過(guò)表達(dá)糖原合成酶1對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖能力的影響

黃文菲?張志海?譚慧鋒?李映梅?盧洋儀?陳嘉馨

【摘要】目的 探討糖原合成酶（GYS1）對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖能力的影響。方法 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)正常人支氣管上皮樣細(xì)胞系HBE細(xì)胞和非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系NCI-H661、NCI-H1299中GYS1 mRNA相對(duì)表達(dá)量。過(guò)表達(dá)NCI-H1299細(xì)胞的GYS1，構(gòu)建GYS1過(guò)表達(dá)細(xì)胞模型，采用MTT增殖實(shí)驗(yàn)、EdU增殖實(shí)驗(yàn)評(píng)估細(xì)胞的增殖能力，應(yīng)用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)評(píng)估細(xì)胞的克隆形成能力。結(jié)果 人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H661、NCI-H1299中GYS1 mRNA的表達(dá)水平高于人正常支氣管上皮樣細(xì)胞HBE的表達(dá)水平（P均< 0.001）。NCI-H1299-GYS1過(guò)表達(dá)細(xì)胞的GYS1 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均上調(diào)（P均< 0.001）。過(guò)表達(dá)GYS1促進(jìn)了NCI-H1299細(xì)胞的增殖和克隆形成（P均< 0.001）。結(jié)論 GYS1在非小細(xì)胞肺癌中高表達(dá)，過(guò)表達(dá)GYS1促進(jìn)了非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖。

【關(guān)鍵詞】非小細(xì)胞肺癌;糖原合成酶1;增殖

Effect of overexpression of glycogen synthase 1 on the proliferation of non-small cell lung cancer cells Huang Wenfei， Zhang Zhihai， Tan Huifeng， Li Yingmei， Lu Yangyi， Chen Jiaxin. Department of Respiratory， Nanhai Hospital of Guangdong Provincial Peoples Hospital， Foshan 528200， China

Corresponding author， Chen Jiaxin， E-mail： jxchenmd@ 163. com

【Abstract】Objective To evaluate the effect of glycogen synthase 1 （GYS1） on the proliferation of non-small cell lung cancer cells. Methods The relative expression levels of GYS1 mRNA in normal human bronchial epithelial cell line HBE cells， non-small cell lung cancer cell lines NCI-H661 and NCI-H1299 were quantitatively detected by quantitative real-time fluorescence PCR （qRT-PCR）. The NCI-H1299 cells overexpressing GYS1 were utilized to establish the GYS1 overexpression cell model. MTT assay and EdU proliferation experiment were adopted to evaluate the cell proliferation ability， and plate clone formation assay was employed to assess the cell clone formation ability. Results The expression levels of GYS1 mRNA in human non-small cell lung cancer cells NCI-H661 and NCI-H1299 were significantly higher than that in normal human bronchial epithelial cell HBE （both P < 0.001）. The relative expression levels of GYS1 mRNA and protein were significantly up-regulated in the NCI-H1299-GYS1 overexpressing cells （both P < 0.001）. Overexpression of GYS1 remarkably promoted the proliferation and clone formation of NCI-H1299 cells （both P < 0.001）. Conclusions GYS1 is highly expressed in non-small cell lung cancer. Overexpression of GYS1 promotes the proliferation of non-small cell lung cancer cells.

【Key words】Non-small cell lung cancer;Glycogen synthase 1;Proliferation

肺癌是人類(lèi)健康的主要威脅之一，據(jù)估計(jì)2018年全球肺癌死亡人數(shù)達(dá)到180萬(wàn)[1]。肺癌的病理學(xué)類(lèi)型常見(jiàn)非小細(xì)胞肺癌和小細(xì)胞肺癌。85%的肺癌為非小細(xì)胞肺癌，大多數(shù)患者在發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于中晚期，失去了手術(shù)機(jī)會(huì)[2]。非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)基因的深入研究，對(duì)患者和臨床醫(yī)師而言具有重要的意義。

