宋樂(lè)樂(lè) 紀(jì)萌 王鈞平 唐昊 吳金生

【摘要】 目的：探討微小染色體維持蛋白6（MCM6）在腎透明細(xì)胞癌（ccRCC）早期診斷及預(yù)后判斷中的意義。方法：應(yīng)用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中533例ccRCC患者的RNA測(cè)序（RNAseq）數(shù)據(jù)，從RNA水平初步分析MCM6的mRNA表達(dá)與ccRCC早期診斷及預(yù)后的關(guān)系。應(yīng)用免疫組化（IHC）實(shí)驗(yàn)方法從蛋白質(zhì)層面分析MCM6蛋白在373例ccRCC患者的表達(dá)與ccRCC早期診斷與預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果：分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)，ccRCC患者的MCM6高表達(dá)與腫瘤進(jìn)展和生存率低均有關(guān)（P<0.001）。對(duì)373例ccRCC組織的免疫組化分析表明MCM6蛋白在ccRCC的癌旁正常組織中幾乎不表達(dá)，而在ccRCC的腫瘤細(xì)胞中明顯表達(dá)。Kaplan-Meier生存分析顯示MCM6蛋白是ccRCC患者生存的不利因素，高表達(dá)MCM6的ccRCC患者預(yù)后差（P<0.001）。Cox回歸分析結(jié)果顯示，MCM6是ccRCC的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子（P<0.001）。MCM6受試者工作特征曲線下面積（AUC）值為0.604（P=0.001）。結(jié)論：MCM6是ccRCC患者生存的不利因素，MCM6是一種潛在的ccRCC早期診斷及判斷預(yù)后的新型標(biāo)志物。

【關(guān)鍵詞】 腎透明細(xì)胞癌 MCM6 早期診斷 預(yù)后

[Abstract] Objective： To investigate the significance of microchromosome maintenance protein 6 （MCM6） in early diagnosis and prognosis of clear cell renal cell carcinoma （ccRCC）. Method： Using the RNA sequencing （RNAseq） data of 533 ccRCC patients in the TCGA database， the relationship between the mRNA expression of MCM6 and the early diagnosis and prognosis of ccRCC from the RNA level was analyzed. Then immunohistochemical （IHC） method was used to analyze the relationship between the expression of MCM6 protein and the early diagnosis and prognosis of ccRCC in 373 patients with ccRCC. Result： Analysis of the TCGA database showed that the high expression of MCM6 in patients with ccRCC was associated with low tumor progression and low survival rate （P<0.001）. The immunohistochemical analysis of 373 cases of ccRCC tissues proved that MCM6 protein was almost not expressed in the adjacent normal tissues of ccRCC， but was expressed in tumor cells of ccRCC. Kaplan-Meier survival analysis showed that MCM6 protein was an unfavorable factor for the survival of ccRCC patients， and the prognosis of ccRCC patients with high expression of MCM6 was poor （P<0.001）. Cox regression analysis showed that MCM6 was an independent predictor of ccRCC （P<0.001）. The area under receiver operating characteristic curve （AUC） of MCM6 was 0.604 （P=0.001）. Conclusion： MCM6 is an unfavorable factor for the survival of patients with ccRCC， MCM6 is a potential marker for early diagnosis and prognosis of ccRCC.

[Key words] ccRCC MCM6 Early diagnosis Prognosis

First-authors address： Affiliated Hospital of Weifang Medical University， Weifang 261000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.09.006

腎細(xì)胞癌（renal cell carcinoma，RCC）標(biāo)準(zhǔn)化年齡發(fā)病率排在全球第16位，死亡率在第17位，男女發(fā)病比例約為1.7︰1[1]，且近年來(lái)發(fā)病率和死亡率均呈上漲趨勢(shì)[2]。腎透明細(xì)胞癌（ccRCC）是臨床中最常見(jiàn)的腎癌類型，大約占腎癌比例的75%[3]。ccRCC起源于腎單位的近曲小管，其特征是細(xì)胞質(zhì)透明的惡性上皮細(xì)胞[4]。在大部分慢性腎細(xì)胞癌中，Von Hippel-Lindau（VHL）基因丟失與缺氧信號(hào)的失調(diào)導(dǎo)致了多種基因激活[5]。其中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）及其受體和雷帕霉素靶蛋白（mTOR）仍然是系統(tǒng)治療的主要靶點(diǎn)[6]。針對(duì)VEGF或mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的治療藥物，如索拉非尼、替西羅莫司、依維莫司、卡波替尼和樂(lè)伐替尼等先后成功開(kāi)發(fā)并用于臨床[7]。然而，這些藥物僅能部分改善慢性腎細(xì)胞癌的預(yù)后，對(duì)晚期腎細(xì)胞癌的療效仍然有限[8]。然而，在臨床實(shí)踐中幾乎沒(méi)有ccRCC的預(yù)后標(biāo)記物[9]。因此，為了更好地治療這種疾病，需要積極尋找新的預(yù)后標(biāo)記物和指導(dǎo)個(gè)體化治療的新靶點(diǎn)，以便使患者獲得早期治療和更精確的進(jìn)一步治療，從而延長(zhǎng)生存期。

