崔 鑫，張 寧，陸 輝，于月新

北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 生殖醫(yī)學(xué)中心，遼寧 沈陽 110016

戰(zhàn)時(shí)男性泌尿生殖系統(tǒng)傷害發(fā)生率高[1-2]，骨盆個(gè)人防護(hù)裝備、護(hù)腹股溝合成內(nèi)衣、凱夫拉板等防護(hù)裝備可對泌尿生殖系統(tǒng)起到一定的保護(hù)作用[3]。當(dāng)睪丸受到破壞性損傷時(shí)，立即從精囊或殘余輸精管中收集搶救精子并進(jìn)行冷凍保存，復(fù)蘇后用于體外受精胚胎移植，可使受傷官兵獲得自己的后代[4-5]。本研究旨在探索戰(zhàn)時(shí)泌尿生殖系統(tǒng)損傷后污染精子的收集及純化方法。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 選取2019年1月1日—5月1日于北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心門診就診的500例男性志愿者為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：禁欲2～7 d，手淫取精后精液體積≥3 ml。研究對象平均年齡(25±5)歲。所有研究對象均簽署知情同意書。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 1.6%感染率污染模型制備 收集志愿者精液，隨機(jī)每10份為1組。選取自然環(huán)境中土壤、砂子、樹葉、污水、血液、灰塵，分別選取采樣點(diǎn)5處，將精液與上述污染物混合備用(污染精子原液)。前期建立1.6%感染率污染模型(200例志愿者)，從0.1%慶大霉素加入精子洗液起始，根據(jù)除菌效果，逐漸升高加入的慶大霉素濃度，找到除菌效率高的加入下限后停止?jié)舛让?。將精液?biāo)本隨機(jī)分為兩組，密度梯度法組和上游法組。

1.2.2 除雜質(zhì)沉淀污染精子中大量固體雜質(zhì) 吸取污染精子500 μl于2 ml離心管中，將含慶大霉素的精子洗液1 000 μl緩慢加于污染精子上層，避免吹起精液層，37℃恒溫箱上游30 min。

1.2.3 密度梯度法 進(jìn)一步除雜質(zhì)及死精子。將經(jīng)過1.2.2除雜質(zhì)后的上清液300 μl緩慢加入50/90密度梯度液上層，800 r/min離心15 min，吸取沉淀，計(jì)數(shù)精子密度及活力并涂板，血平板、巧克力平板37℃恒溫箱培養(yǎng)48 h。

1.2.4 上游法 進(jìn)一步除雜質(zhì)及篩選出活力高的精子。吸取經(jīng)密度梯度法處理后的精液沉淀，再次按照1.2.2除雜質(zhì)后，吸取上清、精液層計(jì)數(shù)精子密度及活力并涂板，血平板、巧克力平板37℃恒溫箱培養(yǎng)48 h。

1.2.5 2.0%感染率污染模型制備 1.6%感染率污染模型達(dá)到預(yù)期實(shí)驗(yàn)效果后建立2.0%感染率污染模型(300例志愿者)，從1.6%感染率污染模型加入慶大霉素下限起始，根據(jù)除菌效果，逐漸升高加入的慶大霉素濃度，找到除菌效率高的加入下限后停止。后續(xù)操作同1.2.2、1.2.3、1.2.4。

1.3 計(jì)數(shù)方法 吸取10 μl精子滴于精子計(jì)數(shù)板上，蓋上計(jì)數(shù)板蓋，顯微鏡下計(jì)數(shù)精子密度及精子活力(前向運(yùn)動(dòng)精子率、非前向運(yùn)動(dòng)精子率)。每份樣本計(jì)數(shù)2次，取平均值。

密度回收率=處理后精子密度/處理前精子密度×100%

活力提高率=[處理后(前向運(yùn)動(dòng)精子率+非前向運(yùn)動(dòng)精子率)-處理前(前向運(yùn)動(dòng)精子率+非前向運(yùn)動(dòng)精子率)]/處理前(前向運(yùn)動(dòng)精子率+非前向運(yùn)動(dòng)精子率)×100%