代謝紊亂是許多腫瘤的特征。腫瘤對(duì)其代謝產(chǎn)物進(jìn)行重新編程，以產(chǎn)生足夠的能量維持生存。糖原主要儲(chǔ)存在肌肉和肝臟中，在需要時(shí)作為能量供應(yīng)。然而，非小細(xì)胞肺癌糖原代謝的改變及其分子機(jī)制仍然有待于進(jìn)一步研究。糖原合成的關(guān)鍵酶之一糖原合成酶（GYS）包括2種亞型，即GYS1和GYS2。GYS1通常在肌肉、肺、心臟和腎臟中表達(dá)，而GYS2主要局限于肝臟[3]。研究表明，GYS1在缺氧條件下被迅速誘導(dǎo)，并與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、乳腺癌和結(jié)腸癌細(xì)胞系中的糖原積累呈正相關(guān)[4]。GYS1的異常表達(dá)不僅降低了細(xì)胞糖酵解，而且增加了糖原反應(yīng)性AMP激酶的激活，導(dǎo)致髓系白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制[5]。然而，GYS1在非小細(xì)胞肺癌中的作用尚不明確，仍然有待于進(jìn)一步研究。本研究旨在闡明GYS1在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞糖原代謝和增殖中的作用。

材料與方法

一、主要材料

正常人支氣管上皮樣細(xì)胞系HBE和人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系NCI-H661、NCI-H1299購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。主要試劑包括青霉素-鏈霉素雙抗（HyClone， 美國(guó)），Opti-MEM培養(yǎng)基（Thermo Fisher Scientific， 美國(guó)），Lipofectamine 3000 （Lip 3000，Invitrogen， 美國(guó)），MTT（碧云天，中國(guó)），DMEM培養(yǎng)基（Gibco， 美國(guó)）;TRIzol試劑（BIOO Scientific， 美國(guó)），逆轉(zhuǎn)錄試劑（維諾贊， 中國(guó)），定量PCR試劑（Takara， 中國(guó)），RIPA裂解液（碧云天， 中國(guó)），二喹啉甲酸（BCA）試劑盒（碧云天， 中國(guó)）;GYS1抗體（1∶1000， CST， 美國(guó)）;β-actin抗體（1∶2000， Santa Cruz Biotechnology， 美國(guó)）。

二、方 法

1. 細(xì)胞培養(yǎng)

HBE正常人支氣管上皮樣細(xì)胞和NCI-H661、NCI-H1299人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞采用含胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)基（1∶9）進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)基中均含有100 μg/ml的鏈霉素和青霉素。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞培養(yǎng)箱條件設(shè)置為37℃、5% CO2。

2. 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒的NCI-H1299細(xì)胞為Vector組，轉(zhuǎn)染GYS1重組質(zhì)粒的NCI-H1299細(xì)胞為GYS1組;細(xì)胞轉(zhuǎn)染的前1日，常規(guī)消化細(xì)胞并收集，離心洗滌1遍，制成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后接種于24孔板（Corning， 美國(guó)）中，每孔細(xì)胞數(shù)1×105個(gè);細(xì)胞轉(zhuǎn)染當(dāng)日，取Opti-MEM轉(zhuǎn)染專(zhuān)用培養(yǎng)基稀釋質(zhì)粒，移液槍吹打;加入Lip 3000，應(yīng)用移液槍輕輕吹打，等待20 min;取Lip 3000在Opti-MEM中稀釋?zhuān)埔簶屳p輕吹打;取出前1日鋪板的細(xì)胞，將混合液加入對(duì)應(yīng)各孔中，“8”字搖晃混勻;37℃、5% CO2培養(yǎng)條件繼續(xù)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，48 h后檢測(cè)GYS1 mRNA的表達(dá)，72 h后檢測(cè)GYS1蛋白的表達(dá)。

3. 實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（qRT-PCR）檢測(cè)

