徐 凡，張艷美

(汕頭大學醫(yī)學院藥理學教研室，廣東 汕頭 515041)

線粒體是真核細胞的一類具有內(nèi)外雙層膜的亞細胞器[1]，作為細胞的“能量工廠”，細胞所需90%的能量來自線粒體的氧化磷酸化作用[2]。心肌缺血再灌注損傷、阿爾茨海默病、糖尿病和衰老等與線粒體的功能障礙有密切關系[3]。線粒體在心肌細胞中含量豐富，約占細胞容積的30%，常被分離出來作為單獨的細胞器進行研究[4]。由于心肌組織結(jié)構(gòu)致密，相對于其他組織，勻漿所需的機械強度較高。不當?shù)慕M織勻漿方法往往造成線粒體結(jié)構(gòu)與功能損傷，影響研究結(jié)果，因此選用合適的勻漿方法，既確保分離線粒體的純度又保證其結(jié)構(gòu)功能的完整性，有著至關重要的意義。本研究探討研磨珠勻漿法、乳化分散儀法、玻璃勻漿器法三種不同的勻漿方法對分離小鼠心肌組織線粒體質(zhì)量的影響，從而確定更優(yōu)化的心肌組織線粒體分離方案。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實驗動物 C57BL/6JNifdc小鼠購自浙江維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，雄性，8～12周齡，體重18～23 g，生產(chǎn)許可證號：SCXK(浙)2019-0001。實驗所用的飼料，飲用水和墊料經(jīng)過高壓滅菌處理，飼養(yǎng)過程嚴格遵守實驗動物的3R原則。小鼠隨機分為研磨珠勻漿法組、乳化分散儀法組、玻璃勻漿器法組，每組3～5只。

1.1.2 主要材料、試劑與儀器 戊巴比妥鈉(德國Merck公司)，組織線粒體提取試劑盒和線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，BCA蛋白定量試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司)，COXⅣ單克隆抗體和GAPDH單克隆抗體(美國Cell Signaling Technology公司)，HRP標記的山羊抗兔IgG(武漢博士德生物工程有限公司)。臺式冷凍離心機(德國Eppendorf公司)，TS-48高速組織研磨機(上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司)，IKA T10 basic ULTRA-TURRAX分散儀(德國艾卡公司)，1 mL玻璃勻漿器(江陰市精英玻璃制品廠)，Spectra Max M 2多功能酶標儀(美國Molecular Devices公司)，JEM1400透射電子顯微鏡(日本電子株式會社)，垂直電泳儀(美國Bio-RAD公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 心肌組織線粒體提取 小鼠禁食12 h后稱重，腹腔注射1%戊巴比妥鈉，待小鼠麻醉后，用脫毛膏將胸部毛發(fā)除去，沿著腹部剪開，取出心臟，用生理鹽水洗去殘余的血液，用鑷子剝?nèi)ビ倚氖医M織，剩余組織放入提前預冷的離心管中，稱重，加入10倍體積(10 mg組織加入100 μL試劑，下同)磷酸鹽緩沖液，用小剪刀將組織剪碎，冰浴3 min。于臺式冷凍離心機中4℃，600g離心30 s，棄上清，加入8倍體積的胰酶消化液，冰浴20 min，每5 min渦旋1次。4℃，600g離心30 s，棄上清。加入2倍體積線粒體分離試劑A，洗去殘余的胰酶，600g離心30 s，棄上清，收集沉淀。加入8倍體積線粒體分離試劑A(提前加入苯甲基磺酰氟和磷酸酶抑制劑)。分別采用以下3種勻漿方式進行組織勻漿。(1)研磨珠勻漿法：將樣品移至特制的2.0 mL研磨離心管，分別加入大小研磨珠各1粒，放置于高速組織研磨機的固定臺上(固定臺-30℃預冷)進行研磨。研磨條件為：60 Hz，勻漿30 s，重復4次；(2)乳化分散法：將樣品移至2.0 mL離心管，冰浴中勻漿。IKA分散儀勻漿條件為：6檔，勻漿5 s，重復4次，每次間隔10 s；(3)玻璃勻漿法：將樣品移至玻璃勻漿器中，置于冰上，反復研磨30次。將3種勻漿方法得到的組織勻漿液移至2.0 mL離心管，于臺式冷凍離心機中4℃，600g離心5 min。離心完畢將上清液移至2.0 mL離心管，4℃，11 000g離心10 min。將上清液移至新的2.0 mL離心管，沉淀即為分離的線粒體。將線粒體沉淀保存在線粒體儲存液中，渦旋成混懸液，用于后續(xù)實驗。若要獲得無線粒體蛋白污染的細胞質(zhì)蛋白，需要將分離得到的上清液，4℃，12 000g離心10 min，取上清。

