酶，因此有“曲是酒之骨”的說法.獨特的酒曲微生物群系組成是影響酒類香氣物質(zhì)、營養(yǎng)成份和種類繁多的風味物質(zhì)的重要原因之一[1-2]，因此對酒曲中微生物多樣性的研究有助于了解酒曲風味物質(zhì)的形成機制.楊春敏等[3]研究海南山蘭米酒中微生物多樣性發(fā)現(xiàn)，酒曲中除含有多種真菌如根霉、曲霉、假絲酵母等外，還含有一些細菌，主要有片球菌(Pediococcus)、腸桿菌屬(Enterobacter)、魏斯氏菌(Weissella)、Klebsiella等.杜丹等[4]研究陜西謝村黃酒酒曲中微生物多樣性結果表明，黃酒酒曲中含有大量的細菌分屬于克羅彭斯特菌屬(Kroppenstedtia)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)等.袁亦舟等[5]研究青稞酒中微生物多樣性發(fā)現(xiàn)，在青稞酒中含有的真菌主要是根霉屬、曲霉屬、線蟲草屬和酵母屬的微生物，細菌主要是細菌主要有庫克菌屬、球菌屬、芽孢桿菌屬、微球菌屬等.胡桂林等[6]從大曲中分離到1株細菌.李燕等[7]從羊羔美酒大曲中分離出包含魏斯氏菌屬(Weissella)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、片球菌(Pediococcus)、芽孢乳桿菌(Sporolactobacillus)、葡萄球菌(Staphylococcus)、高溫放線菌屬(Thermoactinomyces)和4個不可培養(yǎng)的細菌種類的細菌.王艷萍等[8]對湖北荊州的甜酒曲中的微生物進行分離純化，分離得到一株霉菌，一株酵母菌和兩株細菌.LV X C等[9-10]從紅曲中分離得到Bacillus屬,Staphylococcus屬，Leuconostoc屬,Pediococcus屬,Lactobacillus屬和Lactococcus屬的細菌，并且證明在紅曲中的優(yōu)勢菌群是乳酸菌.CHAO S H等[11]對臺灣米酒酒曲乳酸菌的多樣性進行了研究.WANG P X等[12]對浙江紹興酒曲中的可培養(yǎng)細菌進行研究，證明在紹興酒曲中的細菌主要是乳酸菌和芽孢桿菌.由此可見酒曲中的細菌及其多樣，從而說明細菌在酒曲發(fā)酵過程中以及酒的風味的形成有著及其重要的作用.以上這些方法都是建立在常規(guī)分離方法的基礎上，這種平板分離培養(yǎng)的方法只能分析樣品中1%的可培養(yǎng)微生物，對于絕大多數(shù)的不可培養(yǎng)微生物則需要利用其他方法進行研究，所以用不可培養(yǎng)方法研究樣品中微生物多樣性更加能夠客觀地反映樣品中微生物組成.

DGGE(denaturing gradient gel electrophoresis)，即變性梯度凝膠電泳，是研究微生物群落結構最重要的分子生物學方法之一，具有高效、方便、快速、直觀、穩(wěn)定的優(yōu)點，同時可進行多樣本分析，現(xiàn)在已廣泛應用于自然界微生物及不可培養(yǎng)微生物的多樣性研究[13].以聚合酶鏈式反應和變性梯度凝膠電泳(polymerase chain reaction- denatured gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE)分析樣品中微生物多樣性多有報道[14-19].在分離的樣品中都有不可培養(yǎng)微生物的類群，因此利用這種方法不僅可以了解樣品中優(yōu)勢微生物種類，同時可以了解樣品中的不可培養(yǎng)微生物.如研究者在研究酒曲中微生物群落結構中發(fā)現(xiàn)的UnculturedWeissella、Uncultured Propionibacteriaceae bacterium、Uncultured Cyanobacterium等，這說明用免培養(yǎng)方法可以檢測到未發(fā)現(xiàn)的微生物，可以更加全面地了解大曲中的微生物群落.