微小染色體維持基因（MCM）在DNA復(fù)制中起重要作用，包括六個(gè)高度相關(guān)的同源亞基（MCM2-7），構(gòu)成了真核生物DNA復(fù)制解旋酶的催化核心[10]。研究表明，MCM基因在各種癌癥中發(fā)揮重要作用，尤其是在癌癥診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)方面[11]。多項(xiàng)研究表明，MCM6在多種惡性腫瘤中表達(dá)增強(qiáng)，且與患者的診斷和預(yù)后密切相關(guān)，如乳腺癌、肝癌、膠質(zhì)瘤等[12-14]。本研究主要檢測(cè)了MCM6在ccRCC組織中的表達(dá)情況以及分析了MCM6在ccRCC中的早期診斷意義和預(yù)后意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料及標(biāo)本來(lái)源 從RNA和蛋白質(zhì)兩個(gè)方面綜合分析MCM6在ccRCC中的表達(dá)意義。RNA水平的研究，從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)獲取了533例ccRCC患者的RNAseq數(shù)據(jù);蛋白質(zhì)水平的研究，選取373例ccRCC患者的免疫組化實(shí)驗(yàn)。標(biāo)本來(lái)源：隨機(jī)選取2008-2018年中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京腫瘤醫(yī)院收治的術(shù)后病理結(jié)果證實(shí)為ccRCC的手術(shù)標(biāo)本373例。標(biāo)本包括腫瘤組織和癌旁正常腎組織，并以癌旁正常腎組織為對(duì)照。本研究腎癌臨床分期采用了2010年AJCC第七版標(biāo)準(zhǔn)，其中為方便研究，Ⅰ期和Ⅱ期歸為低分期，Ⅲ期和Ⅳ期歸為高分期。采用1992年Fuhrman核分級(jí)的標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)其進(jìn)行組織學(xué)分級(jí)，其中為方便研究，G1和G2歸為低級(jí)別，G3和G4歸類為高級(jí)別。

1.2 主要試劑與儀器 MCM6兔抗人多克隆抗體（13347-2-AP）購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司，通用二步法檢測(cè)試劑盒（PV9000）購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，顯微鏡DM2000購(gòu)自德國(guó)萊卡公司。

1.3 組織芯片的構(gòu)建和IHC實(shí)驗(yàn)

1.3.1 組織芯片的構(gòu)建 首先根據(jù)標(biāo)本數(shù)量設(shè)計(jì)合適的芯片微陣列，對(duì)組織標(biāo)本進(jìn)行固定、包埋等制作供體蠟塊。供體蠟塊切片做HE染色，根據(jù)HE染色標(biāo)記供體蠟塊。在供體蠟塊上標(biāo)記處打孔采集組織芯（每個(gè)病例包含3個(gè)癌組織芯和2個(gè)癌旁正常腎組織芯作為對(duì)照），將組織芯填充到受體模塊，經(jīng)壓實(shí)、包埋固定制成組織芯片模塊。對(duì)組織芯片模塊進(jìn)行連續(xù)性切片，再將切片轉(zhuǎn)移到防脫載玻片上制成組織芯片，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 IHC實(shí)驗(yàn)步驟 采用通用二步法免疫組化檢測(cè)方法。組織芯片經(jīng)組織固定、脫蠟、水化、PBS浸洗后置入95 ℃的枸櫞酸鈉緩沖液（pH值6.0）中，微波加熱進(jìn)行抗原修復(fù)。PBS浸洗后滴加PV-9000試劑1（內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑），室溫孵育10 min進(jìn)行滅活。PBS浸洗后滴加一抗（MCM6兔抗人多克隆抗體1︰100稀釋），對(duì)照組僅滴加等量抗體稀釋液，然后4 ℃過(guò)夜孵育。PBS浸洗芯片后滴加PV-9000試劑2（反應(yīng)增強(qiáng)液）室溫孵育20 min，PBS浸洗后滴加試劑3（增強(qiáng)酶標(biāo)山羊抗小鼠/兔IgG聚合物）即二抗室溫孵育20 min，然后經(jīng)洗滌、DAB顯色、蘇木精復(fù)染、脫水、透明、封片。