1.2.2 Western Blot檢測蛋白水平 采用Western Blot方法分別檢測細胞質(zhì)和線粒體裂解液中的細胞質(zhì)內(nèi)參蛋白(GAPDH)和線粒體內(nèi)參蛋白(COXⅣ)的表達水平。將線粒體混懸液4℃離心10 min，12 000g，棄上清，加入線粒體裂解液，冰上靜置裂解12 min，然后用BCA蛋白定量試劑盒測蛋白濃度。隨后進行電泳，轉(zhuǎn)膜，牛奶封閉，抗體雜交(GAPDH 1∶1 000，二抗 1∶20 000，COX Ⅳ1∶3 000，二抗1∶40 000)，洗膜和顯色。

1.2.3 酶標儀測定線粒體提取效率 酶標儀檢測線粒體蛋白濃度。線粒體蛋白提取效率(?)計算公式如下：

式中，c為線粒體蛋白濃度，V為線粒體蛋白體積，m為心肌組織質(zhì)量。

1.2.4 透射電鏡觀察線粒體的超微結(jié)構(gòu) 將線粒體混懸液4℃，12 000g離心10 min，棄上清，立即加入2.5%戊二醛固定，置于4℃冰箱，保存2 h。將樣品用磷酸鹽緩沖液清洗3次，每次洗完用微波爐加熱30 s，然后加入1%鋨酸固定1 h。固定后用磷酸鹽緩沖液洗3次，分別用50%、70%、80%、90%、100%梯度乙醇脫水，濾紙吸干乙醇；加入LR White包埋劑滲透2 h。加熱聚合，超微切片，厚度60～80 nm。醋酸鈾染色30 min，枸櫞酸鉛染色5 min，上機觀察。

1.2.5 酶標儀檢測線粒體膜電位 采用線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1法)檢測線粒體膜電位。以紅綠熒光的比值反映線粒體膜電位的強弱。具體操作按照試劑盒說明書進行。

1.3 統(tǒng)計學方法

應用GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計軟件進行分析，符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同的勻漿方法對心肌組織線粒體提取效率的影響

研磨珠勻漿法組，乳化分散儀法組和玻璃勻漿器法組線粒體提取效率分別為(8.30±1.68)μg/mg、(8.05±2.58)μg/mg和(8.48±2.01)μg/mg，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見圖1。

圖1 不同勻漿方法對心肌組織線粒體提取效率的影響

2.2 不同的勻漿方法對心肌組織線粒體純度的影響

3種勻漿方式得到的心肌組織細胞質(zhì)中GAPDH蛋白含量豐富，而線粒體裂解液中未見GAPDH的表達；提取的線粒體裂解液中COXⅣ蛋白含量豐富，而細胞質(zhì)中該蛋白含量極低，見圖2。

圖2 心肌組織細胞質(zhì)與線粒體提取液中GAPDH和COXⅣ蛋白的表達

2.3 不同的勻漿方法對心肌組織線粒體膜電位的影響

與研磨珠勻漿法組相比，乳化分散儀法組與玻璃勻漿器法組的線粒體膜電位明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；與乳化分散儀法組相比，玻璃勻漿器法組線粒體膜電位明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見圖3。

圖3 不同勻漿方式對心肌組織線粒體膜電位的影響

2.4 不同的勻漿方法對心肌組織線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響

研磨珠勻漿法組的線粒體結(jié)構(gòu)完整，呈球狀或短棒狀，具有清晰的內(nèi)外膜和嵴，基質(zhì)均勻致密，未見細胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器污染；乳化分散儀法組出現(xiàn)形態(tài)結(jié)構(gòu)不完整的線粒體，如部分線粒體內(nèi)外膜分離破裂，線粒體嵴紊亂，基質(zhì)減少，甚至出現(xiàn)溶脹變大及空泡樣變和破碎等現(xiàn)象；玻璃勻漿器法提取的線粒體大部分結(jié)構(gòu)完整，部分線粒體內(nèi)外膜分離或破碎，未見其他細胞器污染。見圖4。