本研究旨在通過利用PCR-DGGE方法對湖南、浙江、福建三省六地的甜米酒酒曲中細菌的多樣性進行研究比較，以了解不同地區(qū)甜酒釀風味炯異的原因，近而研究不同酒曲微生物在發(fā)酵過程中的代謝作用，為甜酒釀品質(zhì)的進一步提高以及甜酒釀的深加工提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

分別選取湖南韶山、湖南湘潭、湖南祁東、福建福州、浙江麗水和浙江蘭溪6個地區(qū)的酒曲，并分別用1#、2#、3#、4#、5#、6#來標記.

1.1.2 培養(yǎng)基

LB(Luria-Bertani)液體培養(yǎng)基和LB(Luria-Bertani)固體培養(yǎng)基，配方見參考文獻[20]

1.1.3 細菌16S rRNA gene V3區(qū)擴增所用引物

F357-GC:5'-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCC

GGCCCGCCGCCCCCGCCCC CCTACGGGAGGC

AGCAG -3'，

R518:5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'

F357:CCTACGGGAGGCAGCAG；

1.1.4 試劑

50×TAE(Tris-Acetic acid-Ethylene Diamine Tetraacetic Acid)電泳Buffer，0.1 mol/L CaCl2溶液，0.1 mol/L CaCl2溶液(含有15%甘油)，10 mg/mL的氨芐青霉素.

1.2 主要儀器與設備

PCR反應擴增儀(BIO-RAD)，YXJ-2離心機(加拿大BBI公司)，H6-1微型電泳槽(上海精益公司)，凝膠成像系統(tǒng)(上海山富公司)，變性梯度凝膠電泳(DGGE)儀(美國Bio-Rad公司).

1.3 方法

1.3.1 樣品總DNA的提取

利用土壤基因組DNA快速抽提試劑盒(產(chǎn)品編號SK8233/SK8234)提取甜酒曲樣品總DNA.

1.3.2 細菌16S rRNA 基因V3區(qū)擴增

所用引物為細菌16S rDNA V3高變區(qū)F357和R518(表1)，反應體系見表2.

表1 PCR引物

取PCR產(chǎn)物各3 μL，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，1×TAE緩沖液，120 V穩(wěn)壓電泳30 min，成像儀拍照.

表2 PCR反應體系

1.3.3 變性梯度凝膠電泳(DGGE)

變形梯度凝膠電泳的具體步驟參考文獻[21]中闡述的方法.

1.3.4 DGGE條帶回收

選取6種樣品中有代表性的條帶，參照SK8131膠回收試劑盒的方法進行回收處理，回收產(chǎn)物放于-20 ℃?zhèn)溆?

1.3.5 目的片斷PCR擴增和克隆

目的片斷PCR擴增和克隆參考文獻[22]介紹的方法進行.將測序結果在NCBI上進行Blast比對，利用MEGA5構建系統(tǒng)進化樹，并利用Bootstrap進行1000次可信度分析.

2 結果與分析

2.1 細菌16S rRNA gene V3區(qū)PCR擴增結果

以F357-GC和R518為擴增引物，以提取的6種甜酒曲樣品的總DNA為模板進行16S rRNA gene V3區(qū)擴增，片段長度大約為200 bp左右，分別取1.5 μL PCR擴增產(chǎn)物進行電泳分析，電泳結果如圖1所示.從圖1可以看出，6種酒曲中分別克隆到相應的片段，片段大小在200 bp左右，與16S rRNA gene V3區(qū)大小相近.

圖1 細菌16S rRNA gene V3區(qū)PCR電泳結果(M：marker，1、2、3、4、5、6分別代表6種酒曲)

圖2 細菌DGGE電泳圖譜

2.2 變性梯度凝膠(DGGE)結果

取上述PCR擴增產(chǎn)物，分別對6組樣品進行DGGE分析，電泳圖譜如圖3所示，選取有代表性的條帶進行編號，共編號 33條條帶.從圖可以看出6種酒曲中分別含有不同的條帶，每種酒曲中的條帶編號見表3.表3表明在不同的酒曲中條帶數(shù)目不等，這也可以說明，不同酒曲中可能含有的細菌種屬不同.