應(yīng)用TRIzol RNA提取試劑從GYS1過(guò)表達(dá)組和Vector組細(xì)胞中獲取總RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄、qRT-PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)水平。反應(yīng)體系包括5 μl的SYBR premix（2倍稀釋?zhuān)? μl的cDNA模板、1 μl的混合引物（上下游引物提前混合，減少上樣誤差）、2 μl的DEPC水，震蕩混勻。反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性30 s，然后60℃退火20 s，40個(gè)循環(huán)，72℃延伸30 s。β-actin上游引物序列5-GAAGCTAAGTCCTGCCCTCA-3，下游引物序列5-CAGTGAGGACCCTGGATGTG-3，qRT-PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為305 bp;GYS1上游引物序列5-C AGCGCGGACCAACAATTTC-3，下游引物序列5-TCCTCCCGAACTTTTCCTTCA-3，qRT-PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為3474 bp。用2-△△Ct法分析基因的相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

4. 蛋白免疫印跡法檢測(cè)

首先用預(yù)冷磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌Vector組和GYS1過(guò)表達(dá)組細(xì)胞1次，向6孔板中加入200 μl RIPA裂解液裂解細(xì)胞20 min，使裂解液充分接觸細(xì)胞，每10 min搖勻1次;蛋白濃度測(cè)定應(yīng)用BCA法;按比例加載樣緩沖液金屬浴95℃蛋白變性5 min;SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì);0.22 μm PVDF膜轉(zhuǎn)膜;5%牛奶封閉1 h;

雙蒸水清洗膜;加入一抗抗體（GYS1， 1∶1000;β-actin， 1∶2000）4℃過(guò)夜（最少16 h）;次日TBST洗膜液洗滌3遍，每次8 min;棄掉TBST洗膜液，加入二抗，室溫孵育1 h;TBST洗膜液洗滌3次，每次8 min;電化學(xué)發(fā)光（ECL）法曝光成像;結(jié)果用Gelpro軟件進(jìn)行分析。

5. MTT檢測(cè)

使用二甲基亞砜（DMSO）溶解MTT粉末配成終濃度為5 mg/ml的MTT溶液，-20℃避光保存，使用時(shí)室溫溶解。取GYS1過(guò)表達(dá)組和對(duì)照（Vector）組細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，96孔板鋪板，每孔加入5×103個(gè)細(xì)胞，每組4個(gè)復(fù)孔;周?chē)蝗覲BS;然后分別于檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)（24、48、72、96 h），取出96孔板，每孔加入10 μl的MTT工作液，培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h;然后每孔加入100 μl的Formazan溶液溶解;在570 nm處測(cè)定吸光度（OD值）。

6. EdU增殖實(shí)驗(yàn)

按照說(shuō)明書(shū)采用EdU法檢測(cè)細(xì)胞增殖。細(xì)胞置于24孔板中培養(yǎng)24 h，加入100 μl EdU，用DAPI染色細(xì)胞核。熒光顯微鏡拍照并計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

7. 克隆形成實(shí)驗(yàn)

取Vector組和GYS1過(guò)表達(dá)組的細(xì)胞以1×103個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種于6孔板;繼續(xù)培養(yǎng)7 ～ 14 d;多聚甲醛固定后結(jié)晶紫染色;用自來(lái)水洗滌細(xì)胞，拍照并計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和制圖，計(jì)量資料采用表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，NCI-H661、NCI-H1299的GYS1 mRNA相對(duì)表達(dá)量與HBE細(xì)胞間GYS1 mRNA的比較先采用單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義后采用Dunnet-t檢驗(yàn)。P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、GYS1在人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中的表達(dá)

qRT-PCR檢測(cè)了正常人支氣管上皮樣細(xì)胞系HBE和非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系NCI-H661、NCI-H1299中GYS1 mRNA相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示3種細(xì)胞中GYSI mRNA相對(duì)表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F = 923.11，P < 0.001），其中NCI-H661（Dunnet-t = 25.17，P < 0.001）、NCI-H1299（Dunnet-t = 43.73，P < 0.001）的GYS1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于HBE細(xì)胞，見(jiàn)圖1。

二、GYS1過(guò)表達(dá)對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI- H1299增殖的影響