1.4 IHC染色結(jié)果判定 由三名有資質(zhì)的病理醫(yī)生分別進(jìn)行閱片，閱片人員對(duì)組織芯片排列順序及患者詳細(xì)信息并不知情，評(píng)分有差異的再由三人以少數(shù)服從多數(shù)原則共同判定。評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)：IHC染色分?jǐn)?shù)是通過(guò)將染色面積分?jǐn)?shù)（0=無(wú)細(xì)胞陽(yáng)性，1=1%～25%，2=26%～50%和3=51%～100%）乘以染色強(qiáng)度分?jǐn)?shù)（0=無(wú)染色，1=弱染色，2=中度染色和3=強(qiáng)染色）。根據(jù)組織芯片的染色評(píng)分結(jié)果，將ccRCC病例分為MCM6低表達(dá)組：MCM6低/無(wú)表達(dá)（≤6分）和MCM6低表達(dá)組：MCM6高表達(dá)（>6分）。

1.5 隨訪 隨訪信息包含患者門診隨訪及電話隨訪，起止時(shí)間2008年3月-2019年12月，中位隨訪時(shí)間40個(gè)月，死亡70例，生存303例。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用Medcalc軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用字2檢驗(yàn);應(yīng)用Kaplan-Meier法繪制生存曲線、對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)（Log-rank test）進(jìn)行生存曲線比較;采用單因素和多因素Cox回歸分析來(lái)評(píng)估MCM6蛋白與ccRCC臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系;通過(guò)繪制受試者工作特征曲線（ROC）及曲線下面積（AUC）來(lái)評(píng)價(jià)MCM6表達(dá)對(duì)ccRCC早期診斷的價(jià)值。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MCM6 RNAseq數(shù)據(jù)分析 首先分析了TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//cancergenome.nih.gov）中公布的533例ccRCC患者M(jìn)CM6的RNAseq數(shù)據(jù)，應(yīng)用Medcalc軟件繪制ROC曲線，并獲取最佳截?cái)嘀祵?duì)MCM6的RNAseq數(shù)據(jù)進(jìn)行分組，將其分為MCM6高表達(dá)組175例（32.83%）和MCM6低表達(dá)組358例（67.17%）。應(yīng)用Kaplan-Meier生存曲線從RNA水平分析MCM6的表達(dá)與ccRCC患者生存和預(yù)后的影響，MCM6為ccRCC患者預(yù)后的不利因素，高表達(dá)MCM6的患者生存率低（P<0.001），見(jiàn)圖1。

2.2 MCM6表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 MCM6低表達(dá)組性別、年齡與MCM6高表達(dá)組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;MCM6低表達(dá)組臨床分期、組織學(xué)分級(jí)及術(shù)后復(fù)發(fā)進(jìn)展情況與MCM6高表達(dá)組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。見(jiàn)表1。

2.3 MCM6蛋白的表達(dá) MCM6蛋白在ccRCC組織中的陽(yáng)性表達(dá)并且主要表現(xiàn)在細(xì)胞核中，而在細(xì)胞質(zhì)極少表達(dá)。在正常組織中近曲小管幾乎沒(méi)有陽(yáng)性表達(dá)，遠(yuǎn)曲小管有少量表達(dá)，由于遠(yuǎn)曲小管不屬于ccRCC來(lái)源細(xì)胞，故可忽略不計(jì)。對(duì)照組結(jié)果均為陰性。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，373例ccRCC組織的免疫組化實(shí)驗(yàn)中MCM6蛋白的陽(yáng)性率及高表達(dá)率分別為60.1%（224/373）和30.3%（113/373），見(jiàn)圖2。

2.4 生存分析

2.4.1 MCM6蛋白表達(dá)對(duì)患者預(yù)后的影響 采用Medcalc軟件將MCM6蛋白在ccRCC中的表達(dá)繪制生存曲線，觀察MCM6對(duì)ccRCC患者生存的影響，結(jié)果表明：MCM6蛋白的過(guò)表達(dá)是ccRCC患者生存的不利因素（P<0.001）。這里的結(jié)果與TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中MCM6 RNAseq數(shù)據(jù)結(jié)果一致。見(jiàn)圖3。