圖3 28條16S rDNA V3區(qū)PCR擴增結果

2.3 PCR擴增及測序

以回收的33條DGGE片段為模板，以F357和R518為引物進行PCR擴增，然后電泳檢測，結果如圖3(圖中的DNA Marker同圖2中Marker的分子量).共擴增出28條條帶，其中編號為4、6、7、8、15沒有克隆出產(chǎn)物，原因可能是膠回收的量不足以進行PCR擴增或是在擴增過程中操作的問題導致.因此在圖3中只有28條條帶的PCR結果(圖中的編號與圖2中編號相對應)，從圖3中可以看出擴增片段的長度大約200 bp左右.

將PCR產(chǎn)物與質(zhì)粒pMD18-T Vector進行連接轉化，然后提取質(zhì)粒，寄上海生工生物工程有限公司進行測序，測序結果在NCBI上進行BLAST分析，結果見表3.

表3 甜酒曲樣品中細菌條帶編號

表4 條帶16S V3可變區(qū)序列分析

條帶編號克隆編號片段長度菌種屬名26>4.17XDG201-26-M13-171 bpStreptophyta27>4.17XDG201-27-M13-169 bpSphingomonas28>4.17XDG201-28-M13-194 bpThauera29>4.17XDG201-29-M13-194 bpPantoea30>6.17XDG201-30-M13-194 bppantoea31>6.15DG201-31-M13-194 bpPantoea32>6.17XDG201-32-M13-194 bpPantoea33>4.17XDG201-33-M13-172 bpOkibacterium

從表4可以看出，測序的28條條帶在NCBI上進行BLAST分析，結果表明這28條條帶分屬于Weissella(魏斯氏菌屬)，Pediococcus(片球菌屬)，Pantoea(泛菌屬)，Sphingomonas(鞘氨醇單胞菌屬)，Lactococcus(乳球菌屬)，Enterobacter(腸桿菌屬)，Streptophyta屬，Bacillus(芽孢桿菌屬)，Klebsiella(克雷白氏桿菌屬)，Rhizobium(根瘤菌屬)，Thauera(索氏菌屬)，Okibacterium屬，共有12屬中的細菌，選取不同屬中的代表菌株，利用MEGA5.0軟件的鄰接法(Neighbor-Joining)構建系統(tǒng)進化樹，結果見圖4.

圖4 基于16S rDNA V3區(qū)序列構建的系統(tǒng)進化樹

從圖4可以看出，與13、19、23、24、29、30、31、32同源性高的菌株是Pantoeaagglomeransstrain1D，相似性達到99%；2、3、9、11與WeissellaoibariastrainNITCSK4菌株相似性達到99%；1、10、12、 18與WeissellahellenicastrainRM3-3菌株相似性是99%；22與Klebsiellapneumoniawstrain1D的同源性最高；28與Theuerasp.SLA13A42A1同源性最高，達99%；25與Rhizobiumsp.BAB4428同源性最高達到98%；16、27與Sphingomonassp. HaTo12 菌株同源性最高，前者達98%，后者達99%；與33同源性最高的菌株是不可培養(yǎng)細菌KP949676，相似性是100%；與26、20同源性高的菌株是Unculture prokaryote clone SCU-2，前者相似性達到100%，后者相似性達到98%；21與BacilluscereusstrainA14的同源性最高，相似性達到100%；與17同源性高的菌株是LactococcuslactisstrainNCIM2114，相似性達99%；與5、14同源性高的菌株是PediococcusacldllacticlstrainKTNA3010M，前者與該菌株的相似性達100%，后者與它的相似性達99%.