2 結(jié)果

2.1 1.6%感染率污染模型除菌及精子回收結(jié)果 污染精子原液：精子密度為95.00×106個(gè)/ml，前向運(yùn)動(dòng)精子率+非前向運(yùn)動(dòng)精子率為(34.00%+10.00%)。除雜質(zhì)后：血平板、巧克力平板均有菌落生長，但菌落數(shù)與污染精子原液涂板比較，有明顯減少趨勢；上清液中，精子密度為22.00×106個(gè)/ml，前向運(yùn)動(dòng)精子率+非前向運(yùn)動(dòng)精子率為(73.00%+18.00%)，密度回收率為23.16%，活力提高率為107.00%。密度梯度法處理后：血平板、巧克力平板均無菌落生長；沉淀中，精子密度為13.00×106個(gè)/ml，前向運(yùn)動(dòng)精子率+非前向運(yùn)動(dòng)精子率為(61.00%+22.00%)，密度回收率為13.68%，活力提高率為88.64%。上游法處理后：血平板、巧克力平板均無菌落生長；上清液中，精子密度為0.11×106個(gè)/ml，前向運(yùn)動(dòng)精子率+非前向運(yùn)動(dòng)精子率為(65.00%+11.00%)，密度回收率為0.12%，活力提高率為72.73%；沉淀中，精子密度為48.00×106個(gè)/ml，前向運(yùn)動(dòng)精子率+非前向運(yùn)動(dòng)精子率為(43.00%+8.00%)，密度回收率為50.53%，活力提高率為15.91%。因單純除雜質(zhì)無法抑制細(xì)菌生長，僅對密度梯度法和上游法對精子的回收情況進(jìn)行比較：密度梯度法處理后沉淀的密度回收率、活力提高率均高于上游法處理后上清液，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 2.0%感染率污染模型除菌及精子回收結(jié)果 污染精子原液：精子密度為96.00×106個(gè)/ml，前向運(yùn)動(dòng)精子率+非前向運(yùn)動(dòng)精子率為(38.00%+11.00%)。除雜質(zhì)后：血平板、巧克力平板均有菌落生長，但菌落數(shù)與污染精子原液涂板比較，有明顯減少趨勢；上清液中，精子密度為21.00×106個(gè)/ml，前向運(yùn)動(dòng)精子率+非前向運(yùn)動(dòng)精子率為(50.00%+3.00%)，密度回收率為21.88%，活力提高率為8.16%。密度梯度法處理后：血平板、巧克力平板均無菌落生長；沉淀中，精子密度為17.00×106個(gè)/ml，前向運(yùn)動(dòng)精子率+非前向運(yùn)動(dòng)精子率為(45.00%+5.00%)，密度回收率為17.71%，活力提高率為2.04%。上游法處理后：血平板、巧克力平板均無菌落生長；上清液中，精子密度為0.09×106個(gè)/ml，前向運(yùn)動(dòng)精子率+非前向運(yùn)動(dòng)精子率為(43.00%+3.00%)，密度回收率為0.09%，活力提高率為-6.12%；沉淀中，精子密度為71.00×106個(gè)/ml，前向運(yùn)動(dòng)精子率+非前向運(yùn)動(dòng)精子率為(43.00%+1.00%)，密度回收率為73.95%，活力提高率為-10.20%。因單純除雜質(zhì)無法抑制細(xì)菌生長，僅對密度梯度法和上游法對精子的回收情況進(jìn)行比較：密度梯度法處理后沉淀的密度回收率、活力提高率均高于上游法處理后上清液，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

利用精子庫和生殖保障車為戰(zhàn)時(shí)男性泌尿生殖系統(tǒng)損傷傷員提供緊急救治，根據(jù)傷情程度采用不同方法采集并凍存精子，可為保存男性傷員生育力提供有效保障。同時(shí)，應(yīng)對傷員進(jìn)行心理干預(yù)，通過生育指導(dǎo)、輔助生殖助孕、產(chǎn)前診斷、隨訪等一系列優(yōu)生優(yōu)育措施，為軍人提供生育保障，提高部隊(duì)官兵戰(zhàn)斗力。

目前，精子的洗滌方法主要有直接上游法、非連續(xù)密度梯度法等。Waldemar等[6]采用三次精子洗滌、病毒RNA純化及定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)純化人類免疫缺陷病毒感染者的精子以實(shí)施夫精人工授精干預(yù)。Andrea等[7]采用精子洗滌方法對人乳頭狀瘤病毒感染者進(jìn)行輔助生殖技術(shù)前的精子純化。本研究結(jié)果提示，密度梯度離心可有效去除污染精子中的污物，并保存良好的精子密度及精子活力以供輔助生殖助孕。但由于添加了抗生素，在后續(xù)的臨床使用過程中，需考慮體外受精使用者對抗生素的過敏情況。本實(shí)驗(yàn)的技術(shù)難點(diǎn)在于從傷殘的睪丸組織和殘余的精囊或輸精管中獲取精子后，立即應(yīng)用基層現(xiàn)有設(shè)備對污染精液進(jìn)行污染的快速消除。本實(shí)驗(yàn)對抗生素種類、抗生素添加比例、密度梯度離心液種類、離心時(shí)間、上游時(shí)間等過程做了梯度認(rèn)證，實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)告了抗菌成功及保證精子密度、活力的步驟，數(shù)據(jù)可為其他實(shí)驗(yàn)室提供參考。

綜上所述，慶大霉素、密度梯度離心、上游等聯(lián)合分離純化污染精子可消除細(xì)菌生長，使精子具備行輔助生殖技術(shù)的密度和活力。