2.4.2 單因素Cox回歸分析 采用單因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析MCM6蛋白的表達(dá)與各項(xiàng)臨床、病理參數(shù)對(duì)ccRCC患者的生存影響，結(jié)果顯示：較大腫瘤（直徑>4 cm）、發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、高級(jí)別TNM臨床分期（Ⅲ期和Ⅳ期）、高級(jí)別組織學(xué)分級(jí)（G3期和G4期）以及MCM6蛋白高表達(dá)等因素均是ccRCC患者的生存的危險(xiǎn)性因素。見(jiàn)表2。

2.4.3 多因素Cox回歸分析 排除無(wú)關(guān)變量和無(wú)意義變量，將對(duì)患者預(yù)后有意義的單變量納入多因素分析。多因素分析結(jié)果顯示，高級(jí)別臨床分期、高級(jí)別組織學(xué)分級(jí)和MCM6蛋白高表達(dá)均是ccRCC患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，見(jiàn)表3。

2.5 MCM6蛋白表達(dá)對(duì)ccRCC的診斷意義 對(duì)373例

ccRCC患者的MCM6蛋白表達(dá)IHC結(jié)果進(jìn)行二分類，陽(yáng)性：高表達(dá)組113例（30.3%），陰性：低/無(wú)表達(dá)組260例（69.7%），采用Medcalc軟件繪制ROC曲線，對(duì)應(yīng)的曲線下面積AUC值為0.604（P=0.001），95%置信區(qū)間為（0.552，0.654），敏感度和特異度分別為47.14、73.60。AUC值大于0.5，說(shuō)明MCM6蛋白表達(dá)對(duì)腎透明細(xì)胞癌患者具有潛在的診斷價(jià)值。見(jiàn)圖4。

3 討論

研究表明在MCM2-7復(fù)合物中，六個(gè)亞基具有相互作用并緊密相關(guān)。在各種癌癥的預(yù)后中也發(fā)現(xiàn)了MCM家族的相互關(guān)系。作為肝細(xì)胞癌預(yù)后預(yù)測(cè)的指標(biāo)，MCM2-7、MCM8和MCM10彼此顯著相關(guān)[15]。生存分析和聯(lián)合效應(yīng)分析表明，Ki-67、MCM3和MCM7是鑒別良性和惡性腎上腺皮質(zhì)腫瘤的可靠增殖和診斷指標(biāo)[16]。兩種或兩種以上上調(diào)的MCM的組合表明在腎細(xì)胞癌中有較短的無(wú)病生存時(shí)間[17]。眾多研究表明，MCM成員積極參與生理和腫瘤過(guò)程。調(diào)控失調(diào)的MCMs被認(rèn)為是通過(guò)破壞基因組穩(wěn)定性和促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程來(lái)驅(qū)動(dòng)癌癥的，這兩種因素都會(huì)顯著促進(jìn)細(xì)胞的異常增殖，從而增加癌癥的風(fēng)險(xiǎn)[18]。因此，異常表達(dá)的MCMs可能成為早期診斷、預(yù)后甚至預(yù)測(cè)療效的敏感腫瘤生物標(biāo)志物。然而，仍有幾個(gè)重要問(wèn)題需要解決，首先對(duì)MCM在惡性腫瘤中的調(diào)控機(jī)制還缺乏深入的研究，如MCM成員在癌癥中的上游調(diào)控因子是什么，它們?nèi)绾瓮ㄟ^(guò)轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后機(jī)制調(diào)節(jié)MCM成員的表達(dá)？另外，目前還沒(méi)有能直接靶向MCM蛋白的有效藥物用于臨床。但是，隨著對(duì)MCMs的深入研究，可以期待未來(lái)將開(kāi)發(fā)出有前途的抗癌策略，并為腫瘤患者提供益處。

在本研究中，筆者研究了MCM6在腫瘤組織中的定位和腫瘤進(jìn)展中的意義，發(fā)現(xiàn)正常腎組織內(nèi)幾乎無(wú)MCM6蛋白表達(dá)，而在腎癌組織中明顯高表達(dá)。MCM6在ccRCC組織中的表達(dá)與性別、年齡無(wú)關(guān)，而與臨床分期、組織學(xué)分級(jí)以及是否復(fù)發(fā)和進(jìn)展明顯相關(guān)。本研究證實(shí)在mRNA水平的533例ccRCC臨床樣品中和在蛋白質(zhì)水平的373例ccRCC組織中MCM6的上調(diào)并驗(yàn)證了其與ccRCC患者的不良預(yù)后相關(guān)。本研究還證實(shí)MCM6對(duì)ccRCC具有一定的早期診斷意義。但是，本研究仍然存在一些不足：僅研究了RCC中最常見(jiàn)的類型，乳頭狀細(xì)胞癌、嫌色細(xì)胞癌等其他少見(jiàn)類型未納入研究;未統(tǒng)籌分析MCM2-7中的其他基因/蛋白與ccRCC的關(guān)系;由于目前隨訪時(shí)間的限制，未能獲得MCM6對(duì)ccRCC的更遠(yuǎn)期的影響;MCM6與目前報(bào)道過(guò)的標(biāo)志物之間有無(wú)相互關(guān)系以及有無(wú)協(xié)同作用等有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，MCM6的高表達(dá)對(duì)ccRCC患者生存是一個(gè)不友好的指標(biāo)，MCM6是一種潛在的ccRCC患者預(yù)后不良的標(biāo)志物，且對(duì)ccRCC具有一定的早期診斷價(jià)值。