圖4 不同勻漿方法對心肌組織線粒體超微結(jié)構(gòu)影響(×8 000，局部放大部分×15 000)

3 討論

線粒體除了為細胞供能，也參與了許多重要的生理病理過程，如細胞程序性死亡，鈣穩(wěn)態(tài)失衡以及氧化應激事件等。心臟作為全身的動力器官，需要保證充足的能量，心肌組織線粒體的重要性不言而喻，因此無論是病理機制的研究還是藥物靶點探討，都需單獨將線粒體提取出來進行針對性地研究[5-6]。與其他組織不同，心肌組織結(jié)構(gòu)致密，粗細肌絲排列有序，肌絲間線粒體呈球狀或短棒狀，呈晶格狀排列，這也導致了心肌組織線粒體分離時不易保證結(jié)構(gòu)和功能的完整性。目前，無論是心肌組織還是非心肌組織，線粒體的提取方法主要是差速離心法，在此基礎上，學者們針對線粒體的分離提取液對提取線粒體的質(zhì)量做過不少討論[7-8]，商品化的線粒體分離試劑也被廣泛應用，這對于提高線粒體的提取質(zhì)量非常有益。但有個不容忽視的問題是，線粒體提取的前期過程中，組織的分離尤其是致密心肌組織的分離也決定著線粒體的提取質(zhì)量。本研究充分借鑒了差速離心法這一傳統(tǒng)線粒體分離方法，另外選用了常用的組織線粒體分離試劑盒，探討研究中常采用的3種組織勻漿方式對于線粒體提取的效率和質(zhì)量的影響，研究顯示不同的勻漿方法對心肌組織線粒體的提取效率與純度影響的差異不大，但對線粒體膜電位與超微結(jié)構(gòu)有著不同程度的影響。

為了提取到更多的心肌組織蛋白或RNA等物質(zhì)，往往需要采用機械功率大的儀器將組織充分勻漿，而功率大的儀器在破碎組織的同時，不可避免地導致線粒體等細胞器遭到破壞。因此，如以線粒體為單獨的研究對象，無論是機械剪切，撞擊撕裂還是擠壓組織的方式，都需要保證分離線粒體結(jié)構(gòu)與功能的完整。本研究中，研磨珠勻漿法有利于維持線粒體的功能與結(jié)構(gòu)，最大限度地避免了因勻漿方法不當而導致線粒體膜電位的下降和超微結(jié)構(gòu)的破壞。而乳化分散儀法的線粒體膜電位和形態(tài)結(jié)構(gòu)都遭到了一定的破壞，甚至采用玻璃勻漿器這一手動方法所得線粒體的質(zhì)量都略優(yōu)于它，這充分說明心肌組織線粒體的提取過程中機械操作一定要柔和。IKA乳化分散儀的最高轉(zhuǎn)速雖常用于心肌組織總蛋白或總RNA提取，但并不適用于心肌組織線粒體的提取。改用低轉(zhuǎn)速是否會取得更好的結(jié)果有待于進一步研究。此外，本研究也提示，在實驗條件不足的情況下，可考慮采用玻璃勻漿器來進行勻漿。

本研究結(jié)果顯示3種方法分離線粒體的效率無明顯差異，表明乳化分散儀法和玻璃勻漿器法雖然造成線粒體超微結(jié)構(gòu)的損傷及功能受損，但并未造成線粒體數(shù)量上的明顯減少。這得益于3種方法都是在低溫環(huán)境中快速操作。低溫環(huán)境能確保線粒體膜蛋白不被組織勻漿過程中釋放的蛋白酶降解，同時快速操作有利于縮短線粒體外膜上脂類、氧化酶類和還原酶類與空氣中氧氣接觸的時間，降低氧氣等外界因素對線粒體的影響。

綜上所述，本研究結(jié)果表明心肌組織線粒體提取過程中，除注意快速、低溫外，研磨珠勻漿結(jié)合線粒體提取試劑盒、差速離心法，可以保證提取的線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)完整、功能良好。