相比NCI-H661細(xì)胞，GYS1 mRNA在NCI-H1299細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量較低，因此本研究選擇過(guò)表達(dá)NCI-H1299細(xì)胞的GYS1，研究NCI-H1299細(xì)胞的變化。結(jié)果顯示，與Vector組相比，NCI-H1299-GYS1過(guò)表達(dá)組細(xì)胞的GYS1 mRNA（t = 20.62，P < 0.001）和蛋白（t = 41.27，P < 0.001）相對(duì)表達(dá)量上調(diào)，見(jiàn)圖2。成功構(gòu)建NCI-H1299-GYS1過(guò)表達(dá)細(xì)胞模型后，MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)GYS1對(duì)于NCI-H1299細(xì)胞增殖能力影響的結(jié)果顯示，細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，GYS1過(guò)表達(dá)組的OD值大于Vector組的OD值（t = 11.56，P < 0.001），24 h和48 h的結(jié)果比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均> 0.05），見(jiàn)圖3。進(jìn)一步通過(guò)EdU增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)GYS1對(duì)于NCI-H1299細(xì)胞增殖能力的影響，結(jié)果顯示GYS1過(guò)表達(dá)組EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)多于Vector組的EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（t = 18.59，P < 0.001），見(jiàn)圖4。以上結(jié)果提示GYS1過(guò)表達(dá)后，NCI-H1299細(xì)胞的增殖能力有所增加。

三、GYS1過(guò)表達(dá)促進(jìn)了NCI-H1299細(xì)胞的克隆形成

平板集落形成實(shí)驗(yàn)觀察NCI-H1299細(xì)胞在過(guò)表達(dá)GYS1前后克隆形成能力的變化，結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)GYS1后，NCI-H1299細(xì)胞克隆形成能力有所增加（t = 18.59，P < 0.001），見(jiàn)圖5。

討論

GYS1是糖原合成最后一步的關(guān)鍵酶。GYS1突變與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，已知GYS1缺乏可導(dǎo)致糖原貯積和細(xì)胞異常。GYS1的過(guò)度表達(dá)與急性髓細(xì)胞白血病和非小細(xì)胞肺癌的不良預(yù)后相關(guān)[6-7]。然而，我們?nèi)匀蝗狈ψ銐虻淖C據(jù)證明GYS1是否是癌癥的一個(gè)關(guān)鍵潛在標(biāo)志。由于非小細(xì)胞肺癌是肺癌最常見(jiàn)的亞型，預(yù)后較差，因此有必要對(duì)GYS1進(jìn)行研究。

研究表明糖原在癌細(xì)胞存活中起著關(guān)鍵作用。例如，抑制糖原分解可誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡，乳腺癌、腎癌和卵巢癌細(xì)胞系中的糖原含量與增殖呈負(fù)相關(guān)。代謝重編程與腫瘤的發(fā)展和進(jìn)展有關(guān)，甚至使腫瘤易受化學(xué)治療的影響[8-9]。值得注意的是，在重新連接葡萄糖代謝的過(guò)程中，癌細(xì)胞的化學(xué)治療或放射治療抵抗力也發(fā)生了相應(yīng)的變化[9]。與此一致，GYS1與急性髓系白血病的不良預(yù)后有關(guān)[6]。

本研究顯示，GYS1在人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的表達(dá)水平高于正常人支氣管上皮樣細(xì)胞，提示GYS1在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮重要的作用。后續(xù)細(xì)胞功能研究結(jié)果顯示，GYS1促進(jìn)了NCI-H1299細(xì)胞的增殖。Chen等[10]發(fā)現(xiàn)，GYS1過(guò)度表達(dá)促進(jìn)了腎透明細(xì)胞癌的增殖，是腎透明細(xì)胞癌不良預(yù)后因素。

綜上所述， GYS1在人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的表達(dá)水平高于正常人支氣管上皮樣細(xì)胞，且GYS1促進(jìn)了NCI-H1299細(xì)胞的增殖，揭示了GYS1可能是非小細(xì)胞肺癌的潛在藥物靶點(diǎn)。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2021-02-07）

（本文編輯：林燕薇）