參考文獻(xiàn)

[1] Bray F，F(xiàn)erlay J，Soerjomataram I，et al.Global cancer statistics 2018：GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries[J].CA Cancer J Clin，2018，68（6）：394-424.

[2] Cai Q，Chen Y，Qi X，et al.Temporal trends of kidney cancer incidence and mortality from 1990 to 2016 and projections to 2030[J].Transl Androl Urol，2020，9（2）：166-181.

[3] Hsieh J J，Purdue M P，Signoretti S，et al.Renal cell carcinoma[J].Nat Rev Dis Primers，2017，3：17009.

[4] Shen S S，Krishna B，Chirala R，et al.Kidney-specific cadherin，a specific marker for the distal portion of the nephron and related renal neoplasms[J].Mod Pathol， 2005，18（7）：933-940.

[5] Sch?del J，Grampp S，Maher E R，et al.Hypoxia，Hypoxia-inducible Transcription Factors， and Renal Cancer[J].Eur Urol，2016，69（4）：646-657.

[6] Rini B I.Targeted therapy for patients with renal-cell carcinoma[J].Lancet Oncol，2011，12（12）：1085-1097.

[7] Brown C.Targeted therapy：An elusive cancer target[J].Nature，2016，537（7620）：S106-S108.

[8] Buchler T，Bortlicek Z，Poprach A，et al.Outcomes for Patients with Metastatic Renal Cell Carcinoma Achieving a Complete Response on Targeted Therapy：A Registry-based Analysis[J].Eur Urol，2016，69（3）：469-475.

[9] Jonasch E，Gao J，Rathmell W K.Renal cell carcinoma[J].BMJ，2014，349：g4797.

[10] Zhai Y，Li N，Jiang H，et al.Unique Roles of the Non-identical MCM Subunits in DNA Replication Licensing[J].Mol Cell，2017，67（2）：168-179.

[11] Kearsey S E，Labib K.MCM proteins：evolution，properties，and role in DNA replication[J].Biochim Biophys Acta，1998，1398（2）：113-136.

[12] Issac M，Yousef E，Tahir M R，et al.MCM2，MCM4，and MCM6 in Breast Cancer：Clinical Utility in Diagnosis and Prognosis[J].Neoplasia，2019，21（10）：1015-1035.

[13] Liu M，Hu Q，Tu M，et al.MCM6 promotes metastasis of hepatocellular carcinoma via MEK/ERK pathway and serves as a novel serum biomarker for early recurrence[J].J Exp Clin Cancer Res，2018，37（1）：10.

[14] Cai H Q，Cheng Z J，Zhang H P，et al.Overexpression of MCM6 predicts poor survival in patients with glioma[J].Hum Pathol，2018，78：182-187.

[15] Liu Z，Li J，Chen J，et al.MCM family in HCC：MCM6 indicates adverse tumor features and poor outcomes and promotes S/G2 cell cycle progression[J].BMC Cancer，2018，18（1）：200.

[16] Aporowicz M，Czopnik P，Kubicka E，et al.Minichromosome Maintenance Proteins MCM-3，MCM-5，MCM-7，and Ki-67 as Proliferative Markers in Adrenocortical Tumors[J].Anticancer Res，2019，39（3）：1151-1159.

[17] Zhong H，Chen B，Neves H，et al.Expression of minichromosome maintenance genes in renal cell carcinoma[J].Cancer Manag Res，2017，9：637-647.

[18] Wang Y，Chen H，Zhang J，et al.MCM family in gastrointestinal cancer and other malignancies：From functional characterization to clinical implication[J].Biochim Biophys Acta Rev Cancer，2020，1874（2）：188415.

（收稿日期：2021-01-15） （本文編輯：程旭然）