表4可以看出，在不同的酒曲中含有的細菌的種類不同，湖南韶山的酒曲中主要是Weissella，Streptophyta，Bacillus，Pantoea，Okibacterium這5個屬的菌株，湖南湘潭酒曲中主要含有Weissella，Pediococcus，Lactococcus，Sphingomonas，Streptophyta，Pantoea這6屬的菌株，湖南祁東主要含有Weissella，Pediococcus，Bacillus，Klebsiella，Pantoea這5屬的菌株，福建福州含有Weissella，Pediococcus，pantoea，Pediococcus，Sphingomonas，Enterobacter，Rhizobium，Sphingomonas，Thauera8屬的菌株，浙江麗水酒曲含有Weissella，Pantoea，Pediococcus，Klebsiella，Enterobacter，Rhizobium，Sphingomonas，Thauera8屬的菌株，浙江蘭溪酒曲含有Weissella，Streptophyta，Pantoea3屬的菌株.從6種酒曲含有的細菌類群分析，Weissella屬和pantoea屬的菌株存在較廣，說明這兩個屬的菌株在酒曲中起著非常重要的作用.研究發(fā)現(xiàn)Weissella屬的菌株不僅在酒曲中是優(yōu)勢菌群而且在食品、醫(yī)藥、發(fā)酵工業(yè)上具有極其重要的作用[16].由于酒曲中的微生物不同，將導致在發(fā)酵過程中的產(chǎn)物的不同，進而導致酒曲發(fā)酵后的酒釀中的營養(yǎng)成分的差異，這也是不同地區(qū)酒釀的風味不同的原因.在接下來的實驗中我們還將對著6種酒曲中的氨基酸、有機酸、醇類、酯類等進行進一步的研究.

3 結 論

從以上結果可以看出，在這6種酒曲樣品中，利用PCR-DGGE方法分離出不同的細菌.其中6種酒曲中共有的菌為Weissella屬和Pantoea屬的菌株，由此可以推斷，Weissella和Pantoea屬在酒曲中具有及其重要的作用.此外不同的酒曲中都有獨特的細菌菌株湖南韶山酒曲中含有Okibacterium屬的菌株，湖南湘潭和浙江蘭溪酒曲中含有Streptophyta屬的菌株，浙江麗水和福建福州酒曲中細菌豐富，都有8個屬的細菌存在，特有的菌為Rhizobium，Thauera屬的菌株，這些特有菌株的存在賦予酒曲發(fā)酵產(chǎn)品不同的風味及理化性質(zhì).因此利用這種非培養(yǎng)模式分析了不同酒曲中細菌的多樣性，可以極大的豐富微生物資源，同時豐富對不可培養(yǎng)微生物菌群的認識.研究結果表明，在非培養(yǎng)方式下，利用PCR-DGGE分析方法檢測到不同酒曲中細菌物種資源包括Weissella(魏斯氏菌屬)，Pediococcus(片球菌屬)，Pantoea(泛菌屬)，Sphingomonas(鞘氨醇單胞菌屬)，Lactococcus(乳球菌屬)，Enterobacter(腸桿菌屬),Streptophyta屬，Bacillus(芽孢桿菌屬)，Klebsiella(克雷白氏桿菌屬)，Rhizobium(根瘤菌屬)，Thauera(索氏菌屬)，Okibacterium屬，共有12屬的細菌菌群.由此可見在微生物的非培養(yǎng)鑒定技術的基礎上，利用 PCR-DGGE 分子生物學手段，研究酒曲中細菌的多樣性具有較為明顯的優(yōu)勢，利用此方法不僅可以了解酒曲中可培養(yǎng)細菌的多樣性，同時還可以了解不可培養(yǎng)細菌的多樣性.本實驗結果在豐富湖南、福建、浙江三地的酒曲中微生物種子資源的基礎上，為三地酒曲的進一步開發(fā)利用提供理論支持，同時為進一步研究我國南方其他地區(qū)酒釀風味物質(zhì)特征、營養(yǎng)提供理論依據(jù)，從而為改進傳統(tǒng)的配料和釀造工藝奠定了理論基礎.